Statische Rasterkraftmikroskopie zur Visualisierung und Charakterisierung von zusammengesetzten Nukleosomen

Nukleosomen, die grundlegende Wiederholungseinheit des eukaryotischen Chromatins, bestehen aus DNA-Windungen, die um einen Kern aus Histonproteinen gewickelt sind.

Um zusammengesetzte Nukleosomen durch statische Rasterkraftmikroskopie (AFM) sichtbar zu machen, beginnen Sie mit einem dünnen Glimmerstreifen, der funktionalisiert wird, um die Oberfläche positiv geladen zu machen. Schneide den Streifen in kleine Quadrate. Pipettieren Sie eine zusammengesetzte Nukleosomensuspension.

Die negativ geladene DNA im Nukleosom bindet durch elektrostatische Wechselwirkungen an die positiv geladene Gruppe des funktionalisierten Glimmerstreifens. Mit Puffer waschen, um eine Überfüllung der Nukleosomen zu vermeiden.

Befestigen Sie den Glimmerstreifen auf einer Probenträgerscheibe und montieren Sie ihn auf dem AFM-Instrumententisch.

Befestigen Sie den Sondenhalter am optischen Kopf des Geräts. Der Halter enthält einen vormontierten AFM-Ausleger mit einer Spitze an der Spitze.

Richten Sie den Laserstrahl auf die Auslegerrückseite aus, um eine genaue Ablenkungsmessung zu ermöglichen. Positionieren Sie die Spitze in direktem Kontakt mit der nukleosomenhaltigen Oberfläche.

Während der Bildgebung im Kontaktmodus, wenn die Cantilever-Spitze über die Nukleosomenoberfläche tastet, entstehen Abstoßungskräfte aufgrund von Wechselwirkungen zwischen Atomen der Spitze und der Probe. Dies führt dazu, dass sich der Ausleger verbiegt. Der Laserstrahl wird anders reflektiert und auf den positionsempfindlichen Photodetektor gelenkt.

Die Rückkopplungsschleife sorgt für eine konstante Auslenkung des Auslegers durch vertikale Scannerbewegung während des Scans. Dieses Rückkopplungssignal wird weiter genutzt, um topographische Nukleosomenbilder zu erzeugen. Der Nukleosomenkern erscheint als helle Klumpen, mit dünnen Armen, die die flankierende DNA darstellen.

Bereiten Sie die Glimmeroberfläche für die statische AFM-Bildgebung vor. Bereiten Sie dazu zunächst eine 50 Millimolare APS-Stammlösung in entionisiertem Wasser her. Lagern Sie 1 Milliliter Aliquots der Lösung bei 4 Grad Celsius, bis sie benötigt werden.

Bereiten Sie aus der Stammlösung eine funktionierende APS-Lösung für die Glimmermodifikation her, indem Sie 50 Mikroliter des 50-Millimolaren APS-Stamms in 15 Millilitern destilliertem deionisiertem Wasser auflösen. Mischen Sie die Lösung und füllen Sie dann eine Küvette mit der Lösung.

Schneiden Sie anschließend 1 x 3 Zentimeter große Glimmerstreifen aus hochwertigen Glimmerblättern ab. Prüfen, ob das Stück passt, wenn es diagonal in eine Küvette gelegt wird. Dann spalten Sie Schichten des Glimmers, bis beide Seiten frisch gespalten sind und das Stück nur 0,1 Millimeter dünn ist.

Legen Sie das Glimmerstück sofort in die mit APS gefüllte Küvette und inkubieren Sie den Glimmer 30 Minuten lang. Übertragen Sie das Glimmerstück in eine mit destilliertem deionisiertem Wasser gefüllte Küvette und weichen Sie es 30 Sekunden lang ein. Verwenden Sie dann Argon, um beide Seiten des APS-Glimmerstreifens vollständig zu trocknen.

Kleben Sie doppelseitiges Klebeband auf mehrere magnetische Pucks und legen Sie sie zur Seite. Schneiden Sie dann das APS-Glimmersubstrat in 1 Zentimeter x 1 Zentimeter große Quadrate und bedecken Sie sie mit einer sauberen Petrischale. Als nächstes bereiten Sie drei Verdünnungen der assemblierten Nukleosomen unter Verwendung eines 0,22-Mikron-gefilterten Puffers vor, der 10 Millimolare HEPES und 4 Millimolare Magnesiumchlorid bei einem pH-Wert von 7,5 enthält.

Um den Verlust von Nukleosomen bei niedriger Endkonzentration zu begrenzen, sollte die Verdünnung nacheinander unmittelbar vor der Abscheidung auf dem APS-Glimmer erfolgen.

Geben Sie 5 bis 10 Mikroliter jeder Nukleosomenprobe in die Mitte eines APS-Glimmerstücks und lassen Sie sie 2 Minuten lang inkubieren. Spülen Sie dann die Probe vorsichtig mit 2 bis 3 Millilitern destilliertem deionisiertem Wasser ab, um die Pufferkomponenten zu entfernen, und trocknen Sie die abgelagerte Probe unter einem leichten Argonstrom.

Montieren Sie zunächst eine Spitze an der Spitzenhalterung des AFM-Setups. Montieren Sie dann die erste Probe auf dem AFM-Tisch und achten Sie darauf, die Probenoberfläche nicht zu berühren. Positionieren Sie den Laser über dem Ausleger, bis seine Summe maximal ist, und stellen Sie die Werte für vertikale und seitliche Ablenkung auf nahe 0 ein. Stimmen Sie dann die AFM-Sonde ab, um ihre Resonanzfrequenz zu ermitteln. Passen Sie die Treiberamplitude an und stellen Sie die Bildgröße auf 100 x 100 Nanometer ein. Klicken Sie nach der Einrichtung auf die Schaltfläche Engagieren, um den Ansatz zu starten.

Wenn der Ansatz abgeschlossen ist, optimieren Sie den Amplitudensollwert schrittweise, bis die Oberfläche der Probe deutlich zu sehen ist. Erhöhen Sie dann die Scangröße auf 1 Mikrometer x 1 Mikrometer und die Auflösung auf 512 x 512 Pixel. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche Aufnehmen, um die Bildaufnahme zu starten.