Isolierung von interstitiellen Zellen der Mausklappe: Eine enzymatische Methode zur Isolierung und Kultivierung von VICs aus der Aortenklappe der Maus

Die Aortenklappe des Herzens ist eine dreiteilige Struktur, die aus den interstitiellen Zellen der inneren Klappe (VICs) besteht, die in der dichten extrazellulären Matrix verteilt sind, und den darüber liegenden Endothelzellen der Klappe oder VECs.

Um VICs zu isolieren, bereiten Sie zunächst eine euthanasierte Maus in Rückenlage vor. Legen Sie durch den Schnitt in der Mittellinie des Bauches und der Brust das Herz frei. Machen Sie einen kleinen Schnitt zwischen dem linken Vorhof und dem Ventrikel, gefolgt von einer Kochsalzperfusion, um das Blut abzulassen. Durchtrennen Sie die aufsteigende Aorta auf Höhe des Aortenbogens und entnehmen Sie das Herz.

Transezieren und verwerfen Sie die distalen zwei Drittel der Ventrikel, bevor Sie den restlichen Teil des Herzens in Längsrichtung präparieren, um die "U-förmigen" Aortenklappensegel freizulegen. Die Packungsbeilage herausschneiden und mit gekühltem Puffer abspülen, um Blut zu entfernen.

Behandeln Sie anschließend die Segel mit niedrig konzentrierter Kollagenaselösung und inkubieren Sie. In geringen Konzentrationen baut die Kollagenase - ein proteolytisches Enzym - die extrazelluläre Matrix nur teilweise ab und löst Oberflächen-VECs aus den Segeln.

Zentrifugieren und den enzymhaltigen Überstand durch Puffer ersetzen, wobei das resuspendierte Pellet in eine Petrischale überführt wird. Sammeln Sie die Segel und behandeln Sie sie mit hochkonzentrierter Kollagenaselösung für die zweite Verdauung. Bei der Inkubation baut die Kollagenase die extrazelluläre Matrix weiter ab und setzt VICs in Lösung frei.

Zentrifugieren Sie, um die VICs zu pelletieren, und resuspendieren Sie sie in geeigneten Medien. Säen Sie schließlich ein geringes Volumen der Zellsuspension auf eine Multi-Well-Platte, um die Haftung der VICs am Well-Boden zu erleichtern. Inkubieren, damit sich die VICs vermehren können.

Reinigen und sterilisieren Sie vor Beginn des Experiments alle chirurgischen Instrumente und den Arbeitsbereich mit 70%igem Ethanol und autoklavieren Sie die chirurgischen Instrumente 30 Minuten lang. Wenn die Ersteinrichtung fertig ist, beginnen Sie mit der Reinigung des Brustkorbs und der Bauchregion einer 8 Wochen alten euthanasierten Maus mit Ethanol

Öffnen Sie mit einer Schere den Bauch und die Brust der Maus. Schneiden Sie dann mit einer kleinen chirurgischen Schere zwischen dem linken Vorhof und der linken Herzkammer. Entnehmen Sie Blut aus dem Herzen, indem Sie 10 Milliliter kaltes PBS perfundieren und das Herz durchtrennen, wobei 3 Millimeter der aufsteigenden Aorta erhalten bleiben. Präparieren Sie unter einem Stereomikroskop die Aortenklappe, indem Sie das Herz horizontal in der Mitte der Ventrikel durchtrennen und den linken Ventrikel in Richtung Aorta durchtrennen. Präpariere dann vorsichtig die Aortenklappe. Fassen Sie die Ventile in einer kleinen 35-Millimeter-Gewebekulturschale zusammen.

Waschen Sie die isolierten Ventile in einer 75-Milliliter-Zellkulturschale mit 5 Millilitern frisch zubereitetem 10 Millimolar kaltem HEPES, ergänzt mit Antibiotika, und inkubieren Sie in 5 Millilitern Kollagenase Typ I für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius unter ständigem Schütteln. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie das Röhrchen 5 Minuten lang bei 150 x g und waschen das Pellet einmal mit 2 Millilitern millimolaren HEPES und wirbeln Sie es 30 Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit vortexen.

Sammeln Sie die resultierende Suspension aus dem Röhrchen in eine 35-Millimeter-Kulturschale und übertragen Sie die Gewebefragmente vorsichtig mit einer dünnen Pinzette in ein frisches Röhrchen. Dann inkubieren Sie das Pellet in einem 15-Milliliter-Röhrchen bei 5 Millilitern Kollagenase Typ I bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlichem Rühren für 35 Minuten. Trennen Sie die Zellen durch Resuspendieren mit einer 1-Milliliter-Pipette und zentrifugieren Sie sie bei 150 x g für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius. Reinigen Sie die Zellen zweimal, indem Sie das abgetrennte Pellet in 2 Millilitern vollständigem DMEM resuspendieren und 5 Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei 150 x g zentrifugieren.

Zum Plattieren resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter vollständigem Medium und geben Sie es in eine Vertiefung einer 6-Well-Zellkulturschale mit einer minimalen Menge Medium. Halten Sie die Platten ungestört bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Bestätigen Sie nach 3 Tagen Inkubation das Wachstum näher an Gewebetrümmern, indem Sie die Zellen unter dem Mikroskop beobachten. Sobald 1.000 Zellen sichtbar sind, entfernen Sie vorsichtig die Gewebereste mit einer autoklavierten Pinzette und wechseln Sie das Medium.