Name: Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Erfahren Sie die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie mit Quantum-Dot-Nanopartikeln für Immunzytochemie und Pathologie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Proteinlokalisation in menschlichem Tumorgewebe mit hoher Präzision.

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Die Autoren danken Xiao Juan Wu (Immunhistochemisches Labor) und der Abteilung für Anatomische Pathologie, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australien.

1. Die Gewebe Dissection und Fixation <ol><li> Tissue Dissection <ol><li> Präparieren Gewebestücke aus einem chirurgisch reseziert Tumorprobe oder Gewebebiopsie. Hinweis: Das Gewebe in dieser Studie verwendet wurde routinemäßig in Formalin fixiert, aber frisches Gewebe ist ebenfalls geeignet. Wir wählten eine Fläche von einem anatomischen Pathologe bestätigt und berichtet Somatostatinom Tumor nach histologischen Routinefärbung und Anti-Somatostatin Immunfärbung (nicht gezeigt) enthalten. </li><li> Verwenden Sie Gewebestücke nicht größer als etwa 1,0 mm 3. </li></ol></li><li> Cacodylatpuffer Vorbereitung <ol><li> Vorbereitung einer Stammpufferlösung (1 M) durch Zugabe von 21,4 g Natriumcacodylat (siehe Materialliste) und 3,0 ml 1% ige Calciumchloridlösung zu 90 ml destilliertem Wasser und danach Auffüllen der Lösung auf ein Endvolumen von 100 ml. Rühren Sie die Lösung und lassen Sie es über Nacht stehen, so dass das kristalline Reagenz vollständig auflöst. </li><li&gt; Bereiten Sie einen Puffer durch Zugabe von 20 ml der Stammlösung auf 170 ml Wasser und dann die Überprüfung der pH-Wert mit Indikatorstreifen Arbeitslösung. Den pH-Wert auf 7,4 durch Zugabe von 3 bis 4 Tropfen 3% HCl. Füllen Sie die Lösung auf ein Gesamtvolumen von 200 ml mit Endmolarität von 0,1 M. </li></ol></li><li> Fixative Herstellung und Verwendung <ol><li> In einem 10 ml-Ampulle von 50% Glutaraldehyd-Lösung zu 20 ml Natriumcacodylat Stammlösung (1 M). Füllen Sie mit destilliertem Wasser auf 190 ml. Den pH-Wert einzustellen und auf 7,4 durch Zugabe von 1 bis 4 Tropfen 3% ige Salzsäure (HCl), falls erforderlich. </li><li> Füllen Sie mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 200 ml zu erhalten. </li><li> Eintauchen des Gewebes in Fixiermittel 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumkakodylat - Puffer pH 7,4 für 24 h bei 4 ° C in einer Glasprobenröhrchens enthält. Nicht verwendete Fixiermittel nach 1 Woche. </li></ol></li></ol> 2. Gewebeverarbeitung und Embedding <ol><li> Osmium TetroXide Anfärben <ol><li> Nach der Fixierung abgeschlossen ist, tauchen für weitere 20 Minuten in das Gewebe in Natriumcacodylatpuffer (0,1 M) für 20 min dann wiederholen. </li><li> Bereiten Sie eine 2% ige wässrige Osmiumtetroxid (OsO 4) Arbeitslösung von 8,0 ml einer 5% OsO 4 Stammlösung zu 2,0 ml Natriumcacodylatpuffer Stammlösung (1 M) und 10,0 ml destilliertem Wasser zugegeben wird ein endgültiges Volumen zu machen 20,0 ml. </li><li> Entfernen der Puffer dann das Gewebe in 2% OsO 4 tauchen bei pH 7,4 für 4 Stunden bei Raumtemperatur. ACHTUNG! Seien Sie vorsichtig beim Umfüllen und OsO 4 Herstellung von Lösungen, tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und Arbeit in einem Abzug zu allen Zeiten. </li></ol></li><li> Uranylacetat Anfärben <ol><li> Nach Gewebe osmication abgeschlossen ist, die OsO 4 -Lösung zu entfernen und für 10 min Gewebe in 2% Natriumacetat eintauchen. Entfernen Sie die 2% Natriumacetat dann in 2% Uranylacetat für 1 Stunde tauchen aufZimmertemperatur. </li></ol></li><li> Entwässerung <ol><li> Entwässern Gewebe durch abgestufte Alkohole. Verwenden 50% Ethanol für 10 Minuten, 70% Ethanol für 10 min, 95% Ethanol für 10 min und zwei Wechsel von 100% Ethanol für jeweils 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Führen Sie zwei Änderungen von 100% Aceton für jeweils 30 min. </li></ol></li><li> Harzimprägnierung und Härtung <ol><li> Mischen Sie mit niedriger Viskosität Epoxidharz in einem Einweg-Polyethylenbecher. Hinzufügen, 10,0 g Vinylcyclohexendioxid (ERL 4221) Epoxymonomer, 6 g Diglycidylether von Polypropylenglykol (DER 732) und 26,0 g Nonenyl Bernsteinsäureanhydrid (NSA). Rühren Sie gründlich von Hand mit Holzstäbchen für 2 min. </li><li> In fünfzehn Tropfen 2-Dimethylaminoethanol (DMAE) Epoxy-Beschleuniger und rühren Sie wieder für 2 min. Achten Sie darauf, in vollem Umfang die ERL, DER und NSA Komponenten mischen, bevor die DMAE-Beschleuniger Zugabe. </li><li> Beginnen Harzimprägnierung des Gewebes durch Austauschen 100% Aceton mit 1: 1 Harz zu1 Harz zu Aceton für 3 Stunden und schließlich 100% über Nacht Harz: Aceton für 1 Stunde, dann mit 6 ersetzen. </li><li> Übertragen Sie das Gewebe in frischem Harz in 8 mm micromoulds. Heilung bei 70 ° C über Nacht. Harz sollte hart sein, aber nicht spröde nach der Aushärtung. </li></ol></li></ol> 3. Ultramikrotomie <ol><li> Messer, Schneidparameter und Abschnitt Stärke <ol><li> Legen Sie ein Semidünndiamantmesser in der Ultramikrotom und Zuschnitte aus dem Gewebe mit einer Dicke von 500 nm. </li><li> Float Abschnitte auf dem Wasserbad hinter der Messerkante. Pick - up die Abschnitte auf einem Glasträger und trocknen Sie sie nach unten für 10 bis 20 Sekunden unter Verwendung einer Heizplatte bei etwa 110 o C </li><li> Etch die Abschnitte mit Natriumethylat-Lösung für 20 Sekunden und dann mit 100% Ethanol dann destilliertes Wasser abwaschen. Stain mit 2% Methylenblau in 1% Borax für 20 Sekunden auf der Heizplatte, Spülen mit Leitungswasser für 5 Sekunden und trocken auf der Heizplatte 5 Sekunden läuft. Dann stain mit 1,5% Basisfuchsinlösung auf der Heizplatte für 5 Sekunden dann trocken auf der Heizplatte für 20 Sekunden. </li><li> Untersuchen von Hellfeld-Lichtmikroskopie und bestätigen, dass Tumorzellen und eine Region of Interest (ROI) sind in dem Abschnitt. </li><li> Ändern Sie den Semidünndiamantmesser zu einer ultradünnen Diamantmesser und stellen Sie die richtige Messerwinkel und Schnittgeschwindigkeit, wie durch die Messerhersteller empfohlen. </li><li> Schneiden Sie ultradünne Schnitte bei 90 nm Dicke. Beachten Sie die Goldfärbung der Abschnitte, wenn sie auf dem Wasserbad schwimmen. </li><li> Dehnen und glätten die Abschnitte durch Winken Chloroform Dampf aus einem 1 cm 2 Stück Filterpapier innerhalb von wenigen Millimetern der Abschnitte. Achten Sie darauf, nicht das Chloroform getränkten Papier in Kontakt mit der Wasseroberfläche zu bringen. </li></ol></li><li> Ultradünnes Abschnitt Grid Montage <ol><li> Heben Sie die ultradünne Schnitte von der Wasseroberfläche bis unter Verwendung eines 300-Mesh-Dünn bar Nickel TEM-Gitter, die in Abschnitt Adhäsiv getaucht wurdee Lösung. Suchen Sie die Abschnitte auf der stumpfen Seite des Gitters. Die Gitter haben eine stumpfe oder matte Oberfläche auf der einen Seite und einer polierten oder glänzende Oberfläche auf der anderen Seite. Kein Trägerfolie ist nicht erforderlich. Hinweis: Es ist notwendig, diese Gitter mit antimagnetische Pinzette zu behandeln Gitter zu vermeiden, auf die Zange kleben. </li><li> Bereiten Sie den Abschnitt Klebstoff von 20 cm klar Klebeband in einem 5-Platzierung ml mit 2,0 ml Aceton Fläschchen. Cap und schütteln Sie das Fläschchen, lassen Sie für 10 Minuten ruhen lassen, dann entfernen Sie das Band verlässt die Klebstofflösung. </li></ol></li></ol> 4. Immunmarkierung <ol><li> Antigen Demaskierung <ol><li> Bereiten Sie 1 ml frischem gesättigten Natriummetaperiodat Ätzlösung in destilliertem Wasser und verwenden Sie es sofort. Ort Tröpfchen der Ätzlösung auf einer sauberen Oberfläche labfilm. </li><li> Platzieren vollständig trocken Gitter mit Abschnitten nach unten auf Tröpfchen Natriummetaperiodat-Lösung bei Raumtemperatur für 30 min. Übertragen Sie die Gitter zu destilliertem Wasser droPletts für 60 sec Waschen. </li></ol></li><li> Antikörperinkubation und QD Sondenmarkierung <ol><li> Führen Sie alle Inkubationen und Kennzeichnung auf Tröpfchen Lösung auf eine saubere Oberfläche Parafilm gelegt. </li><li> Legen Sie das Gitter auf einem Tröpfchen von 0,05 M Glycin in PBS für 10 min Restaldehyd im Abschnitt zu blockieren. Entfernen Sie den Aldehydblock durch kurzes Drücken der Kante des Gitters Blotting. </li><li> Platzieren Sie die Gitter auf einem Tropfen 1% normalem Ziegenserum (NGS) und 1% BSAC (10%) in PBS für 10 min. Bereiten Sie die Blockierungslösung durch Zugabe von 10 ul NGS und 100 ul BSAC bis 890 &amp; mgr; l PBS auf ein Endvolumen von 1000 &amp; mgr; l zu ergeben. </li><li> Voraussetzung für die Abschnitte von 10 min auf einem Tropfen Antikörperverdünnung platzieren. </li><li> Führen Sie die Immunmarkierung Inkubation mit Anti-Somatostatin-polyklonalen Antikörper verdünnt 1:10 mit Antikörper Verdünnungsmittel mit einer Konzentration von 3,47 g / L zu geben. Hinweis: Antikörper-Inkubation wird durchgeführt durch Gitter auf Tröpfchen für 1 h bei Raum temperat Plazierenure in einer feuchten Kammer. </li><li> Entfernen Antikörperreagens aus Schritt 4.2.5 durch Blotten der Kante des Gitters dann waschen Abschnitte über Verdünnungsmittel für 2 x 5 min. </li><li> Inkubieren in sekundären Antikörper (biotinylierter Ziege-anti-Kaninchen-polyklonal) 01.10 für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung. Waschen Sie in Verdünnungsmittel für 2 x 5 min. </li><li> Inkubieren in Streptavidin konjugierten QD (585 nm) 01.10 für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt. Mit Alufolie abdecken, um Lichtexposition während der Inkubation zu reduzieren. </li><li> Waschen Sie Gitter in frischem destilliertem Wasser für 2 min. Blot, der die Kanten des Gitters trocken. </li></ol></li></ol> 5. Die Fluoreszenzlichtmikroskopie <ol><li> Lichtquelle und Filterwürfel <ol><li> Verwenden Sie 365-nm-Licht emittierende Diode (LED) Beleuchtung für Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie. Legen Sie eine Filterwürfel mit den folgenden Merkmalen: (Ex G 365 nm, BS FT 395 und EM LP 420 nm). Hinweis: Dieser Filterwürfel wkrank erlauben die Emissionsspektren aller QD gleichzeitig unter der gleichen Anregungswellenlänge visualisiert werden Größen. </li></ol></li><li> Anzeigen und Imaging Bereiche <ol><li> Platzieren Sie den immunhistochemisch Gitterabschnitt nach unten auf einem Glasträger in einem Tropfen Wasser geben und mit einem Deckglas (Dicke Nummer 1.5). Verwenden Sie die Lichtmikroskopie die Markierungsmuster, das Niveau von jedem nicht-spezifische Markierung zu bewerten und festzustellen, dass die negativen Kontrollen klar der Markierung sind. </li><li> Identifizieren Sie ROI in Bezug auf Gitterstäben. Finder Gitter können hilfreich sein für die Festlegung Koordinaten von Zielstrukturen. </li><li> Erwerben Sie Bilder von positiven Kennzeichnung auf dem Abschnitt eines Vollfarbdigitalkamera mit der Kameraeinstellung auf &quot;FL Auto-Farbe&quot; und &quot;Weißabgleich&quot; eingestellt bei 3.200K verwenden. Verwenden Sie die Kamera in &quot;Automatische Belichtung&quot; Modus mit einem &quot;Gamma&quot; Einstellung zwischen 0,45 und 1,00, das Aussehen der Bilder und &quot;Analog Gain&quot; auf 1x eingestellt zu optimieren.Klicken Sie auf das Kamera-Symbol in der Zen 2 Lite Software grafische Schnittstelle zu &quot;Live&quot;, das Bild scharf und klicken Sie auf &quot;Snap&quot; das Bild in den Bildspeicher zu erfassen. </li><li> Speichern Sie die Bilder als TIF-Dateien Kompression und pixelation zu vermeiden, zeichnet sich ab. </li><li> Vorbereiten eines Druck die Position des ROI in Bezug auf die Gitterstäbe oder andere bedeutende Teilpunkte zeigt. Diese Drucke werden für nachfolgende Navigations des Abschnitts und Wiederfindungs ​​ROIs durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) nützlich sein. </li><li> Entfernen Sie das Gitter aus der Folie, waschen in destilliertem Wasser und sanft die Kanten trocken tupfen. Hinweis: Nicht allzu intensive Beleuchtung verwenden, um Fluoreszenzbilder zu erwerben. Die Photostabilität von QD ermöglicht Aufnahmezeiten von bis zu ein paar Sekunden, aber darauf achten, nicht zu verlängern Exposition als Abschreckung des QD-Signal nach ca. 1 min in Wasser auftreten können. Extended oder dauerhafte Photo wird nur dann erhalten, wenn QD markierten Abschnitte dehydriert sind mit Toluol undunter Deckgläser gemäß den Vorgaben des Herstellers eingebettet. Allerdings wird dieser Prozess dann die Möglichkeit ausschließen, von Korrelat Prüfung des gleichen Abschnitts durch TEM. </li></ol></li></ol> 6. Transmissionselektronenmikroskopie <ol><li> TEM - Set Up und Viewing <ol><li> Übertragen, um das Raster zu dem TEM zur Untersuchung einer Beschleunigungsspannung von 100 kV verwendet wird. Verwenden geringer Vergrößerung von etwa 1,400X um das Netz zu navigieren und finden ROIs, die mit den Lichtmikroskopie Ansichten korrelieren. Ansicht Cluster von QD bei Vergrößerungen um 50.000-. </li><li> Beachten Sie einzelne QDs bei 70,000X Vergrößerung oder höher. Beachten Sie die QD als irreguläre Kristallstrukturen mit mäßiger Elektronendichte. </li></ol></li><li> Imaging <ol><li> Verwenden Sie eine Digitalkamera für TEM-Aufnahmen. Eine monochrome 1.392 x 1.040 Pixelsensor ist ausreichend. </li><li> Erwerben Sie Bilder durch die &quot;Kamera&quot; Symbol klicken auf &quot;On&quot; in der MICROscope grafische Oberfläche der Bildgebungssoftware, dann auf &quot;Aus&quot;, um das Bild in dem Bildspeicher zu speichern. Anmerkung: Diese Vorgänge unterscheiden sich auf dem Mikroskopsystem abhängig eingesetzt. Verwenden Sie die Kamera in automatischen Belichtungsmodus mit einer &quot;Gamma&quot; Einstellung von 1,00. </li><li> Speichern Sie die Bilder als TIF-Dateien. </li></ol></li></ol> 7. CLEM Imaging <ol><li> Auffinden eines Fluoreszenz - ROI durch TEM <ol><li> Verwenden Sie einen Druck aus dem Lichtmikroskop Bild zu lokalisieren ROIs durch TEM entspricht. Tissue architektonischen Merkmale wie Blutgefäße und luminalen Strukturen sind für die Navigation um den Abschnitt nützlich TEM. </li><li> Aufnehmen eines Bildes des entsprechenden ROI durch TEM. </li></ol></li><li> Clem Bild - Overlay <ol><li> Stellen Sie sicher, dass das TEM-Bild korrekt mit dem Lichtmikroskop Bild und korrigieren Sie die Erweiterung von jedem, so dass die gleiche Struktur gesehen in jeder Modalität die gleiche Größe orientiert ist. </li><li> Orientsie aßen die Lichtmikroskopie und TEM-Aufnahmen und zeigen Sie die Seite an Seite oder als Overlays die ultrastrukturelle Merkmale von immun ROIs zu markieren. </li><li> Erstellen Sie ein Overlay-Bild mit Photoshop CS2. Zunächst vergrößern die Fluoreszenzbild auf der gleichen Vergrößerung als Low-Power-TEM-Aufnahme. beide Bilder Orientieren und dann seitlich auf einer Leinwand an Seite einfügen. </li><li> Flatten das Bild. </li><li> Erstellen Sie die Fluoreszenz-Overlay von diesem zusammengesetzten Bild. Klicken Sie auf das &quot;Auswahlrechteck&quot;, wählen Sie das Fluoreszenzbild und erstellen daraus eine doppelte Schicht. </li><li> Stellen Sie die &quot;Ebenenstil / Blending Optionen&quot;, um 30 - 40% Transparenz. </li><li> Klicken Sie auf das &quot;Move Tool&quot; und ziehen Sie die Fluoreszenz-Overlay-Schicht über dem entsprechenden TEM-Aufnahme. Richten Sie die Bilder. </li><li> Nach der Ausrichtung zu erreichen &quot;Flatten&quot; die Schichten der endgültigen Overlay-Bild zu erzeugen. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Auswahlrechteck&quot;, um das neue Overlay-Bild ein zu wählennd kopieren Sie sie auf eine neue Leinwand. Speichern Sie diese als Tiff-Datei. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Diese Studie hat das Potenzial, Nutzen von QD als universelle Sonden für CLEM Studien nachgewiesen. Die 585 nm QD verwendeten Nanopartikel zeigten helle und stabile Fluoreszenz, wenn sie durch Weitfeld- Lichtmikroskopie betrachtet und wurden durch TEM leicht beobachtet. Eine frühere Studie von einem der Autoren dieses hat auch QD gezeigt für superauflösende Lichtmikroskopie 7 geeignet zu sein. Ihre Photo war besonders nützlich für längere Betrachtungszeiten und lange Abbildungs ​​Belichtungen. QD kann auch mi...

Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) ist ein leistungsfähiges Verfahren für die Analyse von transienten dynamischen Ereignissen 1, seltene Ereignisse 2, 3 und komplexe Systeme 4. Es gibt viele verschiedene technische Permutationen verfügbar 5 je nach Fragestellung jedoch aufgefordert, eine häufige Anforderung ist , dass die gleiche Struktur in einer einzigen Probe 6 durch mehrere Mikroskopie Modalitäten abgebildet wird. Unsere besondere Herangehensweise an Clem wurde für das Studium der Archiv menschlichen Pathologie Gewebe und den Fall entwickelt hier verwendet wurde , gut charakterisiert und bisher 7 veröffentlicht. Ziel war es zunächst, die analytischen Daten aus einer einzigen Biopsie oder chirurgische Probe und zum anderen zu maximieren, Fluoreszenzlichtmikroskopie verwenden, um den Kontext des immunzytochemischer Markierungsmuster auf ultrastruktureller Ebene gesehen zu helfen, zu klären. Quantenpunkt-Nanokristalle (QD) bieten das Potenzial eines universellen Markersystem able von beiden betrachtet werden, Fluoreszenzlichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie 8, 9, 10. ihrer kristallinen Kernstruktur ermöglicht QD unterschiedlicher Größe eine Vielzahl von Fluoreszenzemissionsspitzen zu erzeugen , wenn 11 durch Licht bei Wellenlängen weit von ihren Emissionsspektren angeregt. Deren Atomgewicht reicht Elektronendichte zu ergeben, die durch Transmissionselektronenmikroskopie, Rastertransmissions-Elektronenmikroskopie (STEM) oder Feldemissionsrasterelektronenmikroskopie detektierbar ist. Sie eignen sich besonders für immunzytochemische Studien geeignet , da auch einzelne QDs beobachtet werden kann eine ultimative Empfindlichkeit eines QD pro Ziel geben Molekül 12. Weiterhin verwendet auf der QD je können sie eine einzelne Elementar Signatur geeignet für die Zuordnung besitzen. Menschliche Pathologie Proben bieten erhebliche Vorteile für die translationale biomedizinische Forschung. Chirurgische Gewebe und Biopsieproben werden routinemäßig für Biobanken vorgelegt und mit geeignet friate Ethik Abstände können für Forschungsstudien zugegriffen werden. Menschliches Gewebe nicht über Fragen von Bedeutung oder Interpretation , die in tierischen oder in vitro - Modellen der Krankheit auftreten können. Jedoch die Probenvorbereitung der Pathologie Proben oft nicht optimal ist. Es kann in Fixiermittel verwendet unangemessen Verzögerung im Gewebe platziert Fixiermittel wie Formalin statt Glutaraldehyd für TEM und unangemessene Probenahme. Clem Methoden haben das Potenzial, die diagnostische und prognostische Informationen aus einer einzigen menschlichen Probe zu optimieren. Allerdings sind einige neu entwickelte Korrelat Ansätze , wie sie unter Verwendung von Mini - Singlet Sauerstoff - Generator (miniSOG) für den Einsatz in der Pathologie nicht verfügbar , da die Notwendigkeit für das Tag genetisch in die Zelle von Interesse 13 codiert werden. Aus diesem Grund haben wir die Nützlichkeit von QD Kennzeichnung von routinemäßig vorbereitet TEM Gewebe für die korrelative immunzytochemische Studien untersucht. QP angewandt geätzten Epoxid- oder Acrylharz-Abschnitte von lightly Aldehyd fixiert Biopsie und Gewebeproben bieten die Möglichkeit, Korrelat Fluoreszenzlichtmikroskopie und TEM-Daten aus einer einzigen Probe zu erhalten.

<table><tbody><tr><td>Natriumcacodylat</td><td>Proscitech</td><td>C0205</td><td>Schädliche Chemikalie</td></tr><tr><td>Osmiumtetroxid</td><td>Proscitech</td><td>C010</td><td>Nur im Abzug verwenden</td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>Univar-Ajax</td><td>569</td><td>Gefährliche Chemikalie</td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td> <td>Fronine</td><td>JJ008</td><td></td></tr><tr><td>Aceton 100%</td> <td>Fronine</td><td>JJ006</td><td></td></tr><tr><td>ERL 4221</td><td>Proscitech</td><td>C056</td><td></td></tr><tr><td>DER 732</td><td>Proscitech</td><td>C047</td><td></td></tr><tr><td>NSA</td><td>Proscitech</td><td>C059</td><td></td></tr><tr><td>DMAE</td><td>Proscitech</td><td>C050</td><td></td></tr><tr><td>Natriummetaperiodat</td><td>Analar BDH</td><td>10259</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Somatostatin-Antikörper</td><td>Dako</td><td>A0566</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper-Verdünnungsmittel</td><td>Dako</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 585 Streptavidin-Konjugat&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q10113MP</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper</td><td>Sigma</td><td>B7389-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd 50%</td><td>EMS</td><td>16320</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>PBS "Dulbecco A"</td><td>Oxoid&nbsp;</td><td></td><td></td>BR0014G</tr><tr><td>BSAc (10%)</td><td>Aurion</td><td>900.022</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney PP</td><td>M</td><td></td></tr><tr><td>pH Indikatorstreifen (pH 2,0 - 9,0)</td><td>Merck</td><td>1.09584.0001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroformen</td><td>Proscitech</td><td>RL063</td><td></td></tr><tr><td>Diamantmesser</td><td>Diatome</td><td>Ultra 45</td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop</td><td>FEI</td><td>Morgagni 268D</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzlichtmikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axioskop A1</td><td></td></tr><tr><td>Gitter 300 Mesh Nickel (dünner Balken)</td><td>Agar Scientific</td><td>G2740N</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>RMC</td><td>Powertome</td><td></td></tr><tr><td>TEM Kamerasteuerungssoftware</td><td>Soft Imaging System</td><td>AnalySIS</td><td>Version 3.0</td></tr><tr><td>Bildverarbeitungssoftware</td><td>Adobe Systems Integriertes</td><td>Photoshop CS2</td><td></td></tr></tbody></table>

korrelative light- und elektronenmikroskopie quantum dot nanopartikel

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Es wird ein Verfahren beschrieben, wobei Quantenpunkt (QD) Nanopartikel können für die korrelative immunzytochemische Studien der menschlichen Pathologie Gewebe unter Verwendung von Weitfeldfluoreszenzlichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) verwendet werden. Um zu demonstrieren, das Protokoll haben wir ultradünnem epoxy Abschnitte des menschlichen Somatostatinom Tumor immunmarkierten einen primären Antikörper gegen Somatostatin verwendet, gefolgt von einem biotinylierten sekundären Antikörper und Sichtbarmachung mit Streptavidin konjugiert ist 585 nm Cadmium-Selen (CdSe) Quantenpunkte (QD). Die Abschnitte werden auf einem TEM Objektgitter montiert dann durch Mikroskopie Weitfeld- Fluoreszenzlicht auf einen Glasträger zur Beobachtung angeordnet. Die Lichtmikroskopie zeigt 585 nm QD Kennzeichnung als leuchtend orange Fluoreszenz ein körniges Muster innerhalb der Tumorzelle Zytoplasma bilden. Bei niedrigen bis mittleren Bereich Vergrößerung durch Lichtmikroskopie die Markierungsmuster leicht erkannt werden kann, und die Höhe der nicht-spezifische oder Hintergrundmarkierung bewertet. Dies ist ein kritischerSchritt für die anschließende Interpretation der Immunomarkierung Musters durch TEM und Bewertung des morphologischen Kontext. Der gleiche Abschnitt wird dann trocken getupft und mit TEM betrachtet. QD Sonden gesehen in einzelnen sekretorischen Granula enthalten amorphes Material angebracht werden. Die Bilder werden aus der gleichen Region von Interesse (ROI) gesehen durch Lichtmikroskopie für die korrelative Analyse erworben. können Bilder von jeder Modalität entspricht, dann vermischt werden Fluoreszenzdaten auf TEM Ultrastruktur des entsprechenden Bereichs zu überlagern.

Die Somatostatinom Tumorprobe für diese Studie verwendet wurde, umfasste Tumorzellen duktalen Strukturen gemischt mit kollagenen Stoma-Gewebe zu bilden. Durch Fluoreszenzlichtmikroskopie, einzelne Tumorzellen, die reichlich Sekretgranula enthielten, zeigten eine positive Markierung für das Somatostatin-Hormon. Nuclei erschien als dunkle Löcher mit minimalen unspezifische Markierung nachweisbar (Abbildung 1). Bei niedrigen Vergrößerungen variabel intensive körnige Orangen...

Es wird ein Verfahren beschrieben, bei dem Quantenpunkt-Nanopartikel (QD) für korrelative immunzytochemische Studien von in Epoxid eingebettetem menschlichem Pathologiegewebe verwendet werden können. Wir verwenden kommerzielle Antikörperfragment-konjugierte QDs, die durch Weitfeld-Fluoreszenzlichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar gemacht werden.

Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, korrelative Licht- und Elektronenmikroskopiedaten (CLEM) zu erhalten, indem fluoreszenzimmunzytochematische Informationen mit der ultrasruckturellen Morphologie aus der Transmissionselektronenmikroskopie in einem einzigen Bild kombiniert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunzytochemie und Pathologie zu beantworten, beispielsweise, mit welcher subzellulären Struktur ein bestimmtes Protein von Interesse assoziiert ist. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass dieselbe Quantenpunkt-Nanopartikel-Sonde verwendet wird, um sowohl das Signal der Live-Mikroskopie vom Zielprotein als auch die strukturelle Lokalisation in der Elektronenmikroskopie zu erhalten.Nach der Fixierung, Einbettung und Schnittpräparation von menschlichem Somatostatinom-Tumorgewebe gemäß dem Textprotokoll bereiten Sie eine Schnittklebelösung vor, indem Sie 20 Zentimeter durchsichtiges Klebeband in eine 5-Milliliter-Flasche mit 2,0 Millilitern Aceton geben und 10 Minuten stehen lassen. Entfernen Sie das Klebeband und tauchen Sie ein Nickelgitter in die Lösung, nehmen Sie das Gitter anschließend heraus und lassen Sie es an der Luft trocknen. Sobald es trocken ist, benutzen Sie die stumpfe Seite des Gitters, um einen ultradünnen Schnitt aufzunehmen.Es ist entscheidend, die richtige Ätzzeit für die gewählte Harzformulierung zu bestimmen. 30 Minuten eignen sich gut für diese Formulierung, doch möglicherweise muss die Zeit für härtere oder weichere Formulierungen neu berechnet werden. Bereiten Sie ein Milliliter frische gesättigte Natriummetaperiodatlösung in destilliertem Wasser vor und geben Sie Tropfen der Lösung auf eine saubere Laborfolienoberfläche. Legen Sie vollständig trockene Objektträger mit Schnitten auf die Tropfen und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend überführen Sie die Objektträger für 60 Sekunden in Tropfen destillierten Wassers, um sie zu waschen. Um eine Antikörper- und Quantenpunkt- oder QD-Markierung auf einer sauberen Laborfolienoberfläche durchzuführen, pipettieren Sie Tropfen einer 0,05-molaren Glycin- und PBS-Lösung. Legen Sie die Objektträger auf die Tropfen und inkubieren Sie 10 Minuten lang, um verbleibende Aldehyde in den Schnitten zu blockieren. Um die Aldehyd-Blockade zu entfernen, tupfen Sie kurz den Rand des Objektträgers ab. Anschließend platzieren Sie den Objektträger 10 Minuten lang auf einem Tropfen mit einem Prozent normalem Ziegenserum (NGS) und einem Prozent BSAC in PBS.Bereiten Sie ein Milliliter Blockierungslösung vor, indem Sie 10 Mikroliter NGS und 100 Mikroliter BSAC zu 890 Mikrolitern PBS hinzufügen. Anschließend konditionieren Sie die Schnitte, indem Sie sie für 10 Minuten auf einen Tropfen Antikörperverdünnungslösung geben. Verdünnen Sie danach den polyklonalen Anti-Somatostatin-Antikörper im Verhältnis 1:10 mit der Antikörperverdünnungslösung und geben Sie die Objektträger auf Tropfen dieser Lösung.Inkubieren Sie in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur für eine Stunde. Entfernen Sie nach der Inkubation das Antikörperreagenz, indem Sie den Rand des Gitters abtupfen. Waschen Sie die Schnitte anschließend zwei Mal je fünf Minuten mit Antikörverdünnungspuffer.Nachdem das sekundäre Antik&ouml;rper im Verh&auml;ltnis 1 zu 10 verd&uuml;nnt und Tropfen vorbereitet wurden, inkubieren Sie die Gitter eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf den Tropfen. Entfernen Sie dann die Antik&ouml;rperl&ouml;sung und waschen Sie die Schnitte zweimal. Verd&uuml;nnten Sie die mit Streptavidin konjugierten QDs im Verh&auml;ltnis 1 zu 10 und inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur auf Tropfen der L&ouml;sung.Verwenden Sie anschließend Antikörverdünnungspuffer, um die Gitter zweimal für jeweils fünf Minuten zu waschen, und tupfen Sie die Ränder der Gitter ab. Waschen Sie danach die Gitter zwei Minuten lang mit destilliertem Wasser und tupfen Sie die Ränder trocken. Legen Sie den immungefärbten Gitterabschnitt in einen Wassertropfen auf einen Objektträger und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab.Um die Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen, setzen Sie einen Filterkubus mit den folgenden Eigenschaften ein und verwenden Sie eine 365 Nanometer LED-Beleuchtung. Legen Sie den immungefärbten Schnitt auf die Objektbühne des Immunfluoreszenzmikroskops. Werten Sie mit der Lichtmikroskopie das Färbemuster, das Ausmaß einer unspezifischen Färbung aus und stellen Sie sicher, dass die negativen Kontrollen frei von Färbung sind.Als Nächstes identifizieren Sie die ROI in Bezug auf die Gitterstreben. Stellen Sie dann eine vollfarbige digitale Kamera auf FL-Autofarbe ein und setzen Sie den Weißabgleich auf 3.200 K. Stellen Sie die Kamera auf den automatischen Belichtungsmodus mit einer Gamma-Einstellung zwischen 0,45 und 1,00, um das Erscheinungsbild der Bilder zu optimieren, und setzen Sie die analoge Verstärkung auf 1×. Klicken Sie im grafischen Interface der ZEN Two Light-Software auf das Kamerasymbol, um das Live-Bild zu aktivieren. Fokussieren Sie anschließend das Bild und klicken Sie im grafischen Interface der ZEN Two Light-Software auf „Snap“, um das Bild im Frame-Speicher zu erfassen.Speichern Sie die Bilder als TF-Dateien, um Komprimierung und Pixelierung zu vermeiden. Erstellen Sie einen Ausdruck, der die Position des interessierenden Bereichs (ROI) in Bezug auf die Gitterlinien oder andere bedeutende Gewebemarkierungen zeigt. Entfernen Sie anschließend das Gitter vom Objektträger, waschen Sie es mit destilliertem Wasser und tupfen Sie die Ränder vorsichtig trocken.Um die Transmissionselektronenmikroskopie durchzuführen, übertragen Sie das Objektträgergitter mit einer Beschleunigungsspannung von 100 Kilovolt zur Untersuchung in das Mikroskop. Beginnen Sie mit einer niedrigen Vergrößerung von etwa 1.400X, um sich auf dem Gitter zu orientieren und die ROIs zu finden, die zuvor mit der Lichtmikroskopie identifiziert wurden. Beobachten Sie einzelne QDs bei einer Vergrößerung von 70.000X oder höher.Sie erscheinen als unregelmäßige kristalline Strukturen mit mäßiger Elektronendichte. Anschließend mit einer Digitalkamera, die über einen monochromen 1.392 × 1.040 Pixel großen Sensor verfügt, im grafischen Interface der Aufnahmesoftware das Kamerapiktogramm einschalten und Bilder aufnehmen. Das Kamerapiktogramm in die Aus-Position bewegen, um das Bild im Frame-Speicher zu speichern.Um die CLEM-Bildgebung durchzuführen, verwenden Sie einen Ausdruck der Lichtmikroskopie-Bildgebung, um entsprechende ROI mittels TEM zu lokalisieren. Gewebearchitektonische Merkmale sind hilfreich zur Orientierung innerhalb des Schnitts. Erfassen Sie ein Bild der entsprechenden ROI mittels TEM.Als Nächstes, um ein CLEM-Bild vorzubereiten, stellen Sie sicher, dass das TEM-Bild korrekt ausgerichtet und auf dieselbe Größe und Auflösung wie das Lichtmikroskopbild vergrößert ist, in diesem Fall 300 Pixel pro Zoll. Vergrößern Sie die Leinwand des Lichtmikroskopbildes auf die doppelte Größe. Kopieren und fügen Sie dann das TEM-Bild neben das Fluoreszenzbild ein.Um eine Fluoreszenzüberlagerung in Photoshop CS2 zu erstellen, klicken Sie auf das rechteckige Auswahlwerkzeug, wählen Sie das Fluoreszenzbild aus und erzeugen Sie eine Duplikatschicht daraus. Passen Sie die Einstellungen für die Ebenenstil-Überblendung auf 30 bis 40 % Transparenz an. Klicken Sie dann auf das Verschieben-Werkzeug und ziehen Sie die Fluoreszenzüberlagerungsschicht über das entsprechende TEM-Bild, um die Bilder auszurichten.Nachdem Sie die Bilder ausgerichtet haben, glätten Sie das Bild, um die endgültige Überlagerung zu erzeugen. Verwenden Sie dann das rechteckige Auswahlwerkzeug, um das neue Überlagerungsbild auszuwählen, und kopieren Sie es auf eine neue Leinwand. Speichern Sie das Bild schließlich als tf-Datei.In diesem Fluoreszenzmikroskopiebild enthalten einzelne Somatostatinom-Tumorzellen reichlich sekretorische Granula und wurden positiv für das Somatostatinhormon markiert. Die Kerne erschienen als dunkle Löcher, und bei geringer Vergrößerung war im Zytoplasma eine variabel intensive, granulare, orangerote QD-Fluoreszenz zu sehen. Das mittels Lichtmikroskopie ausgewählte ROI wurde erkannt und mithilfe der TEM abgebildet, wobei auf ein 20×-Lichtmikroskopiebild als Orientierungshilfe zurückgegriffen wurde, wie hier dargestellt.Bei höherer Vergrößerung zeigt die Zelle eine helle Fluoreszenz und intensive QD-Markierung in zytoplasmatischen Granula. Die Überlagerung von Fluoreszenzdaten mit TEM-Aufnahmen, wie in diesem Beispiel dargestellt, deutet darauf hin, dass eine starke positive Markierung Granula entspricht, die mäßig elektronendichtes Material innerhalb der vesikulären Begrenzungsmembran enthalten. Schließlich zeigten die hier bei höherer Vergrößerung sichtbaren mäßig elektronendichten Granula eine intensive Immunmarkierung mit QD-Nanokristallen.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von acht Stunden durchgeführt werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Gitter vorsichtig nur an den Rändern anzufassen. Das Berühren des Schnitts beim Aufnehmen des Gitters kann dazu führen, dass der Schnitt vom Gitter abgelöst wird.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die multiplex Immunfärbung angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise, ob Ihr Protein des Interesses mit einem anderen Protein ko-lokalisiert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Pathologie den Weg, die Proteinsublokalisierung in archiviertem menschlichem Gewebe für die Elektronenmikroskopie zu untersuchen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man immunzytochemische Informationen aus der Fluoreszenzmikroskopie mit der Ultrastruktur aus der Transmissionselektronenmikroskopie kombiniert.Es sollte nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit Osmiumtetroxid äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzausrüstung, Arbeiten in einem Abzug und eine ordnungsgemäße Entsorgung von Abfällen sollten während dieses Verfahrens getroffen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die CLEM Technik angepasst worden, um ultrastrukturelle Morphologie der Membranen, Organellen und subzelluläre Strukturen mikroinjizierten Moleküle beeinflusst analysieren. Diese Methode kombiniert die leistungsstarke Techniken der Mikromanipulation / Mikroinjektion, konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Elektronenmikroskopie zu ermöglichen Millimeter bis multi-Nanometer-Auflösung. Diese Technik ist zugänglich für eine breite Vielzahl von Anwendungen.

Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM) als Werkzeug zur Visualisierung mikroinjiziert Moleküle und ihre Eukaryotic Sub-zellulären Targets

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Erweiterte Analyse der Zusammensetzung von Nanopartikel-Polymer Composites mittels direkter Fluoreszenz-Imaging

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Konfokale Hochdurchsatz-Bildgebung von quantenpunktkonjugierten SARS-CoV-2-Spike-Trimern zur Verfolgung von Bindung und Endozytose in HEK293T-Zellen

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Zweifarbige korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und Lysosomen

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Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

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