Antikörper-konjugierte Nanopartikel-basierte Quantifizierung mittels Dunkelfeldmikroskopie: Ein Verfahren zur Erfassung und Quantifizierung spezifischer Exosomen aus Körperflüssigkeiten

Exosomen sind kleine, membranumschlossene Strukturen, die von den Zellen in den extrazellulären Raum sezerniert werden. Exosomen sind in Bioflüssigkeiten reichlich vorhanden.

Um spezifische Exosomen aus Körperflüssigkeiten zu identifizieren und zu erfassen, beginnen Sie mit der Entnahme eines Multi-Well-Immunoassay-Objektträgers. Dieser Objektträger ist mit Proteinen funktionalisiert, die als Antigene fungieren und an spezifische Antikörper binden.

Ergänzen Sie den Objektträger mit der gewünschten Primärantikörperlösung und inkubieren Sie. Diese Antikörper binden an die vorbeschichteten Antigene auf der Objektträgeroberfläche.

Aspirieren Sie die restliche Lösung, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Fügen Sie nun einen Blockierungspuffer hinzu, der die freien Antigene blockiert und so die unspezifische Bindung von Exosomen verhindert.

Entfernen Sie dann den Blockierungspuffer, laden Sie die Exosomen mit der Serumsuspension auf den Objektträger und inkubieren Sie. Dies ermöglicht die exklusive Bindung von zielspezifischen Exosomen an die eingefangenen Primärantikörper.

Laden Sie als Nächstes eine Suspension von konjugierten Sekundärantikörpern mit Goldnanopartikeln auf die Objektträgeroberfläche. Diese Antikörper binden an die vorgebundenen Exosomen und bilden einen Detektionskomplex.

Entsorgen Sie abschließend mit einer Pipette alle ungebundenen Sekundärantikörper. Visualisieren Sie die Objektträger unter einem Dunkelfeldmikroskop. Goldnanopartikel, die auf der Oberfläche von Exosomen vorhanden sind, streuen das Licht und erscheinen als helle Flecken auf dem dunklen Hintergrund.

Um mit der Vorbereitung des Objektträgers zu beginnen, verdünnen Sie die gewünschten Exosomen-Capture-Antikörper auf 0,025 Milligramm pro Milliliter in PBS. Pipettieren Sie 1 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung eines mit Protein A/G behandelten Objektträgers, der mit optischem Glas hinterlegt ist. Übertragen Sie dann den Objektträger in eine Befeuchtungsbox, um sicherzustellen, dass die Vertiefungen während der Inkubation nicht austrocknen.

Inkubieren Sie den Objektträger 1 Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um die Einfangantikörper zu immobilisieren. Aspirieren Sie dann die restliche Lösung, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Waschen Sie die Vertiefungen, indem Sie dreimal 1 Mikroliter PBS hinzufügen und aspirieren. Befüllen Sie anschließend jede Vertiefung schnell mit 1 Mikroliter PBS-basiertem Blockierungspuffer und inkubieren Sie den Objektträger 2 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Wenn wir etwa 15 Proben verarbeiten, müssen wir eine Einkanalpipette verwenden, um den Arbeitspuffer in weniger als 5 Minuten auf 120 Vertiefungen zu laden, um das Verdampfen des Blockiermittels zu vermeiden.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Lösung aus Antikörper-konjugierten Gold-Nanostäbchen während des Objektträger-Blockings. Tauen Sie Plasma- oder Serumproben etwa 30 Minuten vor dem Blockieren schnell in einem Wasserbad bei Raumtemperatur auf. Die aufgetauten Proben werden 30 Sekunden lang vorläufig, um sicherzustellen, dass die Suspensionen homogen sind. Zentrifugieren Sie dann die Proben 15 Minuten lang bei 500 x g, um Proteinaggregate und andere Rückstände auszufällen.

10 Mikroliter Aliquots der Überstände werden in frische Röhrchen überführt und Eins-zu-Eins-Verdünnungen mit PBS vorgenommen. Mischen Sie die verdünnten Proben durch sanftes Vortexen oder Inversion. Wenn die Schiebeblockung abgeschlossen ist, saugen Sie den Blockierungspuffer an und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 1-Mikroliter-Portionen PBS. Laden Sie die Proben sofort mit 1 Mikroliter pro Vertiefung und 8 Replikaten pro Probe in die Vertiefungen.

Laden Sie Exosomenstandards auf die gleiche Weise in die entsprechenden Vertiefungen. Inkubieren Sie den Objektträger 12 bis 18 Stunden lang im Kühlschrank bei 4 Grad Celsius. Saugen Sie dann die Vertiefungen an und waschen Sie jede Vertiefung einmal mit 1 Mikroliter PBS. Laden Sie 1 Mikroliter der antikörperkonjugierten Gold-Nanostäbchen-Suspension in jede Vertiefung und inkubieren Sie den Objektträger 2 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Anschließend die Nanostäbchensuspension aspirieren und den Objektträger in PBS, ergänzt mit 0,01 % Polysorbat-20, 10 Minuten lang mit einem Mischer waschen. Saugen Sie dann die Vertiefungen an und waschen Sie den Objektträger 10 Minuten lang in entionisiertem Wasser auf einem rotierenden Mischer. Entfernen Sie das Wasser und lassen Sie den Objektträger in einer sauberen Petrischale an der Luft trocknen, bevor Sie den Objektträger zum Dunkelfeldmikroskop bringen.