Isolierung und Charakterisierung intakter Phycobilisomen in Cyanobakterien

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Isolierung von Phycobilisomen aus Cyanobakterien durch Zentrifugation durch einen diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten. Die Fraktionen intakter Phycobilisomen werden durch 77K-Fluoreszenzemissionsspektrum und SDS-PAGE-Analyse bestätigt. Die resultierenden Phycobilisom-Fraktionen eignen sich für die negative Färbung von TEM und die massenspektrometrische Analyse.

Es ist ein einfaches und schnelles Protokoll, das es Menschen, die mit Cyanobakterien nicht vertraut sind, ermöglicht, Phycobilisom leicht zu isolieren. Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie an einen kleinen Maßstab angepasst ist und einfach durchzuführen ist. Es ist eine einfache, zuverlässige und effiziente Methode zur Isolierung intakter Phycobilisomen von Modell- und Nicht-Modell-Cynobakterien.

Beginnen Sie mit der Übertragung der Zellkultur von 0,8 OD bei 750 Nanometern in einen Ein-Liter-Kolben und verdünnen Sie sie in 500 Milliliter B-HEPES-Medium, um einen OD von 0,2 bei 750 Nanometern zu erreichen. Züchten Sie die Kultur unter ständigem Rühren bei 30 Grad Celsius, bis der OD 0,8 zu 1 erreicht, was auf eine späte exponentielle Wachstumsphase hinweist. Zentrifugieren Sie die Kultur mit einer Geschwindigkeit von 10.000 mal g für 20 Minuten bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand.

Suspendieren Sie die Zellpellets und waschen Sie sie zweimal mit 0,75 molarem Kaliumphosphatpuffer, pH sieben. Pelletieren Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen durch Zentrierung bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 0,75 molarem Kaliumphosphatpuffer.

Messen Sie das Nassgewicht des Pellets mit einer elektronischen Waage und resuspendieren Sie das ein Gramm Nassgewicht des Pellets in fünf Milliliter des Puffers. Fügen Sie einen Milliliter Zellsuspension und 0,4 bis 0,6 Gramm 0,1 Millimeter Glasperlen in eine Zwei-Milliliter-Schraubkappenfläschchen hinzu. Brechen Sie die Zellen für 30 Sekunden durch einen Perlenschläger.

Lassen Sie die Schläuche in einem Wasserbad bei Raumtemperatur zwei Minuten abkühlen. Nach der Lyse zentrifugieren Sie die Fläschchen für 10 Sekunden bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von 500 mal g. Den Überstand mit einer Pipette in einem 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen auffangen.

Die Kügelchen einmal mit 0,5 Millilitern 0,75 molarem Kaliumphosphatpuffer waschen und dann in dasselbe Zentrifugenröhrchen geben. Triton X-100 zur lysierten Zellsuspension geben und auf einem Schaukelschüttler bei Raumtemperatur und 40 U / min für 20 Minuten oder bis die Lösung homogen wird. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 20 Minuten bei 17,210 mal g und lagern Sie den Überstand ohne die obere Triton-Mizellenschicht bei Raumtemperatur bis zu einer Stunde.

Machen Sie vier Konzentrationen Saccharose in 0,75 molarem Kaliumphosphatpuffer bei pH sieben. 2,8 Milliliter zweier backen Saccharosepuffer am Boden des 40 Milliliter Zentrifugenröhrchens platzieren und mit drei Schichten Saccharoselösungen überlagern. Schließlich fügen Sie drei Milliliter PBS hinzu, die die überstehende Fraktion enthalten, und zentrifugieren Sie die resultierenden Gradienten.

Kondensieren Sie bei der Ultrazentrierung die fraktionierten PBS- und Phycobiliproteine zwischen den Schichten und beobachten Sie die blauen Bänder in Syn6803 und Grenzflächen. Entfernen Sie die Saccharose durch wiederholtes Konzentrieren und Verdünnen der Fraktionen mit 0,75 molarem Kaliumphosphatpuffer und Membran der Zentrifugalfiltereinheiten. Zur Messung der PBS-Fluoreszenz verdünnen Sie die konzentrierte PBS-Probe mit 0,75 molarem Kaliumphosphatpuffer auf bis zu 500 Mikroliter Volumen.

Geben Sie die verdünnte PBS-Probe in ein transparentes Glasröhrchen und frieren Sie das Röhrchen in flüssigem Stickstoff ein, bis es vollständig eingefroren ist. Bewegen Sie das gefrorene Röhrchen in einen transparenten Dewar-Behälter, der mit flüssigem Stickstoff vorgefüllt ist. Die vollständige Zelllyse zeigt die überstehende und dunkelblau-grüne Farbe vor der Zentrierung.

Die Saccharosedichtegradiententrennung von isoliertem PBS zeigt mehrere Fraktionen dissoziierter Phycobiliproteine und die niedrigste Fraktion repräsentiert die intakte PBS. Die Absorptionsspektren aus dem dissoziierten und intakten PBS von JSC one und Syn6803 haben mit 622 Nanometern den gleichen Peak, der dem Phycocyanin entspricht. Darüber hinaus erreicht die Phycoerythrin-Absorption einen Peak von 571 Nanometern sowohl im dissoziierten als auch im intakten PBS von JSC-1.

Die Emissionsspektren des dissoziierten PBS haben einen starken Peak bei etwa 650 Nanometern in Syn6803 und JSC-1, der die Emission von Phycocyanin darstellt. Die maximalen Peaks der fluoreszierenden Emission bei 651 Nanometern und 684 Nanometern zeigen, dass die von Phycocyanin geerntete Energie effizient auf Allophycocyanin und terminale Emitter, die ApcD und ApcE sind, im Kern übertragen wurde. Die Abbildung zeigt zinkgefärbte SDS-PAGE unter UV-Bestrahlung, wobei die Phycobiliprotein-Untereinheiten stark fluoreszierend sind und der ApcE eine schwache Fluoreszenz zeigte, die mit dem Pfeil angezeigt wird.

Kumasi-Blaufärbung zeigt, dass die oberen Fraktionen andere nicht-PBS-wasserlösliche Proteine enthalten und das intakte PBS und Syn6803 zeigt ein prominentes ApcE-Band, das mit einem Pfeil angezeigt wird und in den dissoziierten PBS-Fraktionen fehlt. Die Ultrazentrifugation zeigt, dass der in einem Verhältnis von 1:3 hergestellte Saccharosegradient breitere Bänder aufweist als der Gradient im Verhältnis 1:10. Es ist wichtig, die Zellen zu lysieren und die Überstände vollständig zu solvolysieren, um mehr Phycobilisomen zu erhalten.

Andere Methoden, wie Kryo-EM oder Gemischte Spektrometrie, können verwendet werden, um die Proteinstruktur oder die Proteinzusammensetzung von Phycobilisomen zu untersuchen.