Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, fluoreszierende Nanopartikel-Wechselwirkungen mit primären Immunzell-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie zu detektieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die interessierenden Zellen mit den Nanopartikeln behandelt werden. Im nächsten Schritt werden die Zellen mit Antikörpern gegen zellspezifische Oberflächenmarker markiert und anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Letztlich kann die Interaktion der Nanopartikel mit einzelnen Immunzellpopulationen gemessen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Mikroskopie besteht darin, dass mit dieser Technik Variationen der Fluoreszenzintensitäten, die durch Nanopartikel induziert werden, in nicht adhärenten Zellpopulationen quantifiziert werden können. Für die Internalisierung von Nanopartikeln in Blutleukozyten oder gereinigten Monozyten beginnen Sie mit der fünfmaligen Beschichtung von 10 bis zum Fünftel der interessierenden Zellen in einem Milliliter pro Vertiefung. In jeder Vertiefung einer 12-Well-Platte.

Geben Sie dann 10 Mikroliter frisch vorbereitete fluoreszierende Siliziumdioxid-Nanopartikelsuspension in jede Versuchsvertiefung und fügen Sie zu diesem Zeitpunkt auch den unbehandelten Kontrollvertiefungen das gleiche Volumen des vollständigen Mediums hinzu. Nach einer einstündigen Internalisierung bei 37 Grad Celsius werden die Proben in einzelne 1,5-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen überführt und dann die Proben drei Minuten lang bei 6.000-facher G-Temperatur und Raumtemperatur heruntergeschleudert, um die Zellen mit CD 14 über blaues Inkubieren von 100 Mikrolitern jeder Zellsuspension in 10 Mikrolitern des menschlichen Antikörpers im Verhältnis eins zu 11 in laufendem Puffer für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zu inkubieren. Nachdem der ungebundene Antikörper in einem Milliliter Laufpuffer weggewaschen wurde, resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern frischem Laufpuffer für die durchflusszytometrische Analyse.

Um die spektrale Spillover-Kompensation einzurichten, öffnen Sie als Nächstes das Feld für die Geräteeinstellungen in der Durchflusszytometrie-Software und entnehmen Sie dann eine Antikörper-unmarkierte Nanopartikel-freie Probe mit niedriger Fluidikgeschwindigkeit. Das Anpassen der Kompensationseinstellungen in Gegenwart von fluoreszierenden Nanopartikeln ist der kniffligste Teil des Verfahrens, da die Nanopartikel die Seitenstreuung stören können Um den Erfolg zu gewährleisten, muss ein Gate der interessierenden Zellpopulation definiert werden. Passen Sie die Vorwärts- und Seitenstreuung manuell an, indem Sie die Spannungskanäle regulieren. Zeichnen Sie dann ein entsprechend großes Tor um die gewünschte Zellpopulation.

Laden Sie ein anderes, unbeschriftetes Sample und öffnen Sie die Registerkarte "Kompensation" im Feld "Geräteeinstellungen". Passen Sie den Kompensationsfaktor während der Aufnahme an, bis die Fluoreszenzintensität im Spillover-Kanal für die Fluorochrom-positiven und -negativen Populationen ungefähr gleich ist. Nachdem schließlich die Kompensation für jedes einzelne gefärbte Fluorochrom-Kontrollröhrchen angepasst und die mit Nanopartikeln behandelten Proben abgelesen worden waren, um das Verhalten der weißen Blutkörperchen als Reaktion auf Nanopartikel besser zu charakterisieren, wurden Internalisierungsassays durchgeführt, wie gerade gezeigt.

Zum Beispiel wurden in diesem repräsentativen Experiment drei Haupt-Blutleukozyten-Subpopulationen durch Vorwärts- und Seitenstreuung nach PBMC-Isolierung eindeutig identifiziert. Darüber hinaus zeigten Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten nach der Behandlung mit fz-Siliziumdioxid unterschiedliche Internalisierungsraten von Nanopartikeln, was durch ihre Fluoreszenzintensität angezeigt wird. In diesen Bildern ist die Internalisierung von Nanopartikeln in primären CD 14-positiven Monozyten zu sehen, die von pbmc gereinigt wurden.

Diese Scatterplots zeigen CD 14-positive Monozyten in Gegenwart von fitz'schen Siliziumdioxid-Nanopartikeln. Das Histogramm veranschaulicht die Quantifizierung der fitzy positiven Zellen, ausgedrückt als Fluoreszenzintensität. Ähnliche Internalisierungsexperimente wurden mit TP-1-Monozyten durchgeführt, die mit steigenden Konzentrationen von Fitz-Siliziumdioxid-Nanopartikeln behandelt wurden, wobei unbehandelte Zellen als Negativkontrolle dienten.

Die Punktdiagramme veranschaulichen die dosisabhängige Zunahme der Seitenstreuung mit einer unveränderten Vorwärtsstreuung in der TP-Zelllinie nach der Nanopartikelinternalisierung. Die Daten aus diesen Diagrammen deuten darauf hin, dass die Behandlung mit Fitz-Siliziumdioxid-Nanopartikeln eine dosisabhängige Internalisierung in Monozyten induziert, was durch die Erhöhung der intrazellulären Granularität hervorgehoben wird. Um weitere Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen Immunzellen und Nanopartikeln zu erhalten, wurden Mikroglia sieben Tage lang in vitro kultiviert und eine Stunde lang mit Nanopartikeln inkubiert. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigte eine gemischte primäre Gliazellkultur mit einer großen Anzahl von GFP-negativen nicht-adhärenten Astrozyten und einigen GFP-positiven Zellen.

In diesem repräsentativen Experiment konnten drei gliale Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie unterschieden werden, wobei eine einzelne CD 11 B-Antikörper, die CD 11 B färbte, negative GFP-negative Astrozyten und andere Gliazellen, mikrogliale CD 11 B-positive GFP-negative Zellen und eine CD 11 B-positive GFP-positive Subpopulation. Die beiden letztgenannten Subpopulationen sind in der Lage, Nanopartikel mit einem leicht erhöhten Mangel durch die GFP-positive Population zu internalisieren. Die Internalisierung von Nanopartikeln kann durch konfokale Mikroskopie weiter verifiziert werden, wie in diesem Bild mit stäbchendominierten Siliziumdioxid-Nanopartikeln gezeigt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Proben im Dunkeln zu halten, um ein Ausbleichen der Fluoreszenzfarbstoffe zu vermeiden, und die Proben während der Antikörperinkubation bei vier Grad zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die konfokale Mikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur intrazellulären Lokalisierung der Nanopartikel zu beantworten.