Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, festzustellen, ob Zellen und biologische Flüssigkeit von Interesse RNA freisetzen oder RNA enthalten, die Exosomen enthält. Der erste Schritt zur Isolierung von Exosomen besteht darin, Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Anschließend wird das Supernat filtriert, um größere Partikel zu entfernen.

In einem zweiten Schritt werden die Exosomen dann durch Ultrazentrifugation pelletiert. Die Exosomen werden durch Elektronenmikroskopie, Durchflusszytometrie und westliche Blutanalyse charakterisiert, um zu zeigen, dass die isolierten Vesikel die Morphologie, Größe und Proteinzusammensetzung von Exosomen aufweisen. Als nächstes wird die RNA aus den gereinigten Exosomen isoliert.

Um zu bestimmen, welche RNA, die Exosomen enthalten, können die Ergebnisse, die mit diesen etablierten Methoden zur Aufreinigung, Detektion und Charakterisierung von Exosomen erzielt werden, weitere Untersuchungen von Exosomen, wie z. B. ihre biologischen Funktionen, erleichtern. Diese Präsentation zeigt Ihnen, wie Exosomen mit verschiedenen Mitteln isoliert werden können, und die beiden Personen, die das vorstellen werden, sind meine beiden Doktorandinnen Maria, El und Cecelia. Viel Glück.

Die humane Massenzelllinie HC one wird für diese Demonstration der Exosomenisolierung verwendet, um das Verfahren zur Isolierung von Exosomen zu beginnen. Züchten Sie zunächst Zellen in Medium mit exosomenfreiem Serum. Dann die Zellsuspension in konische Röhrchen überführen und bei 300 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Um die Zellen zu pelletieren, übertragen Sie den Supernamen auf Ultra-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Probe bei 16.500 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, um Zellen und Zelltrümmer weiter zu entfernen. Filtern Sie anschließend das SANE durch einen 0,2-Mikron-Filter, um Partikel, die größer als 200 Nanometer sind, weiter zu entfernen. Schließlich werden die Ultrazentrifugenröhrchen, die das filtrierte Sand enthalten, 70 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit einer Ultrazentrifuge bei 120.000 G versiegelt, um die Exosomen zu pelletieren.

Die Exosomen werden entnommen, indem das Ultrazentrifugenröhrchen aufgeschnitten, die Schlinge verworfen und das mit Exosomen angereicherte Pellet suspendiert wird. Für maximale Exosomen-Entnahme. Resus suspendieren Sie das mit Exosom angereicherte Pellet wiederholt in einem kleinen Volumen eines geeigneten Puffers in ein Eend-Orph-Röhrchen.

Zweimal mit zusätzlichem Puffer mit dem gleichen Volumen wie zuvor spülen. Der Puffer hängt von der Art der Experimente ab, die dem Exosom folgen. Isolation. Für die Elektronenmikroskopie verwenden Sie ca. 10 Mikrogramm exosomales Protein aus den intakten Exosomen.

Resuspendiert in PBS aufgeführt. Unsere kohlenstoffbeschichtete Nickelgitter-Elektronenmikroskopie kann ohne Immunfärbung durchgeführt werden, da Exosomen ausschließlich anhand der Größenmorphologie identifiziert werden können. Es wird jedoch empfohlen, einen primären Antikörper wie Anti-CD 63 oder Anti-MHC Klasse zwei zu verwenden, gefolgt von 10 Nanometer goldmarkierten Sekundärantikörpern.

Da Exosomen zu klein sind, um mit aktuellen Durchflusszytometriegeräten nachgewiesen werden zu können, ist es notwendig, die Exosomen zunächst an Antikörper-beschichtete Kügelchen zu binden. Je nach exosomal-zellulärem Ursprung werden unterschiedliche Antikörper an magnetische oder Latexkügelchen gekoppelt. In dieser Demonstration werden für jede Probe die anti CD 63 beschichteten Latexkügelchen verwendet.

Verwenden Sie ein Volumen von 30 bis 40 Mikrogramm exosomalem Protein des intakten Exosoms. In PBS suspendiert, inkubieren Exosomen in Kügelchen über Nacht bei vier Grad Celsius unter sanfter Bewegung. Am nächsten Tag werden 300 Mikroliter 200 millimolares Glycin zugegeben und 30 Minuten lang inkubiert.

Waschen Sie den Exosomen-Bead-Komplex zweimal und inkubieren Sie die Exosomen-Bead-Komplexe mit 50 Mikrolitern IgG-Antikörper bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Exosomenperlenkomplexe zweimal, fügen Sie 90 Mikroliter, Waschpuffer und 10 Mikroliter Antikörper Ihrer Wahl zu den Exomperlenkomplexen hinzu und inkubieren Sie 40 Minuten lang im Dunkeln. Waschen Sie die Exomperlenkomplexe unter sanfter Bewegung zweimal, fügen Sie 300 Mikroliter Waschpuffer hinzu und übertragen Sie die Proben in Durchflusszytometrieröhrchen und erfassen Sie Daten mit Hilfe der Durchflusszytometrie.

Diese Western-Blot-Demonstration konzentriert sich auf die Bedeutung einer geeigneten Proteinisolierung vor dem Western Blot und die verschiedenen verwendeten Antikörper. Das Exosomenpellet wird in dem Proteinlyse-Puff der Wahl aufgelöst und gründlich pipettiert, gefolgt von einem Vortex-Mischen zu den Exosomen, die Probe in einem Wasserbad beschallt, die Probe fünf Minuten lang 13.000 Mal G zentrifugiert und das SANE in ein neues Einor-Röhrchen überführt. Messen Sie das Gesamtprotein mit einer Methode Ihrer Wahl und laden Sie das Protein auf das Gel.

Trennen und übertragen Sie dann die Proteine durch Gelelektrophorese und Elektroblotting, blockieren und waschen Sie die Membran, bevor Sie eine Immunfärbung gegen Proteine durchführen, die mit Exosomen angereichert sind, da es keine exosomspezifischen Marker gibt. Proteine, die mit Exosomen unterschiedlicher zellulärer Herkunft angereichert sind, werden häufig für den Nachweis von Exosomen verwendet. Dabei handelt es sich um Proteine wie Tetraspanine, zum Beispiel CD neun, CD 63 und CD 81.

Zytoskelett-assoziierte Proteine wie Ezrin und Proteine, die an der multivesikulären Biogenese beteiligt sind, wie TSG 1, 0, 1 und LY als Negativkontrollkontrolle für kontaminierende Proteine, die häufig in Vesikeln aus anderen Kompartimenten vorkommen, wie z. B. Kexin und GRP 78 aus dem endoplasmatischen Retikulum. Je nach geplanten Experimenten können unterschiedliche RNA-Isolationskits verwendet werden. In dieser Demonstration wird eine säulenbasierte Methode bei der Durchführung der RNA-Isolierung verwendet.

Es ist wichtig, Nukleinsäure- und nukleasefreie Pipettenspitzen zu verwenden und sowohl den Tisch als auch das Gerät von Verunreinigungen und RNAs zu befreien. Lösen Sie das Exosom-Pellet in 350 Mikrolitern Lyselösung auf und wirbeln Sie die Probe vortexen. Fügen Sie 200 Mikroliter 95%iges Ethanol hinzu und mischen Sie es mit einem Wirbel.

Legen Sie eine Säule in ein Sammelröhrchen und übertragen Sie die lysierten Exosomen in die Säule und zentrifugieren Sie sie dreimal in 400 Mikrolitern Waschlösung, um sicherzustellen, dass die Säule trocken ist. Zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 14.000 mal G nach dem letzten Waschen und legen Sie die trockene Säule in eine RNA-freie Eend-RPH-Röhrchen-Elue. Die RNA in 50 Mikrolitern elucianischem Puffer zum Nachweis und zur Analyse der extrahierten gesamten exosomalen RNA.

Ein Agilent 2100 Bioanalysator kann mit dem RNA 6.000 Nano- oder RNA 6.000 Pico-Kit verwendet werden, da die Exosomen zu klein sind, um mit den verfügbaren Durchflusszytometriemethoden nachgewiesen zu werden. Sie werden an Antikörper-beschichtete Kügelchen gebunden, bevor sie analysiert werden. Da diese Exosomenbead-Komplexe eine Durchflusszytometrie aggregieren können, kann das Scatterplot verschiedene Populationen von einfachen, doppelten und dreifachen Exosomenbead-Komplexen enthalten.

Wie hier gezeigt, zeigt der Pfeil die Population der einzelnen Exosomenperlenkomplexe an, d. h. die Population, die weiter analysiert wird. Ein durchflusszytometrisches Histogramm zeigt eine einzelne Exosomen-Population, die positiv für das CD 63-Protein ist. Je weiter rechts die offene Kurve liegt, desto positiver ist die Stichprobe für CD 63.

Aufgrund der geringen Größe von Exosomen können sie nur mit Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht werden. Typische morphologische Merkmale von Exosomen sind runde, 30 bis 100 Nanometer große Vesikel. Eine Exosomen-Immunfärbung mit goldliberalem Antikörper für CD 63 ist durch den Arrow Western Blot angedeutet.

Die Ergebnisse zeigen das Fehlen des endoplasmatischen Retikulumproteins Calnexin in der exo-omalen Probe, zeigen jedoch das Vorhandensein des Tetraspans in CD 81, einem Protein, das häufig in Exosomen angereichert ist. Zelluläre RNA enthält hauptsächlich ribosomale RNA, die in dieser Bioanalyseanalyse als die beiden Peaks für die 18 s ribosomale RNA-Untereinheit links und die 28 s Untereinheit rechts zu sehen sind. Exosomale RNAs unterscheiden sich jedoch in ihren Profilen, da sie wenig oder keine ribosomale RNA enthalten und kurz gesagt, RNA wie Boten-, RNA- und Mikro-RNA einmal beherrscht werden.

Die Isolierung von kann in etwa drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei der Anwendung dieser Methode ist es wichtig, alle Schritte durchzuführen, einschließlich des Nicht-Einreichens, um eine Kontamination durch größere ICs zu vermeiden. Nach der Entwicklung dieser Technik ist es viel einfacher geworden, Exosomen sowohl biochemisch als auch biologisch zu charakterisieren.

Darüber hinaus haben wir viel mehr über die Exosomen-vermittelte Zell-zu-Zell-Kommunikation in verschiedenen Systemen gelernt. Außerdem hat die Technik es ermöglicht, Exosomen als Biomarker für verschiedene Krankheiten zu entwickeln. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit.