Name: Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Erfahren Sie die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie mit Quantum-Dot-Nanopartikeln für Immunzytochemie und Pathologie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Proteinlokalisation in menschlichem Tumorgewebe mit hoher Präzision.

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Die Autoren danken Xiao Juan Wu (Immunhistochemisches Labor) und der Abteilung für Anatomische Pathologie, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australien.

1. Die Gewebe Dissection und Fixation <ol><li> Tissue Dissection <ol><li> Präparieren Gewebestücke aus einem chirurgisch reseziert Tumorprobe oder Gewebebiopsie. Hinweis: Das Gewebe in dieser Studie verwendet wurde routinemäßig in Formalin fixiert, aber frisches Gewebe ist ebenfalls geeignet. Wir wählten eine Fläche von einem anatomischen Pathologe bestätigt und berichtet Somatostatinom Tumor nach histologischen Routinefärbung und Anti-Somatostatin Immunfärbung (nicht gezeigt) enthalten. </li><li> Verwenden Sie Gewebestücke nicht größer als etwa 1,0 mm 3. </li></ol></li><li> Cacodylatpuffer Vorbereitung <ol><li> Vorbereitung einer Stammpufferlösung (1 M) durch Zugabe von 21,4 g Natriumcacodylat (siehe Materialliste) und 3,0 ml 1% ige Calciumchloridlösung zu 90 ml destilliertem Wasser und danach Auffüllen der Lösung auf ein Endvolumen von 100 ml. Rühren Sie die Lösung und lassen Sie es über Nacht stehen, so dass das kristalline Reagenz vollständig auflöst. </li><li&gt; Bereiten Sie einen Puffer durch Zugabe von 20 ml der Stammlösung auf 170 ml Wasser und dann die Überprüfung der pH-Wert mit Indikatorstreifen Arbeitslösung. Den pH-Wert auf 7,4 durch Zugabe von 3 bis 4 Tropfen 3% HCl. Füllen Sie die Lösung auf ein Gesamtvolumen von 200 ml mit Endmolarität von 0,1 M. </li></ol></li><li> Fixative Herstellung und Verwendung <ol><li> In einem 10 ml-Ampulle von 50% Glutaraldehyd-Lösung zu 20 ml Natriumcacodylat Stammlösung (1 M). Füllen Sie mit destilliertem Wasser auf 190 ml. Den pH-Wert einzustellen und auf 7,4 durch Zugabe von 1 bis 4 Tropfen 3% ige Salzsäure (HCl), falls erforderlich. </li><li> Füllen Sie mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 200 ml zu erhalten. </li><li> Eintauchen des Gewebes in Fixiermittel 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumkakodylat - Puffer pH 7,4 für 24 h bei 4 ° C in einer Glasprobenröhrchens enthält. Nicht verwendete Fixiermittel nach 1 Woche. </li></ol></li></ol> 2. Gewebeverarbeitung und Embedding <ol><li> Osmium TetroXide Anfärben <ol><li> Nach der Fixierung abgeschlossen ist, tauchen für weitere 20 Minuten in das Gewebe in Natriumcacodylatpuffer (0,1 M) für 20 min dann wiederholen. </li><li> Bereiten Sie eine 2% ige wässrige Osmiumtetroxid (OsO 4) Arbeitslösung von 8,0 ml einer 5% OsO 4 Stammlösung zu 2,0 ml Natriumcacodylatpuffer Stammlösung (1 M) und 10,0 ml destilliertem Wasser zugegeben wird ein endgültiges Volumen zu machen 20,0 ml. </li><li> Entfernen der Puffer dann das Gewebe in 2% OsO 4 tauchen bei pH 7,4 für 4 Stunden bei Raumtemperatur. ACHTUNG! Seien Sie vorsichtig beim Umfüllen und OsO 4 Herstellung von Lösungen, tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und Arbeit in einem Abzug zu allen Zeiten. </li></ol></li><li> Uranylacetat Anfärben <ol><li> Nach Gewebe osmication abgeschlossen ist, die OsO 4 -Lösung zu entfernen und für 10 min Gewebe in 2% Natriumacetat eintauchen. Entfernen Sie die 2% Natriumacetat dann in 2% Uranylacetat für 1 Stunde tauchen aufZimmertemperatur. </li></ol></li><li> Entwässerung <ol><li> Entwässern Gewebe durch abgestufte Alkohole. Verwenden 50% Ethanol für 10 Minuten, 70% Ethanol für 10 min, 95% Ethanol für 10 min und zwei Wechsel von 100% Ethanol für jeweils 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Führen Sie zwei Änderungen von 100% Aceton für jeweils 30 min. </li></ol></li><li> Harzimprägnierung und Härtung <ol><li> Mischen Sie mit niedriger Viskosität Epoxidharz in einem Einweg-Polyethylenbecher. Hinzufügen, 10,0 g Vinylcyclohexendioxid (ERL 4221) Epoxymonomer, 6 g Diglycidylether von Polypropylenglykol (DER 732) und 26,0 g Nonenyl Bernsteinsäureanhydrid (NSA). Rühren Sie gründlich von Hand mit Holzstäbchen für 2 min. </li><li> In fünfzehn Tropfen 2-Dimethylaminoethanol (DMAE) Epoxy-Beschleuniger und rühren Sie wieder für 2 min. Achten Sie darauf, in vollem Umfang die ERL, DER und NSA Komponenten mischen, bevor die DMAE-Beschleuniger Zugabe. </li><li> Beginnen Harzimprägnierung des Gewebes durch Austauschen 100% Aceton mit 1: 1 Harz zu1 Harz zu Aceton für 3 Stunden und schließlich 100% über Nacht Harz: Aceton für 1 Stunde, dann mit 6 ersetzen. </li><li> Übertragen Sie das Gewebe in frischem Harz in 8 mm micromoulds. Heilung bei 70 ° C über Nacht. Harz sollte hart sein, aber nicht spröde nach der Aushärtung. </li></ol></li></ol> 3. Ultramikrotomie <ol><li> Messer, Schneidparameter und Abschnitt Stärke <ol><li> Legen Sie ein Semidünndiamantmesser in der Ultramikrotom und Zuschnitte aus dem Gewebe mit einer Dicke von 500 nm. </li><li> Float Abschnitte auf dem Wasserbad hinter der Messerkante. Pick - up die Abschnitte auf einem Glasträger und trocknen Sie sie nach unten für 10 bis 20 Sekunden unter Verwendung einer Heizplatte bei etwa 110 o C </li><li> Etch die Abschnitte mit Natriumethylat-Lösung für 20 Sekunden und dann mit 100% Ethanol dann destilliertes Wasser abwaschen. Stain mit 2% Methylenblau in 1% Borax für 20 Sekunden auf der Heizplatte, Spülen mit Leitungswasser für 5 Sekunden und trocken auf der Heizplatte 5 Sekunden läuft. Dann stain mit 1,5% Basisfuchsinlösung auf der Heizplatte für 5 Sekunden dann trocken auf der Heizplatte für 20 Sekunden. </li><li> Untersuchen von Hellfeld-Lichtmikroskopie und bestätigen, dass Tumorzellen und eine Region of Interest (ROI) sind in dem Abschnitt. </li><li> Ändern Sie den Semidünndiamantmesser zu einer ultradünnen Diamantmesser und stellen Sie die richtige Messerwinkel und Schnittgeschwindigkeit, wie durch die Messerhersteller empfohlen. </li><li> Schneiden Sie ultradünne Schnitte bei 90 nm Dicke. Beachten Sie die Goldfärbung der Abschnitte, wenn sie auf dem Wasserbad schwimmen. </li><li> Dehnen und glätten die Abschnitte durch Winken Chloroform Dampf aus einem 1 cm 2 Stück Filterpapier innerhalb von wenigen Millimetern der Abschnitte. Achten Sie darauf, nicht das Chloroform getränkten Papier in Kontakt mit der Wasseroberfläche zu bringen. </li></ol></li><li> Ultradünnes Abschnitt Grid Montage <ol><li> Heben Sie die ultradünne Schnitte von der Wasseroberfläche bis unter Verwendung eines 300-Mesh-Dünn bar Nickel TEM-Gitter, die in Abschnitt Adhäsiv getaucht wurdee Lösung. Suchen Sie die Abschnitte auf der stumpfen Seite des Gitters. Die Gitter haben eine stumpfe oder matte Oberfläche auf der einen Seite und einer polierten oder glänzende Oberfläche auf der anderen Seite. Kein Trägerfolie ist nicht erforderlich. Hinweis: Es ist notwendig, diese Gitter mit antimagnetische Pinzette zu behandeln Gitter zu vermeiden, auf die Zange kleben. </li><li> Bereiten Sie den Abschnitt Klebstoff von 20 cm klar Klebeband in einem 5-Platzierung ml mit 2,0 ml Aceton Fläschchen. Cap und schütteln Sie das Fläschchen, lassen Sie für 10 Minuten ruhen lassen, dann entfernen Sie das Band verlässt die Klebstofflösung. </li></ol></li></ol> 4. Immunmarkierung <ol><li> Antigen Demaskierung <ol><li> Bereiten Sie 1 ml frischem gesättigten Natriummetaperiodat Ätzlösung in destilliertem Wasser und verwenden Sie es sofort. Ort Tröpfchen der Ätzlösung auf einer sauberen Oberfläche labfilm. </li><li> Platzieren vollständig trocken Gitter mit Abschnitten nach unten auf Tröpfchen Natriummetaperiodat-Lösung bei Raumtemperatur für 30 min. Übertragen Sie die Gitter zu destilliertem Wasser droPletts für 60 sec Waschen. </li></ol></li><li> Antikörperinkubation und QD Sondenmarkierung <ol><li> Führen Sie alle Inkubationen und Kennzeichnung auf Tröpfchen Lösung auf eine saubere Oberfläche Parafilm gelegt. </li><li> Legen Sie das Gitter auf einem Tröpfchen von 0,05 M Glycin in PBS für 10 min Restaldehyd im Abschnitt zu blockieren. Entfernen Sie den Aldehydblock durch kurzes Drücken der Kante des Gitters Blotting. </li><li> Platzieren Sie die Gitter auf einem Tropfen 1% normalem Ziegenserum (NGS) und 1% BSAC (10%) in PBS für 10 min. Bereiten Sie die Blockierungslösung durch Zugabe von 10 ul NGS und 100 ul BSAC bis 890 &amp; mgr; l PBS auf ein Endvolumen von 1000 &amp; mgr; l zu ergeben. </li><li> Voraussetzung für die Abschnitte von 10 min auf einem Tropfen Antikörperverdünnung platzieren. </li><li> Führen Sie die Immunmarkierung Inkubation mit Anti-Somatostatin-polyklonalen Antikörper verdünnt 1:10 mit Antikörper Verdünnungsmittel mit einer Konzentration von 3,47 g / L zu geben. Hinweis: Antikörper-Inkubation wird durchgeführt durch Gitter auf Tröpfchen für 1 h bei Raum temperat Plazierenure in einer feuchten Kammer. </li><li> Entfernen Antikörperreagens aus Schritt 4.2.5 durch Blotten der Kante des Gitters dann waschen Abschnitte über Verdünnungsmittel für 2 x 5 min. </li><li> Inkubieren in sekundären Antikörper (biotinylierter Ziege-anti-Kaninchen-polyklonal) 01.10 für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung. Waschen Sie in Verdünnungsmittel für 2 x 5 min. </li><li> Inkubieren in Streptavidin konjugierten QD (585 nm) 01.10 für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt. Mit Alufolie abdecken, um Lichtexposition während der Inkubation zu reduzieren. </li><li> Waschen Sie Gitter in frischem destilliertem Wasser für 2 min. Blot, der die Kanten des Gitters trocken. </li></ol></li></ol> 5. Die Fluoreszenzlichtmikroskopie <ol><li> Lichtquelle und Filterwürfel <ol><li> Verwenden Sie 365-nm-Licht emittierende Diode (LED) Beleuchtung für Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie. Legen Sie eine Filterwürfel mit den folgenden Merkmalen: (Ex G 365 nm, BS FT 395 und EM LP 420 nm). Hinweis: Dieser Filterwürfel wkrank erlauben die Emissionsspektren aller QD gleichzeitig unter der gleichen Anregungswellenlänge visualisiert werden Größen. </li></ol></li><li> Anzeigen und Imaging Bereiche <ol><li> Platzieren Sie den immunhistochemisch Gitterabschnitt nach unten auf einem Glasträger in einem Tropfen Wasser geben und mit einem Deckglas (Dicke Nummer 1.5). Verwenden Sie die Lichtmikroskopie die Markierungsmuster, das Niveau von jedem nicht-spezifische Markierung zu bewerten und festzustellen, dass die negativen Kontrollen klar der Markierung sind. </li><li> Identifizieren Sie ROI in Bezug auf Gitterstäben. Finder Gitter können hilfreich sein für die Festlegung Koordinaten von Zielstrukturen. </li><li> Erwerben Sie Bilder von positiven Kennzeichnung auf dem Abschnitt eines Vollfarbdigitalkamera mit der Kameraeinstellung auf &quot;FL Auto-Farbe&quot; und &quot;Weißabgleich&quot; eingestellt bei 3.200K verwenden. Verwenden Sie die Kamera in &quot;Automatische Belichtung&quot; Modus mit einem &quot;Gamma&quot; Einstellung zwischen 0,45 und 1,00, das Aussehen der Bilder und &quot;Analog Gain&quot; auf 1x eingestellt zu optimieren.Klicken Sie auf das Kamera-Symbol in der Zen 2 Lite Software grafische Schnittstelle zu &quot;Live&quot;, das Bild scharf und klicken Sie auf &quot;Snap&quot; das Bild in den Bildspeicher zu erfassen. </li><li> Speichern Sie die Bilder als TIF-Dateien Kompression und pixelation zu vermeiden, zeichnet sich ab. </li><li> Vorbereiten eines Druck die Position des ROI in Bezug auf die Gitterstäbe oder andere bedeutende Teilpunkte zeigt. Diese Drucke werden für nachfolgende Navigations des Abschnitts und Wiederfindungs ​​ROIs durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) nützlich sein. </li><li> Entfernen Sie das Gitter aus der Folie, waschen in destilliertem Wasser und sanft die Kanten trocken tupfen. Hinweis: Nicht allzu intensive Beleuchtung verwenden, um Fluoreszenzbilder zu erwerben. Die Photostabilität von QD ermöglicht Aufnahmezeiten von bis zu ein paar Sekunden, aber darauf achten, nicht zu verlängern Exposition als Abschreckung des QD-Signal nach ca. 1 min in Wasser auftreten können. Extended oder dauerhafte Photo wird nur dann erhalten, wenn QD markierten Abschnitte dehydriert sind mit Toluol undunter Deckgläser gemäß den Vorgaben des Herstellers eingebettet. Allerdings wird dieser Prozess dann die Möglichkeit ausschließen, von Korrelat Prüfung des gleichen Abschnitts durch TEM. </li></ol></li></ol> 6. Transmissionselektronenmikroskopie <ol><li> TEM - Set Up und Viewing <ol><li> Übertragen, um das Raster zu dem TEM zur Untersuchung einer Beschleunigungsspannung von 100 kV verwendet wird. Verwenden geringer Vergrößerung von etwa 1,400X um das Netz zu navigieren und finden ROIs, die mit den Lichtmikroskopie Ansichten korrelieren. Ansicht Cluster von QD bei Vergrößerungen um 50.000-. </li><li> Beachten Sie einzelne QDs bei 70,000X Vergrößerung oder höher. Beachten Sie die QD als irreguläre Kristallstrukturen mit mäßiger Elektronendichte. </li></ol></li><li> Imaging <ol><li> Verwenden Sie eine Digitalkamera für TEM-Aufnahmen. Eine monochrome 1.392 x 1.040 Pixelsensor ist ausreichend. </li><li> Erwerben Sie Bilder durch die &quot;Kamera&quot; Symbol klicken auf &quot;On&quot; in der MICROscope grafische Oberfläche der Bildgebungssoftware, dann auf &quot;Aus&quot;, um das Bild in dem Bildspeicher zu speichern. Anmerkung: Diese Vorgänge unterscheiden sich auf dem Mikroskopsystem abhängig eingesetzt. Verwenden Sie die Kamera in automatischen Belichtungsmodus mit einer &quot;Gamma&quot; Einstellung von 1,00. </li><li> Speichern Sie die Bilder als TIF-Dateien. </li></ol></li></ol> 7. CLEM Imaging <ol><li> Auffinden eines Fluoreszenz - ROI durch TEM <ol><li> Verwenden Sie einen Druck aus dem Lichtmikroskop Bild zu lokalisieren ROIs durch TEM entspricht. Tissue architektonischen Merkmale wie Blutgefäße und luminalen Strukturen sind für die Navigation um den Abschnitt nützlich TEM. </li><li> Aufnehmen eines Bildes des entsprechenden ROI durch TEM. </li></ol></li><li> Clem Bild - Overlay <ol><li> Stellen Sie sicher, dass das TEM-Bild korrekt mit dem Lichtmikroskop Bild und korrigieren Sie die Erweiterung von jedem, so dass die gleiche Struktur gesehen in jeder Modalität die gleiche Größe orientiert ist. </li><li> Orientsie aßen die Lichtmikroskopie und TEM-Aufnahmen und zeigen Sie die Seite an Seite oder als Overlays die ultrastrukturelle Merkmale von immun ROIs zu markieren. </li><li> Erstellen Sie ein Overlay-Bild mit Photoshop CS2. Zunächst vergrößern die Fluoreszenzbild auf der gleichen Vergrößerung als Low-Power-TEM-Aufnahme. beide Bilder Orientieren und dann seitlich auf einer Leinwand an Seite einfügen. </li><li> Flatten das Bild. </li><li> Erstellen Sie die Fluoreszenz-Overlay von diesem zusammengesetzten Bild. Klicken Sie auf das &quot;Auswahlrechteck&quot;, wählen Sie das Fluoreszenzbild und erstellen daraus eine doppelte Schicht. </li><li> Stellen Sie die &quot;Ebenenstil / Blending Optionen&quot;, um 30 - 40% Transparenz. </li><li> Klicken Sie auf das &quot;Move Tool&quot; und ziehen Sie die Fluoreszenz-Overlay-Schicht über dem entsprechenden TEM-Aufnahme. Richten Sie die Bilder. </li><li> Nach der Ausrichtung zu erreichen &quot;Flatten&quot; die Schichten der endgültigen Overlay-Bild zu erzeugen. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Auswahlrechteck&quot;, um das neue Overlay-Bild ein zu wählennd kopieren Sie sie auf eine neue Leinwand. Speichern Sie diese als Tiff-Datei. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Diese Studie hat das Potenzial, Nutzen von QD als universelle Sonden für CLEM Studien nachgewiesen. Die 585 nm QD verwendeten Nanopartikel zeigten helle und stabile Fluoreszenz, wenn sie durch Weitfeld- Lichtmikroskopie betrachtet und wurden durch TEM leicht beobachtet. Eine frühere Studie von einem der Autoren dieses hat auch QD gezeigt für superauflösende Lichtmikroskopie 7 geeignet zu sein. Ihre Photo war besonders nützlich für längere Betrachtungszeiten und lange Abbildungs ​​Belichtungen. QD kann auch mi...

Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) ist ein leistungsfähiges Verfahren für die Analyse von transienten dynamischen Ereignissen 1, seltene Ereignisse 2, 3 und komplexe Systeme 4. Es gibt viele verschiedene technische Permutationen verfügbar 5 je nach Fragestellung jedoch aufgefordert, eine häufige Anforderung ist , dass die gleiche Struktur in einer einzigen Probe 6 durch mehrere Mikroskopie Modalitäten abgebildet wird. Unsere besondere Herangehensweise an Clem wurde für das Studium der Archiv menschlichen Pathologie Gewebe und den Fall entwickelt hier verwendet wurde , gut charakterisiert und bisher 7 veröffentlicht. Ziel war es zunächst, die analytischen Daten aus einer einzigen Biopsie oder chirurgische Probe und zum anderen zu maximieren, Fluoreszenzlichtmikroskopie verwenden, um den Kontext des immunzytochemischer Markierungsmuster auf ultrastruktureller Ebene gesehen zu helfen, zu klären. Quantenpunkt-Nanokristalle (QD) bieten das Potenzial eines universellen Markersystem able von beiden betrachtet werden, Fluoreszenzlichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie 8, 9, 10. ihrer kristallinen Kernstruktur ermöglicht QD unterschiedlicher Größe eine Vielzahl von Fluoreszenzemissionsspitzen zu erzeugen , wenn 11 durch Licht bei Wellenlängen weit von ihren Emissionsspektren angeregt. Deren Atomgewicht reicht Elektronendichte zu ergeben, die durch Transmissionselektronenmikroskopie, Rastertransmissions-Elektronenmikroskopie (STEM) oder Feldemissionsrasterelektronenmikroskopie detektierbar ist. Sie eignen sich besonders für immunzytochemische Studien geeignet , da auch einzelne QDs beobachtet werden kann eine ultimative Empfindlichkeit eines QD pro Ziel geben Molekül 12. Weiterhin verwendet auf der QD je können sie eine einzelne Elementar Signatur geeignet für die Zuordnung besitzen. Menschliche Pathologie Proben bieten erhebliche Vorteile für die translationale biomedizinische Forschung. Chirurgische Gewebe und Biopsieproben werden routinemäßig für Biobanken vorgelegt und mit geeignet friate Ethik Abstände können für Forschungsstudien zugegriffen werden. Menschliches Gewebe nicht über Fragen von Bedeutung oder Interpretation , die in tierischen oder in vitro - Modellen der Krankheit auftreten können. Jedoch die Probenvorbereitung der Pathologie Proben oft nicht optimal ist. Es kann in Fixiermittel verwendet unangemessen Verzögerung im Gewebe platziert Fixiermittel wie Formalin statt Glutaraldehyd für TEM und unangemessene Probenahme. Clem Methoden haben das Potenzial, die diagnostische und prognostische Informationen aus einer einzigen menschlichen Probe zu optimieren. Allerdings sind einige neu entwickelte Korrelat Ansätze , wie sie unter Verwendung von Mini - Singlet Sauerstoff - Generator (miniSOG) für den Einsatz in der Pathologie nicht verfügbar , da die Notwendigkeit für das Tag genetisch in die Zelle von Interesse 13 codiert werden. Aus diesem Grund haben wir die Nützlichkeit von QD Kennzeichnung von routinemäßig vorbereitet TEM Gewebe für die korrelative immunzytochemische Studien untersucht. QP angewandt geätzten Epoxid- oder Acrylharz-Abschnitte von lightly Aldehyd fixiert Biopsie und Gewebeproben bieten die Möglichkeit, Korrelat Fluoreszenzlichtmikroskopie und TEM-Daten aus einer einzigen Probe zu erhalten.

<table><tbody><tr><td>Natriumcacodylat</td><td>Proscitech</td><td>C0205</td><td>Schädliche Chemikalie</td></tr><tr><td>Osmiumtetroxid</td><td>Proscitech</td><td>C010</td><td>Nur im Abzug verwenden</td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>Univar-Ajax</td><td>569</td><td>Gefährliche Chemikalie</td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td> <td>Fronine</td><td>JJ008</td><td></td></tr><tr><td>Aceton 100%</td> <td>Fronine</td><td>JJ006</td><td></td></tr><tr><td>ERL 4221</td><td>Proscitech</td><td>C056</td><td></td></tr><tr><td>DER 732</td><td>Proscitech</td><td>C047</td><td></td></tr><tr><td>NSA</td><td>Proscitech</td><td>C059</td><td></td></tr><tr><td>DMAE</td><td>Proscitech</td><td>C050</td><td></td></tr><tr><td>Natriummetaperiodat</td><td>Analar BDH</td><td>10259</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Somatostatin-Antikörper</td><td>Dako</td><td>A0566</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper-Verdünnungsmittel</td><td>Dako</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 585 Streptavidin-Konjugat&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q10113MP</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper</td><td>Sigma</td><td>B7389-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd 50%</td><td>EMS</td><td>16320</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>PBS "Dulbecco A"</td><td>Oxoid&nbsp;</td><td></td><td></td>BR0014G</tr><tr><td>BSAc (10%)</td><td>Aurion</td><td>900.022</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney PP</td><td>M</td><td></td></tr><tr><td>pH Indikatorstreifen (pH 2,0 - 9,0)</td><td>Merck</td><td>1.09584.0001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroformen</td><td>Proscitech</td><td>RL063</td><td></td></tr><tr><td>Diamantmesser</td><td>Diatome</td><td>Ultra 45</td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop</td><td>FEI</td><td>Morgagni 268D</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzlichtmikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axioskop A1</td><td></td></tr><tr><td>Gitter 300 Mesh Nickel (dünner Balken)</td><td>Agar Scientific</td><td>G2740N</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>RMC</td><td>Powertome</td><td></td></tr><tr><td>TEM Kamerasteuerungssoftware</td><td>Soft Imaging System</td><td>AnalySIS</td><td>Version 3.0</td></tr><tr><td>Bildverarbeitungssoftware</td><td>Adobe Systems Integriertes</td><td>Photoshop CS2</td><td></td></tr></tbody></table>

korrelative light- und elektronenmikroskopie quantum dot nanopartikel

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Es wird ein Verfahren beschrieben, wobei Quantenpunkt (QD) Nanopartikel können für die korrelative immunzytochemische Studien der menschlichen Pathologie Gewebe unter Verwendung von Weitfeldfluoreszenzlichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) verwendet werden. Um zu demonstrieren, das Protokoll haben wir ultradünnem epoxy Abschnitte des menschlichen Somatostatinom Tumor immunmarkierten einen primären Antikörper gegen Somatostatin verwendet, gefolgt von einem biotinylierten sekundären Antikörper und Sichtbarmachung mit Streptavidin konjugiert ist 585 nm Cadmium-Selen (CdSe) Quantenpunkte (QD). Die Abschnitte werden auf einem TEM Objektgitter montiert dann durch Mikroskopie Weitfeld- Fluoreszenzlicht auf einen Glasträger zur Beobachtung angeordnet. Die Lichtmikroskopie zeigt 585 nm QD Kennzeichnung als leuchtend orange Fluoreszenz ein körniges Muster innerhalb der Tumorzelle Zytoplasma bilden. Bei niedrigen bis mittleren Bereich Vergrößerung durch Lichtmikroskopie die Markierungsmuster leicht erkannt werden kann, und die Höhe der nicht-spezifische oder Hintergrundmarkierung bewertet. Dies ist ein kritischerSchritt für die anschließende Interpretation der Immunomarkierung Musters durch TEM und Bewertung des morphologischen Kontext. Der gleiche Abschnitt wird dann trocken getupft und mit TEM betrachtet. QD Sonden gesehen in einzelnen sekretorischen Granula enthalten amorphes Material angebracht werden. Die Bilder werden aus der gleichen Region von Interesse (ROI) gesehen durch Lichtmikroskopie für die korrelative Analyse erworben. können Bilder von jeder Modalität entspricht, dann vermischt werden Fluoreszenzdaten auf TEM Ultrastruktur des entsprechenden Bereichs zu überlagern.

Die Somatostatinom Tumorprobe für diese Studie verwendet wurde, umfasste Tumorzellen duktalen Strukturen gemischt mit kollagenen Stoma-Gewebe zu bilden. Durch Fluoreszenzlichtmikroskopie, einzelne Tumorzellen, die reichlich Sekretgranula enthielten, zeigten eine positive Markierung für das Somatostatin-Hormon. Nuclei erschien als dunkle Löcher mit minimalen unspezifische Markierung nachweisbar (Abbildung 1). Bei niedrigen Vergrößerungen variabel intensive körnige Orangen...

Es wird ein Verfahren beschrieben, bei dem Quantenpunkt-Nanopartikel (QD) für korrelative immunzytochemische Studien von in Epoxid eingebettetem menschlichem Pathologiegewebe verwendet werden können. Wir verwenden kommerzielle Antikörperfragment-konjugierte QDs, die durch Weitfeld-Fluoreszenzlichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar gemacht werden.

Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, korrelative Licht- und Elektronenmikroskopiedaten (CLEM) zu erhalten, indem fluoreszenzimmunzytochematische Informationen mit der ultrasruckturellen Morphologie aus der Transmissionselektronenmikroskopie in einem einzigen Bild kombiniert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunzytochemie und Pathologie zu beantworten, beispielsweise, mit welcher subzellulären Struktur ein bestimmtes Protein von Interesse assoziiert ist. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass dieselbe Quantenpunkt-Nanopartikel-Sonde verwendet wird, um sowohl das Signal der Live-Mikroskopie vom Zielprotein als auch die strukturelle Lokalisation in der Elektronenmikroskopie zu erhalten.Nach der Fixierung, Einbettung und Schnittpräparation von menschlichem Somatostatinom-Tumorgewebe gemäß dem Textprotokoll bereiten Sie eine Schnittklebelösung vor, indem Sie 20 Zentimeter durchsichtiges Klebeband in eine 5-Milliliter-Flasche mit 2,0 Millilitern Aceton geben und 10 Minuten stehen lassen. Entfernen Sie das Klebeband und tauchen Sie ein Nickelgitter in die Lösung, nehmen Sie das Gitter anschließend heraus und lassen Sie es an der

correlative-light-electron-microscopy-using-quantum-dot

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die CLEM Technik angepasst worden, um ultrastrukturelle Morphologie der Membranen, Organellen und subzelluläre Strukturen mikroinjizierten Moleküle beeinflusst analysieren. Diese Methode kombiniert die leistungsstarke Techniken der Mikromanipulation / Mikroinjektion, konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Elektronenmikroskopie zu ermöglichen Millimeter bis multi-Nanometer-Auflösung. Diese Technik ist zugänglich für eine breite Vielzahl von Anwendungen.

Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM) als Werkzeug zur Visualisierung mikroinjiziert Moleküle und ihre Eukaryotic Sub-zellulären Targets

Wir beschreiben ein Verfahren zur Lokalisierung fluoreszent markierte Proteine ​​in elektronenmikroskopischen Aufnahmen. Fluoreszenz wird zuerst lokalisiert durch Foto-activated localization microscopy auf ultradünne Schnitte. Diese Bilder werden dann an elektronenmikroskopischen Aufnahmen von dem gleichen Abschnitt ausgerichtet ist.

Nano-FEM: Protein Localization Mit Photo-aktivierten Localization Microscopy and Electron Microscopy

Wir beschreiben die Herstellung von kolloidalen Quantenpunkten mit minimierter hydrodynamische Größe für Einzel-Molekül-Fluoreszenz-Imaging. Im Vergleich zu herkömmlichen Quantenpunkte sind diese Nanopartikel in der Größe ähnlich zu globularen Proteinen und sind für Einzel-Molekül-Helligkeit, Stabilität gegen Photodegradation und Beständigkeit gegen unspezifische Bindung an Proteine ​​und Zellen optimiert.

Compact Quantum Dots für Einzelmolekül-Imaging

Wir beschreiben eine korrelative Mikroskopie-Methode, die High-Speed-3D-Live-cell Fluoreszenzlichtmikroskopie und hochauflösenden Kryo-Elektronen-Tomographie vereint. Wir demonstrieren die Fähigkeit des korrelativen Verfahren durch Abbilden dynamisch kleine HIV-1-Partikeln Interaktion mit dem Host-HeLa-Zellen.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Einzel Fluorophore mit Nanometer-Präzision mit FIONA lokalisiert werden. Hier eine Zusammenfassung der FIONA-Technik wird berichtet, und wie die Durchführung FIONA Experimente beschrieben.

Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Hier stellen wir eine zuverlässige Methode vor, um den Einbau von Nanopartikeln in eine Polymer-Wirtsmatrix durch Quellverkapselung zu überwachen. Wir zeigen, dass die Oberflächenkonzentration von Cadmiumselenid-Quantenpunkten durch Querschnitts-Fluoreszenzbildgebung genau sichtbar gemacht werden kann.

Erweiterte Analyse der Zusammensetzung von Nanopartikel-Polymer Composites mittels direkter Fluoreszenz-Imaging

In diesem Protokoll ermöglichen Quantenpunkte, die an rekombinante SARS-CoV-2-Spike konjugiert sind, zellbasierte Assays, die Spike-Bindung an hACE2 an der Plasmamembran und die anschließende Endozytose der gebundenen Proteine in das Zytoplasma zu überwachen.

Konfokale Hochdurchsatz-Bildgebung von quantenpunktkonjugierten SARS-CoV-2-Spike-Trimern zur Verfolgung von Bindung und Endozytose in HEK293T-Zellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Immunmarkierung eines Proteins in den Herzgewebeschnitten unter Verwendung von Quantenpunkten. Diese Technik bietet ein nützliches Werkzeug, um die subzelluläre Lokalisation und Expression eines Proteins auf ultrastruktureller Ebene zu visualisieren.

Visualisierung der subzellulären Lokalisation eines Proteins im Herzen mittels Quantenpunkt-vermittelter Immunmarkierung gefolgt von Transmissionselektronenmikroskopie

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für eine optimierte korrelative Lichtelektronenmikroskopie vor, die auf endogener, fluoreszierender Markierung basiert, um die Lokalisierung seltener Proteine in Bezug auf die zelluläre Ultrastruktur zu untersuchen. Die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes wird durch die ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 in ausgehungerten Zellen ohne Bafilomycin-Behandlung demonstriert.

Ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 mittels korrelativer Lichtelektronenmikroskopie

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie nach der Einbettung von Epon unter Verwendung eines fluoreszierenden Proteins namens mScarlet. Diese Methode kann die Fluoreszenz und die Ultrastruktur gleichzeitig aufrechterhalten. Diese Technik ist für eine Vielzahl biologischer Anwendungen geeignet.

Epon Post Embedding Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt einen Mechanismus zur Verwendung von korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie, um die Wechselwirkung von Mitochondrien und Lysosomen, die mit mEosEM bzw. APEX2 markiert sind, sichtbar zu machen.

Zweifarbige korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und Lysosomen

Erfahren Sie die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie mit Quantum-Dot-Nanopartikeln für Immunzytochemie und Pathologie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Proteinlokalisation in menschlichem Tumorgewebe mit hoher Präzision.

Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

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