Name: Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung von Nanopartikel-Internalisierung in primären Immunzell-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Interaktionen mit Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten.

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Diese Arbeit wurde von der Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Deutschland) für die Förderung der Handschrift erkennen, Dr. Paolo Petrucciani (Abteilung für Immunhämatologie und Transfusionsdienst, Krankenhaus Lotti Pontedera, Pisa, Italien) für die Bereitstellung von menschlichen Buffy Coats und Prof. Massimo Pasqualetti (Fachbereich Biologie - Einheit der Zell-und Entwicklungsbiologie, Universität Pisa, Pisa, Italien) für die Unterbringung der Maus Kolonie.

Ethikerklärung Menschliche und tierische Proben wurden nach den Richtlinien des italienischen Gesundheitsministerium verarbeitet werden, das Gesetz 116/92 und die Richtlinie 86/609/EWG des Rates Europäischen Gemeinschaften. 1. Monozyten-Zellkulturen <ol><li> Kultur humanen THP-1-Zellen in T-75-Kolben mit RPMI-1640-Medium mit 10% Humanserum, 50 U / ml Penicillin und 50 mg / ml Streptomycin, 0,05 mM β-Mercaptoethanol bei 37 ° C in 5% CO 2 ergänzt. </li><li> Split Kulturen, wenn konfluent (alle 3-5 Tage). </li></ol> 2. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus Buffy Coats <ol><li> Vor dem Start des Isolierungsprotokolls, wird eine Lösung aus phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,2, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,5% Rinderserumalbumin (BSA), Zugabe von 5 ml BSA-Stammlösung zu 95 ml Waschpuffer gewaschen (1: 20 Verdünnung). Entgasen Sie den Puffer und halten es kalt (2-8° C). WICHTIG: Wenn Entgasung der Puffer kann in weniger als optimale Ergebnisse führen, da Blasen können die Isolierung Spalte (siehe Schritt 3.2) zu blockieren. Hinweis: Antikoagulans Citrat-Dextrose-A Formel (ACD-A) oder Citrat-Phosphat-Dextrose (CPD) kann alternativ verwendet werden. Umgekehrt können andere Albuminproteine ​​oder Seren, die von anderen Arten BSA ersetzen. Verwenden Sie keine Puffer, die Ca 2 + oder Mg 2 +. </li><li> Erhalten Buffy Coats von gesunden Spendern (im Alter von 20-60 Jahren). </li><li> Vorbereitung 50 ml konische Röhrchen für Dichtegradientenzentrifugation. Bestimmen Sie die Anzahl der Rohre für die Bearbeitung des Blutes (jede Röhre kann 35 ml verdünntem Blut zu verarbeiten) und 15 ml Ficoll-Paque jedem Leerrohr erforderlich. </li><li> Verdünnen 8 ml Blut mit 24 ml PBS / BSA / EDTA-Lösung (1:4 Verdünnung). </li><li> Sorgfältig Schicht der verdünnten Lösung auf Ficoll-Paque (Dichte = 1,077 g / ml) in jedem der 50 ml konische Röhrchen. Mischen Sie nichtBlut und Ficoll-Paque. WICHTIG: Um eine Vermischung von Blut und Ficoll-Paque zu vermeiden, halten Sie die Röhre in einem 45 °-Winkel und die Schicht langsam das Blut-Gemisch. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 30 min bei 4 ° C. Mononukleären Zellen (MNCs) wird an der Plasma-Ficoll-Paque-Schnittstelle wohin Granulozyten und Erythrozyten Sediment aufgrund höherer Dichte zu dem osmotischen Druck der Ficoll-Paque bleiben. </li><li> Übertragen die Interphasezellen (Periphere mononukleare Blutzellen, PBMCs) in eine neue 50-ml-Röhrchen mit PBS / BSA / EDTA und zentrifugieren für 10 min bei 300 xg gefüllt bei 4 ° C. </li><li> Zweimal Waschen des Pellets mit PBS / BSA / EDTA auf Thrombozyten zu entfernen. Spin bei 200 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Kultur die Zellen in RPMI-1640 mit 10% Humanserum und Antibiotika oder fahren Sie mit Monozyten Reinigung. </li></ol> 3. Reinigung von Primär Monozyten aus PBMCs <ol><li> Isolieren Monozyten aus PBMCs durch magnetische Trennung mit Wulst Humein Pan Monozyten Isolation Kit: <ol><li> Pass Zellen durch eine 30 um Nylon-Mesh (Vorabscheidefilter, 30 um), um mögliche Zellklumpen zu entfernen. </li><li> Bestimmen der Zellzahl mit einer Zählkammer. </li><li> Zentrifuge Zellsuspension bei 300 × g für 10 min bei Raumtemperatur (RT). Absaugen des Überstandes. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in 30 ul PBS / EDTA / BSA-Puffer pro 10 7 Zellen insgesamt. </li><li> In 10 ul FcR Blocking-Reagenz pro 10 7 Zellen insgesamt. </li><li> In 10 ul Biotin-Antikörper-Cocktail pro 10 7 Zellen insgesamt. </li><li> Gut mischen und Inkubation für 5 min bei 2-8 ° C </li><li> In 30 ul Puffer pro 10 7 Zellen insgesamt. </li><li> In 20 ul Anti-Biotin MicroBeads pro 10 7 Zellen insgesamt. </li><li> Gut mischen und Inkubation für 10 min bei 2-8 ° C </li><li> Resuspendieren bis 10 8 Zellen in 500 ul PBS / EDTA / BSA-Puffer. </li></ol></li><li> Magnetische separation <ol><li> Entsprechend der Gesamtzellzahl, wählen Sie eine geeignete MACS Säulen-und MACS Separator (siehe Spalte MACS Datenblatt). </li><li> Die Säule im Magnetfeld des MACS Separator. </li><li> Vorbereitung Säule durch Spülen mit der entsprechenden Menge an PBS / EDTA / BSA-Puffer (MS Säulen: 500 ul; LS Säulen: 3 ml). Hinweis: Die Spalten sind &quot;Flow Stop&quot; und nicht trocken laufen. </li><li> Gelten Zellsuspension auf die Säule. Sammeln Durchfluss unmarkierten Zellen enthält, die die angereicherte Monozytenfraktion. </li><li> Mit PBS / EDTA / BSA-Puffer (500 ul für MS und 3 ml für LS pro Waschgang) waschen Spalte 3x. </li><li> Sammeln unmarkierte Zellen, die passieren, die die angereicherte Monozyten-Zellen und in den Durchfluss von Abschnitt 3.2.4. Hinweis: durch Zugabe von PBS / EDTA / BSA-Puffer Aliquots nur, wenn die Spalte Behälter leer Waschen Sie die Spalte. </li><li> (Optional) Säule entfernen von derAbscheider und legen Sie es auf einem geeigneten Sammelrohr. Pipettieren Sie den Puffer auf die Säule (MS Spalten: 1 ml; LS Spalten: 5 ml). Unmittelbar spülen die magnetisch markierten Zellen durch nonmonocyte fest drückt den Kolben in die Spalte. </li><li> Kultur gereinigt Monozyten in vollständigem RPMI-1640 mit 10% Humanserum und Antibiotika. </li></ol></li></ol> 4. Reinigung von Primär Monozyten aus Vollblut <ol><li> Reinige Monozyten aus Vollblut mit Vollblut Monozyten-Isolation Kit nach Herstellerangaben. </li></ol> 5. Nanopartikel Internalisierung in Blood Leukozyten und Monozyten Gereinigtes <ol><li> Platte 5 x 10 5 Zellen / ml (1 ml / Vertiefung) der isolierten PBMCs oder gereinigten CD14-positive Monozyten in einer 12-Well-Platte. </li><li> Vortex FITC-SiO 2-Nanopartikel-Stammlösung und resuspendieren in Vollmedium auf eine Arbeitskonzentration von 100 nM. </li><li> In 10 ul Arbeits NanOpArtikel Suspension (100 nM) für behandelte Proben ein Nanopartikel Endkonzentration von 1 nM zu erreichen. Das gleiche Volumen von Komplettmedium für den unbehandelten Kontrollen zu jedem Well. </li><li> Nach 1 h Internalisierung Sammeln der Proben in einem 1,5 ml Polypropylen-Röhrchen und zentrifugieren für 3 min bei 6000 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Mit 1 ml Laufpuffer 3 min bei 6.000 × g bei RT Waschen des Pellets. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 200 ul Laufpuffer. Die Zellen sind nun bereit für das Lesen mittels Durchflusszytometrie. </li></ol> 6. Isolation of Primary Mixed Gliazellen Kulturen (Siehe Bertero et al. 7) 7. Replattierung eine Mixed Gliazellen Confluent Zellkultur <ol><li> Eine T-75-Kolben einmal (w / o Ca 2 + / Mg 2 +), wäscht mit 10 ml PBS gewaschen, dann mit 10 ml Versene und bei 37 ° C für 5-7 min. </li><li> Den Überstand abpipettieren und unten mehrere Male, um die Zellen von der T-75-Oberfläche zu lösen und zu lösenZellaggregate. </li><li> Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml Polypropylenröhrchen. Sammeln Sie eine kleine Menge der Zellsuspension, die Zellen mit einer Zählkammer zählen. </li><li> Zentrifugieren der Zellsuspension für 5 min bei 300 · g bei RT. </li><li> Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in einer Endkonzentration von 5 x 10 5 Zellen / ml in vollständigem Kulturmedium Gliazellen. </li><li> Platte 0,5 ml / Well in einer 24-Well-Platte und lassen die Zellen absetzen für 2-4 Stunden vor der Nanopartikel-Behandlung. </li></ol> 8. Internalisierung Nanopartikel in Mikrogliazellen <ol><li> Gib 500 ul vollständiges Gliazellen Kulturmedium (für unbehandelte Kontrolle) oder 500 ul einer 2x Rhodamin-SiO 2-Nanopartikel-Suspension in Gliazellen vollständige Kulturmedium (für behandelte Proben) zu jeder Vertiefung. </li><li> Pipettieren Sie die Zellen, um die Ablösung der nonrapid haftenden Zellen bei den gewählten Zeitpunkten zu ermöglichen und sammeln sie in 2 ml Polypropylen-Röhrchen. </li><li> In 500 ulVersene in jede Vertiefung und Inkubation der Platte bei 37 ° C für 5 min, dann trennen Sie die restlichen Zellfraktion und sammeln jede Probe mit den entsprechenden nicht-anhaftenden Zellen der vorherigen Schritt. </li><li> Sie die Proben für 3 min bei 300 · g bei RT. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 100 ul AutoMACS Laufpuffer. </li></ol> 9. Die Färbung mit CD11b-VioBlue <ol><li> Werden 10 ul VioBlue-CD11b Mensch / Maus-Antikörper zu 100 &amp;mgr; l Zellsuspension (1.11 Verhältnis) in Laufpuffer und Inkubation 10 min bei 4 ° C. </li><li> 1 ml Laufpuffer und mischen die Zellsuspension. </li><li> Zentrifuge jede Probe für 3 Minuten bei 300 x g. </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet in 100-150 ul Laufpuffer. </li><li> Lesen Sie die Proben an das Durchflusszytometer (lagern die Proben bei 4 ° C zwischen den beiden letzten Stufen). WICHTIG: Vor der Analyse der Proben, auf den Ersatz des überlappenden Signalen gehen in-Emissionsspektren von verschiedenen Fluorochromen (Fluorochrom-konjugierten Nanopartikel oder Antikörper) beobachtet. </li></ol> 10. Spectral Spill Over Compensation <ol><li> Öffnen Sie den &quot;Geräteeinstellungen&quot;-Box (in allen Instrument-Software-Programme vorhanden). Hinweis: Wenn Sie ein anderes Instrument aus dem in der Materialtabelle gemeldet Sie bitte der gerätespezifischen Handbuch für den Erwerb Details. </li><li> Erwerben unbehandelten Probe (ohne Nanopartikel) bei niedrigen Fluidgeschwindigkeit (wenn von dem Gerät erlaubt). Während der Erwerb, die manuell nach vorne durch die Regelung der Spannungskanäle einstellen und Seitenstreuung (FSC und SSC, beziehungsweise). Hinweis: Ändern Sie die Achsenskalen SSC und FSC, um die komplette Zellpopulation in der Handlung am besten visualisieren. Ein Instrument Einstellung Vorlage für jeden Zelltyp von Interesse können erstellt, gespeichert und für zukünftige Akquisitionen eingesetzt. </li><li> Öffnen Sie die spezifischen&quot;Region&quot;-Reiter in der Software. Zeichnen Sie eine geeignete große Region (&quot;Tor&quot;) um den gewünschten Bevölkerung. Hinweis: Internalisierung von Nanopartikel induziert eine SSC Verschiebung der Zellen. Wenn das Tor zu eng um die Zellpopulation von Interesse beschränkt ist, werden die erfassten Daten wahrscheinlich vermissen Teil der Zellen erkannt werden. </li><li> Verwenden Sie zwei ungefärbten Proben, eine für die Verwendung als Blindprobe und ein Ersatzanspruch gegen PI-Färbung (optional), ein Einzel-gefärbten Probe mit der entsprechenden Fluorochrom für jeden Fluoreszenzkanal ausgeglichen werden. Hinweis: Verwenden Sie einen anderen 1,5 ml Probenröhrchen für jedes Fluorochrom-konjugierte Antikörper im Experiment Kennzeichnung verwendet werden. </li><li> Öffnen Sie die &quot;Vergütung Registerkarte&quot; in der &quot;Geräteeinstellungen&quot; ein. Erhöhen oder verringern den Kompensationsfaktor bei der Akquisition bis die Fluoreszenzintensität in der Spillover-Kanal ist in etwa das gleiche für das Fluorochrom postive und negative Bevölkerung. </li><li> Erwerben Nanopartikel-behandelten Proben nach dem Ausgleich wurde angepasst. </li></ol>

<ol><li>Zhang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+nanomaterials+and+biological+systems%3A+Implications+to+personalized+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to personalized nanomedicine.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 1363-1384 (2012).</li>
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<li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+functionalisation+regulates+polyamidoamine+dendrimer+toxicity+on+blood-brain+barrier+cells+and+the+modulation+of+key+inflammatory+receptors+on+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Surface functionalisation regulates polyamidoamine dendrimer toxicity on blood-brain barrier cells and the modulation of key inflammatory receptors on microglia.</a> Nanotoxicology. 8, 158-168 (2013).</li>
<li>Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+of+engineered+nanoparticles+with+in+vitro+toxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Interference of engineered nanoparticles with in vitro toxicity assays.</a> Arch. Toxicol. 86, 1123-1136 (2012).</li>
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<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+andgreen+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion andgreen fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass Miltenyi Biotech GmbH hat die Einreichung dieser Arbeit gefördert. HiQ-Nano Company ( <a href="http://www.hiq-nano.com/index.html">http://www.hiq-nano.com/index.html</a> ) ist ein Spin-off-Unternehmen der Nanotechnologie aus IIT entstanden.

Das experimentelle Protokoll zeigt sehr wichtige Punkte berücksichtigt werden. Es ist wirklich wichtig, bei 4 ° C (auf Eis) und möglicherweise in der Dunkelheit in all den Färbeschritte arbeiten, weil höhere Temperaturen und Licht kann sich negativ auf die Färbung Ausbeute. Nanopartikel könnten beschallt werden, um kurz vor der Verwendung besser resuspendiert werden. Eine korrekte Durchflusszytometrie Analyse erfordert eine korrekte Kalibrierung in den verschiedenen Kanälen. Die Kalibrierung des Gerätes sollte vor jeder experimentellen Sitzung durchgeführt werden. Neben den technischen Problemen mit der Instrumentierung, kann es auch Probleme mit der Antikörpermarkierung sein. Es ist zwingend erforderlich, um den Antikörper in einer geeigneten Konzentration zu verwenden. Ist die Konzentration zu hoch oder zu niedrig ist, kann unbefriedigend Signalintensitäten die Folge sein. Die Nachteile dieses Verfahrens betreffen die Notwendigkeit des Arbeitens mit monodispersen Proben, die Unfähigkeit zu lokalisierenUrsprungsort des Signals (dh verschiedene zelluläre Kompartimente). Es gibt auch einige Grenzen bei der Auswahl von Fluorochromen, die in Kombination verwendet werden: die Wellenlänge der Anregungs-und Emissionsbanden ausreichend getrennt sein, um ihre entsprechende Mess ermöglichen. Wenn die verwendete Antikörper Spektren überlappen, wird eine korrekte Kompensation erforderlich. Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges Verfahren zur Zellanalyse in Gegenwart oder Abwesenheit von Nanopartikeln. Diese Technik erlaubt eine multi Untersuchung einer Zelle, eine hohe Anzahl von Ereignissen untersucht, Schnelligkeit der Analyse (mehr als 1.000 Zellen / sec), Reproduzierbarkeit und statistische Messwerte. Proben können, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen verarbeitet werden. Durch die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nanoteilchen ist es möglich, in Zellpopulationen, die durch spezifische Marker auf der Zellmembran exponiert identifiziert qualifizieren und zu quantifizieren, die Internalisierung. Zellparameter können in Anwesenheit von s ändern<html> pecific Nanopartikel. Je nach Ziel der Forschung können diese Variationen verwendet, um ein spezifisches Phänomen zu identifizieren, wie Seitenstreuung der Zellen, die proportional mit der Erhöhung der Nanopartikel Internalisierung Rate erhöht werden. Nanopartikel-induzierte Modifikationen der Zelloberfläche kann auch einen Einschränkung der Technik. Aus diesem Grund müssen Zellmembranrezeptoren Umsatz immer in Betracht gezogen werden und möglicherweise im Voraus bekannt ist, genau zu charakterisieren die Zellpopulation von Interesse. Extreme Beeinträchtigungen der Membranosmose in Nanopartikel überlastet Proben können zum Zelltod führen. Nanomaterial dosisabhängigen Toxizität sollte empirisch für jede Zellpopulation getestet werden. Klar definierte toten Zellen müssen aus dem Fluoreszenz Quantifizierung ausgeschlossen werden. Beispielsweise ist Annexin V / PI-Färbung eines der mehreren Verfahren in der Regel verwendet, um sowohl nekrotische und apoptotische Zellen zu detektieren. &quot;&gt; GFP-exprimierenden Primärzellen sind auch ein leistungsfähiges Werkzeug, um eine bestimmte Zellpopulation wählen und Daten sammeln, ohne prelabeling. Die Kombination mit komplementären fluoreszierende Nanopartikel ermöglicht eine sehr schnelle und präzise Quantifizierung der Nanopartikel-Zell-Interaktion. Drug oder Gentransfer wird gedacht, um in der Zukunft durch die Anwendung von Nanopartikeln in der Lage, eine bestimmte Arzneimittelmenge in ausgewählten Geweben frei verbessert werden. Beschäftigung von Nanopartikeln als spezifische Liefer Trägern und / oder Immunmodulatoren für Pharmazie erfordert die Kenntnis der biologischen Umgebung (zB durch Durchflusszytometrie) Zell-Nanopartikel-Interaktionen zu untersuchen.

Nanomaterialien werden heute inspiriert das Interesse der Lebenswissenschaftler für potentielle Anwendungen der Biomedizin ein. Eine Vielzahl von anorganischen und organischen Materialien verwendet werden, um Nanostrukturen mit unterschiedlichen Formen, physikalische und chemische Eigenschaften zu erzeugen. Unter diesen Strukturen, Nanopartikel von Kugelform gezeigt, ein großes Potenzial für diagnostische und translationale Medizin 2. Ihre Kern-und Oberflächengestaltung sind durch eine mögliche Anwendung angetrieben und impliziert eine tiefgreifende Untersuchung der Zielzelle Reaktionen nach Nanopartikel Kontakt und Interaktion. Nanopartikel, die vermutlich absichtlich an Menschen verabreicht wird, in direktem Kontakt mit mehreren Typen von Immunzellen sind. Ihre Verantwortung, um den Körper Integrität zu erhalten macht sie zu einem entscheidenden Thema der Untersuchung in der Nanomedizin 3. Die zelluläre Teil des angeborenen Immunsystems ist vor allem durch phago vertretenzyten. Unter ihnen der Monozyten / Makrophagen-Linie abgeleiteten Zellen, einschließlich der zentralen Nervensystems ansässig Mikroglia, eine wichtige Rolle in der Immunabwehr 4,5. Sie sind in der Lage, Schutz Antworten innerhalb weniger Stunden nach der Begegnung mit Fremdkörpern auslösen. Darüber hinaus sind die Monozyten zu koordinieren und beauftragen die adaptive Immunantwort durch die Freisetzung von Zytokinen. Alle diese Ereignisse auftreten, auch in Gegenwart von synthetischen Materialien, die im Wesentlichen als &quot;Nicht-Selbst&quot; durch das Immunsystem 6 wahrgenommen werden. Unter den historisch in der Immunologie für die Zellanalyse verwendeten Methoden, Durchflusszytometrie ist eine der mächtigsten Werkzeuge. Darüber hinaus ist die Verfügbarkeit von Technologien zur Identifizierung oder Reinigung einer spezifischen Immun Subpopulation (oft die Nutzung der Ausschluss oder die Anwesenheit einer einzigen Membran-Protein) ermöglicht eine genaue Untersuchung der Auswirkungen eines bestimmten Nanopartikel auf, dass insbesondere Primär cell Typ 7. Jedoch können Zellen physiologische und morphologische Veränderungen nach der Exposition mit Nanopartikeln zu präsentieren. Wie gut, kann Nanopartikeln mit spezifischen optischen Parameter wie Absorption oder Emission von Licht bei definierten Wellenlängen stören, die Beeinflussung der Ergebnisse 8. Also, sollten Grenzen der Nutzung und eventuellen Anpassungen der klassischen immunologischen Tests auf die Untersuchung von neuen Materialien berücksichtigt werden. Diese Arbeit bezieht sich auf die Erfassung von Nanopartikel-Interaktionen mit primären Immunzellen mittels Durchflusszytometrie. Um dieses Problem zu lösen, 50 nm FITC-SiO 2-Nanopartikel wurden als Modell Nanomaterialien, um die Methode zu beschreiben beschäftigt. Silicapartikel können in einer sehr präzisen Art und Weise im Nanometerbereich erzeugt werden. Größe, Form und Oberflächeneigenschaften wie Ladung oder Hydrophobie, fein abgestimmt werden, um ihre Biokompatibilität 9 erhöhen. Viele Funktionen von SiO 2-Nanopartikel es ihnen ermöglichen, als verwendet werdenModell für die Arzneimittelabgabe Partikel 10. Darüber hinaus können Fluoreszenzfarbstoffen oder Quantenpunkte eingeschlossen oder an diese Partikel bietet nützliche Werkzeuge für Nano-Bildgebung 11 verknüpft werden.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td>Warm in 37°; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (ATCC modifiziert)</td><td>Gibco</td><td>A10491-01</td><td>Warm in 37 &Grad; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>DMEM, High Glucose, Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin, Flüssigkeit</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum (lot n&deg; 1131917)</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 2,5%</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Human Pooled Serum</td><td>Invitrogen</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Invitrogen</td><td>15040-033</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-VioBlue Mensch & Maus</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-336</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stock Lösung&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Spüllösung&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>Laufpuffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-747</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Laufpuffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Pan-Monozyten-Isolationskit&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-537</td><td></td></tr><tr><td>Vollblut-Säulen-Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-545</td><td></td></tr><tr><td>CD14-Mikroperlen aus Vollblut, menschlich</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-879</td><td></td></tr><tr><td>MS-Säule</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>LS-Säule</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS-Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Lösung zur Lyse roter Blutkörperchen&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>Vorabscheidefilter 30 & Mikro; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer Durchflusszytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-197</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Kalibrierperlen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-607</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>GEH17544202</td><td></td></tr><tr><td>FITC-SiO2 Nanopartikel (50 nm, +45 mV)</td><td>HiQ-Nano Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhodamin-SiO2 Nanopartikel (50 nm, +45 mV)</td><td>HiQ-Nano Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platte Falcon</td><td>Becton Dickinson</td><td>353043</td><td></td></tr></tbody></table>

detektion von fluoreszierenden nanopartikel wechselwirkungen mit primären immun-zell-subpopulationen durch durchflusszytometrie

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Nanopartikel sind mit sehr viel versprechende Eigenschaften für therapeutische und diagnostische Zwecke dotiert. Diese Arbeit beschreibt eine schnelle und zuverlässige Methode der Analyse mittels Durchflusszytometrie, um Nanopartikel Interaktion mit Immunzellen zu studieren. Primäre Immunzellen können leicht von Mensch oder Maus-Geweben durch Antikörper-vermittelte magnetische Isolierung gereinigt werden. Im ersten Fall können die unterschiedlichen Zellpopulationen in einem Durchflußzytometer ausgeführt von der Vorwärtsstreulicht (FSC), die proportional zur Zellgröße und der Seitenstreulicht (SSC), bezogen auf internen Komplexität der Zelle unterscheiden. Weiterhin fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen spezifische Zelloberflächenrezeptoren ermöglichen die Identifizierung mehrerer Subpopulationen innerhalb der gleichen Probe. Oft, alle diese Funktionen variieren, wenn die Zellen durch äußere Reize, die ihre physiologischen und morphologischen Zustand ändern gesteigert werden. Hier, 50 nm FITC-SiO 2-Nanopartikel als Modell verwendet werden, um th zu identifizierenE Internalisierung von nanostrukturierten Materialien im menschlichen Blut Immunzellen. Die Zellfluoreszenz-und Seitenstreulichtzunahme nach Inkubation mit Nanopartikeln uns erlaubt, Zeit-und Konzentrationsabhängigkeit der Nanopartikel-Zell-Interaktion zu definieren. Darüber hinaus können solche Protokoll erweitert werden, Rhodamin-SiO 2-Nanopartikel Wechselwirkung mit primären Mikroglia, die das zentrale Nervensystem resident Immunzellen, isoliert aus mutanten Mäusen, die speziell in den Monozyten / Makrophagen-Linie zu drücken das Green Fluorescent Protein (GFP) untersucht. Schließlich Durchflusszytometrie Daten Nanopartikel Internalisierung in die Zellen beziehen, die durch konfokale Mikroskopie bestätigt.

Durchflusszytometrie ist ein nützliches Werkzeug zur Identifizierung und Charakterisierung verschiedener Zellen, und es ist die Technik der Wahl, um spezifische Immunzellen, wie Monozyten, Granulozyten, T-Zellen, B-Zellen, natürliche Killerzellen (NK)-Zellen, dendritische Zellen (DCs) zu identifizieren, und andere Subpopulationen von Leukozyten. Bei den Bemühungen um eine bessere Charakterisierung weißen Blutkörperchen Verhalten in Reaktion auf Nanopartikeln, führten wir Internalisierung Assays mit primären Leukozyten aus dem Blut von gesunden Spendern (1 und 2) und mit menschlichen Monocyten-Zelllinie isoliert (THP-1-Zellen, Fig. 3) . Wie in 1A berichtet, die drei großen Blut Leukozyten-Subpopulationen wurden eindeutig durch Vorwärts-und Seitenstreuung nach PBMCs Isolierung identifiziert. Darüber hinaus wurde nach FITC-SiO 2-Behandlung, Lymphozyten (grau), Monozyten (blau) und Granulozyten (rot) haben eine andere nanoparticle Internalisierung Rate von grünen Fluoreszenzintensität (Abbildung 1B) gezeigt. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Reinigung von CD14-positiven primären Monozyten aus PBMCs. 2A berichtet die Durchflusszytometrie Punktdiagramm von CD14 + Monocyten in Gegenwart von FITC-SiO 2. 2B zeigt FITC-SiO 2-Internalisierung in dieselben Zellen quantifiziert und ausgedrückt logarithmischen Skala Histogramm. Ähnliche Experimente wurden an Internalisierung THP-1 Monozyten mit steigenden Konzentrationen von FITC-SiO 2-Nanopartikeln behandelt geführt. Unbehandelte Zellen wurden als negative Kontrolle verwendet. 3A zeigt eine Dosis-abhängige Zunahme der Seitenstreuung bei unveränderter Vorwärtsstreuung in THP-1-Zelllinie. In 3B zusammen mit den Histogrammen der SSC und FSC an jedem FITC-SiO 2-Nanopartikel-Konzentration getestet, mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) Quantifizierung wird vorgestellt. Diese Daten legen nahe, dass die Behandlung mit FITC-SiO 2-Nanopartikel induziert eine dosisabhängige Internalisierung in Monozyten durch die Erhöhung der intrazellulären Granularität (Seitenstreuung) und Fluoreszenz (Grün-Kanal) markiert. Um weitere Einblicke in die Art der Interaktion zwischen Immunzellen und Nanopartikeln zu gewinnen, wurden primären gemischten Glia-Kulturen isoliert und Mikroglia, die das zentrale Nervensystem Wohnsitz Immunzellen, wurde gereinigt. Die Verwendung eines transgenen Mausmodells grün fluoreszierenden Mikroglia exprimiert ermöglicht die Visualisierung der verschiedenen Neuroentzündungsmechanismen. Transgene Maus B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J in dieser Arbeit verwendeten drückt das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle des Promotors 12 CX3CR1. Nach 7 Tagen in vitro (DIV), der Fluoreszenzmikroskopie zeigt eine gemischte primäre Gliazellen Kultur mit einer großen Anzahl von Astrozyten (GFP negativen adhärenten Zells) und einige grüne Zellen (GFP positiv, 5A). GFP - - (Astrozyten und andere Gliazellen), eine zweite bestimmte Gruppe von Mikroglia-CD11b + GFP +-Zellen, und eine der ersten CD11b: In diesem Mausmodell, drei Glia-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie mit einem einzigen CD11b-Antikörper-Färbung unterschieden werden dritte CD11b +-GFP - Subpopulation (Fig. 4A). Die beiden letztgenannten Subpopulationen sind beide in der Lage, Nanopartikel mit einem leichten erhöhten Effizienz verinnerlichen durch die GFP + Bevölkerung (die den patrouillieren unreifen Mikroglia durch die Transkription von CX3CR1 Promotor), wie Durchflusszytometrie (4B) gezeigt. Die aufgetreten Internalisierung kann durch konfokale Mikroskopie mit der gleichen Endkonzentration von Rhodamin-SiO 2-Nanopartikel, wie in 5B gezeigt, überprüft werden. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Always&quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. FITC-SiO 2-Nanopartikel-Internalisierung in isolierten Blut Leukozyten. A) Repräsentative Vorwärtsstreuung (FSC) gegen die Seitenstreuung (SSC) Durchflusszytometrie Dot-Plot von Ficoll-Paque isoliert Blut Leukozyten. B) Grün-Fluoreszenz-Histogramm-Overlay Plot der drei großen Blut-Leukozyten Zell-Subpopulationen in Anwesenheit von 1 nM FITC-SiO 2-Nanopartikeln (45 mV) für 1 Stunde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 2. FITC-SiO 2-Nanopartikel-Internalisierung in CD14 + Monozyten gereinigt. A) Repräsentative Vorwärtsstreuung (FSC) gegen die Seitenstreuung (SSC) Durchflusszytometrie Dot-Plot von gereinigten CD14 positive Monozyten. B) Grün-Fluoreszenz-Histogramm Plot des gereinigten Monozyten-Subpopulation in Anwesenheit von 1 nM FITC-SiO 2-Nanopartikeln (45 mV) für 1 Stunde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3.jpg" /> 3. Auswirkungen von FITC-SiO 2-Nanopartikel Internalisierung auf THP-1-Zellen. A) Repräsentative Vorwärtsstreuung (FSC) gegen die Seiten scattering (SSC) Durchflusszytometrie Dot-Plot von THP-1-Monozyten-Zelllinie, nach 1 h Exposition von FITC-SiO 2-Nanopartikel zunehmende Konzentration. B) Konzentrationsabhängige Variation der Seitenstreuung (SSC), Vorwärtsstreuung (FSC) und Grün Fluoreszenz in Gegenwart von FITC-SiO 2-Nanopartikeln (45 mV) für 1 Stunde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4.jpg" /> 4. Rhodamin-SiO 2-Nanopartikel-Internalisierung in primären Mikroglia aus B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J-Mäusen isoliert. A) Green Fluorescent Protein (GFP) gegen CD11b-VioBlue Durchflusszytometrie Dot-Plot von primary gemischten Glia aus B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J-Mäusen isoliert. CD11b + GFP + und CD11b + GFP -. Populationen sind in der oberen rechten und unteren rechten Quadranten, bzw. B) Rot-Fluoreszenz-Histogramm-Overlay Grundstück von Mikroglia-Subpopulationen in Anwesenheit von 1 nM Rhodamin-SiO 2-Nanopartikeln (45 mV) für 30 gezeigt min (rote Histogramm) gegenüber der Kontrolle (grau Histogramm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5.jpg" /> 5. Visualisierung von GFP +-Mikrogliazellen. (A) Fluoreszenzmikroskopie bei 7 DIV und (B) konfokale MikroskopieRhodamin-SiO 2-Nanopartikel-Internalisierung (rote Pfeile) in GFP +-Mikrogliazellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Analyse der Nanopartikel Wechselwirkung mit definierten Untergruppen der Immunzellen durch Durchflusszytometrie.

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der Durchflusszytometrie Wechselwirkungen von fluoreszierenden Nanopartikeln mit primären Immunzellsubpopulationen nachzuweisen. Dazu werden zunächst die Zellen der Untersuchung mit den Nanopartikeln behandelt. Im nächsten Schritt werden die Zellen mit Antikörpern gegen zellspezifische Oberflächenmarker markiert und anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert.Schließlich kann die Wechselwirkung der Nanopartikel mit einzelnen Immunzellpopulationen gemessen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Mikroskopie besteht darin, dass mit ihr fluoreszenzintensitätsbedingte Variationen, die durch Nanopartikel hervorgerufen werden, in nicht-anklebenden Zellpopulationen quantifiziert werden können. Für die Aufnahme von Nanopartikeln in periphere Leukozyten oder gereinigte Monozyten beginnen Sie damit, fünf mal 10 hoch fünf der gewünschten Zellen pro Bohrung in einem Volumen von einem Milliliter pro Bohrung zu plattieren. Jede Bohrung einer 12-Loch-Platte.Gegeben Sie dann 10 µL frisch hergestellter fluoreszierender Siliziumdioxid-Nanopartikel-Suspension in jede Versuchswell und fügen Sie zu diesem Zeitpunkt auch ein gleiches Volumen vollständigen Mediums in die unbehandelten Kontrollwells hinzu. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37 °C überführen Sie die Proben in einzelne 1,5-mL-Polypropylenröhrchen und zentrifugieren Sie die Proben drei Minuten lang bei 6.000 × g und Raumtemperatur, um die Zellen mittels CD14-Färbung zu markieren. Inkubieren Sie 100 µL jeder Zellsuspension mit 10 µL des menschlichen Antikörpers im Verhältnis 1:11 in Durchlaufpuffer für 10 Minuten bei 4 °C. Nach dem Waschen des nicht gebundenen Antikörpers in 1 mL Durchlaufpuffer resuspendieren Sie die Zellen in 200 µL frischem Durchlaufpuffer zur Durchflusszytometrie-Analyse.Danach, um die spektrale Überlappungskompensation einzurichten, öffnen Sie das Geräte-Einstellfenster in der Durchflusszytometrie-Software und messen dann eine Antikörper-freie, nicht markierte Nanopartikel-Probe bei niedriger Fließgeschwindigkeit. Die Einstellung der Kompensation in Gegenwart fluoreszierender Nanopartikel ist der schwierigste Teil des Verfahrens, da die Nanopartikel die Seitenstreuung stören können. Um Erfolg sicherzustellen, muss manuell ein Tor (Gate) für die gewünschte Zellpopulation definiert werden. Passen Sie Streuung nach vorn und zur Seite manuell durch Regulierung der Spannungskanäle an. Anschließend zeichnen Sie ein entsprechend großes Gate um die gewünschte Zellpopulation.Laden Sie eine weitere unmarkierte Probe auf und öffnen Sie den Kompensationsreiter im Geräte-Einstellungsfenster. Passen Sie den Kompensationsfaktor während der Datenaufnahme so lange an, bis die Fluoreszenzintensität im Übersprechkanal für die fluorochrompositiven und -negativen Populationen ungefähr gleich ist. Schließlich, nachdem die Kompensation für jeden einfach angefärbten Fluorochrom-Kontrollansatz eingestellt wurde, werden die nanopartikelbehandelten Proben analysiert, um das Verhalten der weißen Blutkörperchen gegenüber Nanopartikeln besser zu charakterisieren; hierzu wurden, wie gerade gezeigt, Internalisierungsassays durchgeführt.Beispielsweise wurden in diesem repräsentativen Experiment drei Hauptsubpopulationen von Blut-Leukozyten mittels Vorwärts- und Seitenstreuung nach der Isolierung von PBMC eindeutig identifiziert. Darüber hinaus zeigten nach der Behandlung mit fz-Siliziumdioxid Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten unterschiedliche Raten der Nanopartikel-Aufnahme, wie durch ihre Fluoreszenzintensität angezeigt. In diesen Bildern wird die Aufnahme von Nanopartikeln in primäre, aus PBMC gereinigte CD14-positive Monozyten gezeigt.Diese Streudiagramme zeigen CD14-positive Monozyten in Gegenwart von Fitzs Siliziumdioxid-Nanopartikeln. Das Histogramm veranschaulicht die Quantifizierung der fitzy-positiven Zellen, ausgedrückt als Fluoreszenzintensität. Ähnliche Internalisierungsexperimente wurden mit TP1-Monozyten durchgeführt, die mit steigenden Konzentrationen von Fitzs Siliziumdioxid-Nanopartikeln behandelt wurden, wobei unbehandelte Zellen als Negativkontrolle dienten.Die Punktdiagramme zeigen die dosisabhängige Zunahme der Seitenstreuung bei unveränderter Vorwärtstreuung in der TP1-Zelllinie nach der Aufnahme von Nanopartikeln. Die Daten dieser Grafiken deuten darauf hin, dass die Behandlung mit den Siliziumdioxid-Nanopartikeln von Fitz eine dosisabhängige Internalisierung in Monozyten induziert, die durch die Erhöhung der intrazellulären Granularität verdeutlicht wird. Um weitere Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen Immunzellen und Nanopartikeln zu gewinnen, wurden Mikroglia sieben Tage lang in vitro kultiviert und anschließend eine Stunde mit Nanopartikeln inkubiert. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigte eine gemischte primäre Gliazellkultur mit einer großen Anzahl GFP-negativer, nicht-anklebender Astrozyten sowie einigen GFP-positiven Zellen.In diesem repräsentativen Experiment konnten drei gliale Teilpopulationen mittels Durchflusszytometrie anhand einer einzigen CD11b-Antikörper-Färbung unterschieden werden: CD11b-negative, GFP-negative Astrozyten und andere gliale Zellen, mikrogliale CD11b-positive, GFP-negative Zellen sowie eine CD11b-positive, GFP-positive Teilpopulation. Letztere beiden Teilpopulationen sind in der Lage, Nanopartikel aufzunehmen, wobei die GFP-positive Population eine leicht erhöhte Aufnahmefähigkeit zeigt. Die Internalisierung von Nanopartikeln kann zusätzlich durch konfokale Mikroskopie bestätigt werden, wie in diesem Bild mit Stab-dominierten Siliziumdioxid-Nanopartikeln gezeigt.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Proben im Dunkeln zu halten, um eine Ausbleichung der fluoreszierenden Farbstoffe zu vermeiden, und die Proben während der Antikörperinkubation bei vier Grad zu lagern. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die konfokale Mikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur intrazellulären Lokalisation der Nanopartikel zu beantworten.

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