Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie
28. März 2014
Analyse der Nanopartikel Wechselwirkung mit definierten Untergruppen der Immunzellen durch Durchflusszytometrie.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der Durchflusszytometrie Wechselwirkungen von fluoreszierenden Nanopartikeln mit primären Immunzellsubpopulationen nachzuweisen. Dazu werden zunächst die Zellen der Untersuchung mit den Nanopartikeln behandelt. Im nächsten Schritt werden die Zellen mit Antikörpern gegen zellspezifische Oberflächenmarker markiert und anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert.
Schließlich kann die Wechselwirkung der Nanopartikel mit einzelnen Immunzellpopulationen gemessen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Mikroskopie besteht darin, dass mit ihr fluoreszenzintensitätsbedingte Variationen, die durch Nanopartikel hervorgerufen werden, in nicht-anklebenden Zellpopulationen quantifiziert werden können. Für die Aufnahme von Nanopartikeln in periphere Leukozyten oder gereinigte Monozyten beginnen Sie damit, fünf mal 10 hoch fünf der gewünschten Zellen pro Bohrung in einem Volumen von einem Milliliter pro Bohrung zu plattieren. Jede Bohrung einer 12-Loch-Platte.
Gegeben Sie dann 10 µL frisch hergestellter fluoreszierender Siliziumdioxid-Nanopartikel-Suspension in jede Versuchswell und fügen Sie zu diesem Zeitpunkt auch ein gleiches Volumen vollständigen Mediums in die unbehandelten Kontrollwells hinzu. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37 °C überführen Sie die Proben in einzelne 1,5-mL-Polypropylenröhrchen und zentrifugieren Sie die Proben drei Minuten lang bei 6.000 × g und Raumtemperatur, um die Zellen mittels CD14-Färbung zu markieren. Inkubieren Sie 100 µL jeder Zellsuspension mit 10 µL des menschlichen Antikörpers im Verhältnis 1:11 in Durchlaufpuffer für 10 Minuten bei 4 °C. Nach dem Waschen des nicht gebundenen Antikörpers in 1 mL Durchlaufpuffer resuspendieren Sie die Zellen in 200 µL frischem Durchlaufpuffer zur Durchflusszytometrie-Analyse.
Danach, um die spektrale Überlappungskompensation einzurichten, öffnen Sie das Geräte-Einstellfenster in der Durchflusszytometrie-Software und messen dann eine Antikörper-freie, nicht markierte Nanopartikel-Probe bei niedriger Fließgeschwindigkeit. Die Einstellung der Kompensation in Gegenwart fluoreszierender Nanopartikel ist der schwierigste Teil des Verfahrens, da die Nanopartikel die Seitenstreuung stören können. Um Erfolg sicherzustellen, muss manuell ein Tor (Gate) für die gewünschte Zellpopulation definiert werden. Passen Sie Streuung nach vorn und zur Seite manuell durch Regulierung der Spannungskanäle an. Anschließend zeichnen Sie ein entsprechend großes Gate um die gewünschte Zellpopulation.
Laden Sie eine weitere unmarkierte Probe auf und öffnen Sie den Kompensationsreiter im Geräte-Einstellungsfenster. Passen Sie den Kompensationsfaktor während der Datenaufnahme so lange an, bis die Fluoreszenzintensität im Übersprechkanal für die fluorochrompositiven und -negativen Populationen ungefähr gleich ist. Schließlich, nachdem die Kompensation für jeden einfach angefärbten Fluorochrom-Kontrollansatz eingestellt wurde, werden die nanopartikelbehandelten Proben analysiert, um das Verhalten der weißen Blutkörperchen gegenüber Nanopartikeln besser zu charakterisieren; hierzu wurden, wie gerade gezeigt, Internalisierungsassays durchgeführt.
Beispielsweise wurden in diesem repräsentativen Experiment drei Hauptsubpopulationen von Blut-Leukozyten mittels Vorwärts- und Seitenstreuung nach der Isolierung von PBMC eindeutig identifiziert. Darüber hinaus zeigten nach der Behandlung mit fz-Siliziumdioxid Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten unterschiedliche Raten der Nanopartikel-Aufnahme, wie durch ihre Fluoreszenzintensität angezeigt. In diesen Bildern wird die Aufnahme von Nanopartikeln in primäre, aus PBMC gereinigte CD14-positive Monozyten gezeigt.
Diese Streudiagramme zeigen CD14-positive Monozyten in Gegenwart von Fitzs Siliziumdioxid-Nanopartikeln. Das Histogramm veranschaulicht die Quantifizierung der fitzy-positiven Zellen, ausgedrückt als Fluoreszenzintensität. Ähnliche Internalisierungsexperimente wurden mit TP1-Monozyten durchgeführt, die mit steigenden Konzentrationen von Fitzs Siliziumdioxid-Nanopartikeln behandelt wurden, wobei unbehandelte Zellen als Negativkontrolle dienten.
Die Punktdiagramme zeigen die dosisabhängige Zunahme der Seitenstreuung bei unveränderter Vorwärtstreuung in der TP1-Zelllinie nach der Aufnahme von Nanopartikeln. Die Daten dieser Grafiken deuten darauf hin, dass die Behandlung mit den Siliziumdioxid-Nanopartikeln von Fitz eine dosisabhängige Internalisierung in Monozyten induziert, die durch die Erhöhung der intrazellulären Granularität verdeutlicht wird. Um weitere Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen Immunzellen und Nanopartikeln zu gewinnen, wurden Mikroglia sieben Tage lang in vitro kultiviert und anschließend eine Stunde mit Nanopartikeln inkubiert. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigte eine gemischte primäre Gliazellkultur mit einer großen Anzahl GFP-negativer, nicht-anklebender Astrozyten sowie einigen GFP-positiven Zellen.
In diesem repräsentativen Experiment konnten drei gliale Teilpopulationen mittels Durchflusszytometrie anhand einer einzigen CD11b-Antikörper-Färbung unterschieden werden: CD11b-negative, GFP-negative Astrozyten und andere gliale Zellen, mikrogliale CD11b-positive, GFP-negative Zellen sowie eine CD11b-positive, GFP-positive Teilpopulation. Letztere beiden Teilpopulationen sind in der Lage, Nanopartikel aufzunehmen, wobei die GFP-positive Population eine leicht erhöhte Aufnahmefähigkeit zeigt. Die Internalisierung von Nanopartikeln kann zusätzlich durch konfokale Mikroskopie bestätigt werden, wie in diesem Bild mit Stab-dominierten Siliziumdioxid-Nanopartikeln gezeigt.
Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Proben im Dunkeln zu halten, um eine Ausbleichung der fluoreszierenden Farbstoffe zu vermeiden, und die Proben während der Antikörperinkubation bei vier Grad zu lagern. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die konfokale Mikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur intrazellulären Lokalisation der Nanopartikel zu beantworten.
Übersicht
Diese Studie konzentriert sich auf die Wechselwirkung fluoreszierender Nanopartikel mit primären Immunzellsubpopulationen unter Verwendung der Durchflusszytometrie. Die Methode ermöglicht die Quantifizierung der Aufnahme von Nanopartikeln in verschiedene Immunzellen und liefert Einblicke in ihr Verhalten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Nanotechnologie
- Durchflusszytometrie
Hintergrund
- Nanopartikel können verwendet werden, um Wechselwirkungen von Immunzellen zu untersuchen.
- Die Durchflusszytometrie bietet Vorteile gegenüber der Mikroskopie bei der Quantifizierung von Fluoreszenz.
- Das Verständnis der Internalisierung von Nanopartikeln kann therapeutische Strategien unterstützen.
- Unterschiedliche Typen von Immunzellen können unterschiedliche Reaktionen auf Nanopartikel zeigen.
Zweck der Studie
- Die Interaktion von Nanopartikeln mit Unterpopulationen von Immunzellen analysieren.
- Die Internalisierungsraten von Nanopartikeln in verschiedenen Zelltypen quantifizieren.
- Das Verständnis der Immunantworten auf die Behandlung mit Nanopartikeln verbessern.
Verwendete Methoden
- Primäre Immunzellen wurden mit fluoreszierenden Siliziumdioxid-Nanopartikeln behandelt.
- Die Zellen wurden mit spezifischen Antikörpern für die Durchflusszytometrie markiert.
- Die Kompensationseinstellungen wurden angepasst, um Störungen durch die Nanopartikel auszugleichen.
- Internalisierungsassays wurden durchgeführt, um die Aufnahme der Nanopartikel zu bewerten.
Hauptergebnisse
- Unterschiedliche Populationen von Immunzellen zeigten variierende Raten der Nanopartikel-Internalisierung.
- Mittels Durchflusszytometrie ließen sich effektiv verschiedene Zelltypen anhand der Fluoreszenzintensität unterscheiden.
- Die Internalisierung wurde durch zusätzliche mikroskopische Verfahren bestätigt.
- Die Ergebnisse deuteten auf eine dosisabhängige Beziehung bei der Aufnahme von Nanopartikeln durch Monozyten hin.
Schlussfolgerungen
- Die Studie zeigt den Nutzen der Durchflusszytometrie bei der Analyse von Wechselwirkungen zwischen Nanopartikeln und Immunzellen auf.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis darüber bei, wie Nanopartikel Immunantworten beeinflussen können.
- Zukünftige Forschungsarbeiten könnten therapeutische Anwendungen von Nanopartikeln in der Immunologie untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die quantitative Beurteilung der Internalisierung von Nanopartikeln in primären Immunzellsubpopulationen und unterstützt die Zielvalidierung sowie die mechanistische Risikominderung bei der Entwicklung von Nanotherapeutika. Durch die Bereitstellung dosisabhängiger und zelltypspezifischer Aufnahmedaten verbessert sie die Vorhersagegenauigkeit in der frühen Entdeckungsphase und leitet Entscheidungen über die Fortführung oder Einstellung von nanopartikelbasierten Interventionen. Der Ansatz begegnet einer zentralen Herausforderung im Entdeckungsstadium: der Übersetzung von Wechselwirkungen zwischen Nanopartikeln und Zellen in handhabbare, reproduzierbare Kennzahlen zur Priorisierung von Entwicklungsprojekten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die Aufnahme von Nanopartikeln in verschiedene Immunzellsubpopulationen quantifiziert wird, wodurch geklärt wird, welche Zellpopulationen mit Nanotransportern interagieren.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die biologische Risikominderung durch standardisierte, reproduzierbare Messung der Internalisierung anhand von Fluoreszenzintensität und Verschiebungen des seitlich gestreuten Lichts.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten, indem Zelltypen mit hoher oder niedriger Affinität zu Nanopartikeln identifiziert werden, was die Auswahl geeigneter Zielstrukturen für immunmodulatorische Nanotherapien leitet.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte Immunzellsysteme für die nachgeschaltete Untersuchung vor, indem Basisprofile der Wechselwirkungen mit Nanopartikeln etabliert werden.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt Fluoreszenzintensitäts- und SSC-Metriken, die standardisierte und vergleichbare Messwerte über verschiedene Bedingungen und Zeitpunkte hinweg ermöglichen.
- Plattformwiederverwendung: Unterstützt skalierbare Untersuchungsabläufe durch konsistente Gating-, Kompensations- und Antikörpermarkierungsprotokolle, die auf verschiedene Nanopartikelformulierungen anwendbar sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Bedeutung für die Krankheitsforschung: Ermöglicht die Übertragung auf primäre Mikroglia aus mutierten Mäusen und damit zielgerichtete Untersuchungen von Nanopartikeln im zentralen Nervensystem an immunologischen Modellen mit Bezug zu Krankheiten.
- Translationale Kohärenz: Verknüpft Durchflusszytometrie-Daten mit der Bestätigung mittels konfokaler Mikroskopie und stärkt so die mechanistische Interpretation für die präklinische Validierung.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem differenzielle Aufnahmeraten aufgezeigt werden, beispielsweise durch veränderte Nanopartikel-Aufnahme in GFP-positive Mikroglia-Teilpopulationen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Bindungs-Screening-Phase bis zur präklinischen mechanistischen Bewertung ein, insbesondere für immunmodulatorische Nanotherapien, bei denen die Interaktionsprofile von Immunzellen entscheidend sind.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie die Exposition gegenüber Nanopartikeln mit messbaren Veränderungen der Zellgranularität und Fluoreszenz verknüpft und so die Mechanismen der Aktivierung oder Modulation von Immunzellen aufklärt.
- Screening: Stellt Bereitschaft für Assays sicher durch standardisierte Schritte der Isolierung, Markierung und Kompensation, die eine reproduzierbare Quantifizierung der Wechselwirkungen zwischen Nanopartikeln und Zellen gewährleisten.
- Analytik: Liefert quantitative abhängige Messgrößen (Fluoreszenzintensität, SSC-Verschiebungen), die den Vergleich der Internalisierung zwischen verschiedenen Zelltypen, Konzentrationen und Zeitpunkten ermöglichen.
- Translationale Forschung: Knüpft an die präklinische Validierung an, indem sie mittels orthogonaler Bestätigung durch konfokale Mikroskopie erfolgt und somit mit biomarkerbasierter, mechanistischer Risikominderung übereinstimmt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Methode für verschiedene Nanopartikelformate (z. B. FITC-SiO₂, Rhodamine-SiO₂) und Immunmodelle (menschliche Blutleukozyten, murine Mikroglia) und reduziert so redundante Methodenentwicklung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem zellulär aufgelöste, quantitative Daten zur Nanopartikel-Internalisierung bereitgestellt werden, wodurch die Zuversicht in immunmodulatorische Strategien erhöht wird.
- Operationaler Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Kompensationsprotokolle und Antikörper-Panels sicher und minimiert so die Variabilität zwischen Anwendern und Standorten.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem frühzeitig identifiziert wird, welche Immunzellsubpopulationen für die Bindung an Nanopartikel anfällig sind, wodurch biologische Risiken in späteren Entwicklungsphasen nanotherapeutischer Wirkstoffe reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung, indem Nanopartikelformulierungen hervorgehoben werden, die günstige oder ungünstige Interaktionsprofile mit Immunzellen aufweisen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kompensation der Durchflusszytometrie, insbesondere zur Behebung von durch Nanopartikel verursachten Interferenzen im Seitenstreulicht während der Korrektur spektraler Überlappungen.
- Setzt den Zugang zu Durchflusszytometern mit Fluoreszenz- und Streulichtdetektionsfähigkeit sowie Antikörpansetzungen zur Identifizierung von Immunzellsubpopulationen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Abstimmung der Gating-Strategien und Kompensationseinstellungen zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen, um eine konsistente Dateninterpretation zwischen Entdeckungs- und präklinischen Gruppen sicherzustellen.
- Erfordert bei der Anwendung auf verschiedene Modellsysteme (z. B. adhärente vs. nicht-adhärente Zellen, humane vs. murine Primärzellen) eine Anpassung, um die Zuverlässigkeit des Assays aufrechtzuerhalten.
- Praktische Einschränkung: Fluoreszenz- oder Streueigenschaften von Nanopartikeln können bestimmte Fluorochrome stören, was eine sorgfältige Panelgestaltung und Validierung der Kompensation erfordert, wie im Protokoll beschrieben.
