Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM-Daten) zu erhalten, indem immunzytochemische Fluoreszenzinformationen mit ultrastruktureller Morphologie aus der Transmissionselektronenmikroskopie in einem einzigen Bild kombiniert werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Immunzytochemie und Pathologie zu beantworten, z. B. mit welcher subzellulären Struktur ein bestimmtes Protein von Interesse verbunden ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie dieselbe Quantenpunkt-Nanopartikelsonde verwendet, um sowohl das Lebendmikroskopiesignal vom Zielprotein als auch die strukturelle Lokalisierung der Elektronenmikroskopie zu erhalten.

Nach dem Fixieren, Einbetten und Schneiden von humanem Somatostatinom-Tumorgewebe gemäß dem Textprotokoll wird eine Schnittklebelösung hergestellt, indem 20 Zentimeter klares Klebeband in eine Fünf-Milliliter-Flasche mit 2,0 Millilitern Aceton gegeben und 10 Minuten stehen gelassen wird. Entferne das Klebeband und tauche ein Nickelgitter in die Lösung, entferne dann das Gitter und lass es an der Luft trocknen. Sobald es getrocknet ist, verwende die stumpfe Seite des Gitters, um einen ultradünnen Schnitt aufzunehmen.

Es ist wichtig, die richtige Ätzzeit für die gewählte Harzformulierung festzulegen. 30 Minuten funktionieren gut für diese Formulierung, müssen aber möglicherweise für härtere oder weichere Formulierungen neu berechnet werden. Bereiten Sie einen Milliliter frische, gesättigte Natriummetaperiodat-Ätzlösung in destilliertem Wasser vor und geben Sie Tröpfchen der Lösung auf eine saubere Laborfilmoberfläche.

Vollständig trockene Gitter mit Abschnitten auf die Tröpfchen legen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Übertragen Sie dann die Gitter für 60 Sekunden in destillierte Wassertröpfchen, um sie abzuwaschen. Um die Markierung von Antikörpern und Quantenpunkten (QD) auf einer sauberen Laborfilmoberfläche durchzuführen, pipettieren Sie Tropfen von 0,05 molaren Glypen und PBS.

Legen Sie die Gitter auf die Tröpfchen und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang, um den Restaldehyd auf den Schnitten zu blockieren. Um den Aldehydblock zu entfernen, tupfen Sie den Rand des Gitters kurz ab. Legen Sie dann das Gitter 10 Minuten lang auf ein Tröpfchen aus einem Prozent normalem Ziegenserum oder NGS und einem Prozent BSAC in PBS.

Bereiten Sie einen Milliliter Blockierungslösung vor, indem Sie 10 Mikroliter NGS und 100 Mikroliter BSAC zu 890 Mikrolitern PBS hinzufügen. Konditionieren Sie dann die Abschnitte, indem Sie sie 10 Minuten lang auf ein Tröpfchen Antikörperverdünnungsmittel legen. Verwenden Sie anschließend ein Antikörperverdünnungsmittel, um den polyklonalen Anti-Somatostatin-Antikörper von eins bis 10 zu verdünnen, und legen Sie die Gitter auf Tröpfchen der Lösung.

In einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation das Antikörperreagenz, indem Sie den Rand des Gitters abtupfen. Waschen Sie die Schnitte dann mit Antikörperverdünnungsmittel zweimal für jeweils fünf Minuten.

Nach dem Verdünnen des Sekundärantikörpers eins bis 10 und der Vorbereitung der Tropfen inkubieren Sie die Gitter auf den Tröpfchen eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann die Antikörperlösung und waschen Sie die Abschnitte zweimal. Verdünnen Sie die konjugierten QDs von Streptavidin eins bis 10 und inkubieren Sie die Proben an Tropfen der Lösung im Dunkeln bei Raumtemperatur eine Stunde lang.

Waschen Sie die Gitter dann mit Antikörperverdünnungsmittel zweimal, jeweils fünf Minuten lang, und tupfen Sie den Rand der Gitter ab. Waschen Sie anschließend die Gitter zwei Minuten lang in destilliertem Wasser, bevor Sie die Ränder trocken tupfen. Legen Sie den immungefärbten Gitterabschnitt in einem Wassertropfen auf einen Objektträger und verwenden Sie einen Glasdeckglas, um ihn abzudecken.

Um die Fluoreszenzlichtmikroskopie durchzuführen, setzen Sie einen Filterwürfel mit den folgenden Eigenschaften ein und verwenden Sie eine 365-Nanometer-LED-Beleuchtung. Legen Sie den immungefärbten Schnitt auf den Immunfluoreszenzmikroskoptisch. Verwenden Sie die Lichtmikroskopie, um das Markierungsmuster und den Grad der unspezifischen Markierung zu bewerten und festzustellen, ob die Negativkontrollen klar sind.

Identifizieren Sie als Nächstes die ROIs in Bezug auf Rasterbalken. Stellen Sie dann eine vollfarbige Digitalkamera auf FL Auto Color ein und stellen Sie den Weißabgleich auf 3.200 K ein.Stellen Sie die Kamera auf den automatischen Belichtungsmodus mit einer Gamma-Einstellung zwischen 0,45 und 1,00 ein, um das Erscheinungsbild der Bilder zu optimieren, und stellen Sie die analoge Verstärkung auf ein X ein.Klicken Sie auf das Kamerasymbol in der grafischen Benutzeroberfläche der ZEN Two Light-Software, um zu sehen. Fokussieren Sie sich dann auf das Bild und klicken Sie in der grafischen Benutzeroberfläche der ZEN Two Light-Software auf Fangen, um das Bild im Frame-Store aufzunehmen.

Speichern Sie die Bilder als TF-Dateien, um Komprimierung und Verpixelung zu vermeiden. Bereiten Sie einen Druck vor, der die Position des ROI in Bezug auf die Rasterbalken oder andere wichtige Orientierungspunkte des Gewebes zeigt. Entfernen Sie dann das Gitter von der Folie, waschen Sie es in destilliertem Wasser und tupfen Sie die Ränder vorsichtig trocken.

Um die Transmissionselektronenmikroskopie durchzuführen, überträgt man das Gitter mit einer Beschleunigungsspannung von 100 Kilovolt zur Untersuchung auf das Mikroskop. Beginnen Sie mit einer niedrigen Vergrößerung von ca. 1.400x, um durch das Raster zu navigieren und die ROIs mit denen der Lichtmikroskopie zu ermitteln. Beobachten Sie einzelne QDs bei 70.000-facher Vergrößerung oder mehr.

Sie erscheinen als unregelmäßige kristalline Strukturen mit mäßiger Elektronendichte. Klicken Sie dann bei Verwendung einer Digitalkamera mit einem monochromen 1.392 x 1.040-Pixel-Sensor in der grafischen Benutzeroberfläche der Bildgebungssoftware auf das Kamerasymbol, um Bilder zu aktivieren und aufzunehmen. Verschieben Sie das Kamerasymbol in die Aus-Position, um das Bild im Framestore zu speichern.

Um die CLEM-Bildgebung durchzuführen, verwenden Sie einen Abdruck aus der lichtmikroskopischen Bildgebung, um die entsprechenden ROIs nach TEM zu lokalisieren. Tissue Architectural Features sind nützlich für die Navigation in diesem Abschnitt. Erfassen Sie ein Bild des entsprechenden ROI nach TEM.

Um ein CLEM-Bild vorzubereiten, stellen Sie als Nächstes sicher, dass das TEM-Bild korrekt ausgerichtet und auf die gleiche Größe und Auflösung wie das Lichtmikroskopbild vergrößert ist, in diesem Fall 300 Pixel pro Zoll. Vergrößern Sie die Bildleinwand für die Lichtmikroskopie auf das Doppelte ihrer Größe. Kopieren Sie dann das TEM-Bild und fügen Sie es neben das Fluoreszenzbild ein.

Um eine Fluoreszenzüberlagerung in Photoshop CS2 zu erstellen, klicken Sie auf das rechteckige Auswahlwerkzeug, wählen Sie das fluoreszierende Bild aus und erstellen Sie daraus eine duplizierte Ebene. Passen Sie die Fülloptionen für den Ebenenstil auf 30 bis 40 % Transparenz an. Klicken Sie dann auf das Verschieben-Werkzeug, ziehen Sie die Fluoreszenzüberlagerungsschicht über das entsprechende TEM-Bild und richten Sie die Bilder aus.

Nachdem Sie die Bilder ausgerichtet haben, reduzieren Sie das Bild, um die endgültige Überlagerung zu erstellen. Verwenden Sie dann das rechteckige Auswahlrahmen-Werkzeug, um das neue Overlay-Bild auszuwählen und es auf eine neue Leinwand zu kopieren. Speichern Sie abschließend das Bild als TF-Datei.

In dieser fluoreszenzmikroskopischen Aufnahme enthalten einzelne Somatostatinom-Tumorzellen reichlich sekretorische Granula und wurden positiv für das Hormon Somatostatin markiert. Die Zellkerne erschienen als dunkle Löcher und bei geringer Vergrößerung wurde eine unterschiedlich intensive körnige orangefarbene QD-Fluoreszenz im Zytoplasma beobachtet. Der von der Lichtmikroskopie gewählte ROI wurde mit Hilfe der TEM unter Bezugnahme auf ein 20-faches Lichtmikroskopiebild, wie hier angegeben, erkannt und abgebildet.

Bei höherer Vergrößerung zeigt die Zelle eine helle Fluoreszenz und eine intensive QD-Markierung in zytoplasmatischen Granula. Die Überlagerung von Fluoreszenzdaten mit TEM-Bildern, wie in diesem Beispiel, deutet darauf hin, dass eine starke positive Markierung Granulaten entspricht, die mäßig elektronendichtes Material innerhalb der Vesikel-Grenzmembran enthalten. Schließlich zeigten die mäßig elektronendichten Granulate eine intensive Immunmarkierung der QD-Nanokristalle, wie hier bei höherer Vergrößerung zu sehen ist.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in acht Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Gitter vorsichtig zu behandeln und nur an den Rändern. Wenn Sie den Schnitt berühren, während Sie das Raster aufnehmen, kann der Schnitt vom Raster gelöst werden.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Multiplex-Immunmarkierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob das gewünschte Protein mit einem anderen Protein kolokalisiert ist. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Pathologie, um die Proteinlokalisierung in archivierten menschlichen Gewebeprozessen für die Elektronenmikroskopie zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man immunzytochemische Informationen aus der Fluoreszenzlichtmikroskopie mit der Ultrastruktur aus der Transmissionselektronenmikroskopie kombiniert.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Osmiumtetroxid äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzausrüstung, das Arbeiten in einem Abzug und die ordnungsgemäße Abfallentsorgung getroffen werden sollten.