Konstruktion eines humanisierten Mausmodells mit künstlicher Immunität gegen HIV

Bereiten Sie eine anästhesierte, stark immungeschwächte Empfängermaus vor.

Machen Sie einen Schnitt, um die Niere freizulegen und ein Loch in der Nierenkapsel zu schaffen.

Nehmen Sie eine Implantatnadel, die menschliches fötales Thymusgewebe und fetale Leberzellen enthält, die in einer gallertartigen Proteinmischung suspendiert sind.

Zu den Zellen gehören manipulierte hämatopoetische Stammzellen (HSCs), die chimäre Antigenrezeptoren (CARs) exprimieren, die gegen HIV gerichtet sind.

Implantieren Sie die Zellsuspension und das Thymusgewebe unter die Kapsel und schließen Sie dann den Schnitt.

Injizieren Sie als Nächstes die CAR-exprimierenden HSCs retroorbital und lassen Sie die Maus sich erholen.

In der Niere polymerisiert das gallertartige Proteingemisch zu einer Matrix, wobei die HSCs an der Implantationsstelle verbleiben.

Die Matrix-HSCs wandern in den Thymus und differenzieren sich zu funktionsfähigen humanen T-Zellen.

In der Zwischenzeit gelangen retroorbital injizierte HSCs ins Knochenmark und differenzieren sich in funktionsfähige humane B-Zellen, Monozyten und NK-Zellen.

Das Mausmodell mit einem menschlichen Immunsystem gegen HIV ist nun fertig.

Gießen Sie die Thymusstücke und das Medium aus dem Kolben in eine 60-Millimeter-Schale. Kühlen Sie einige Verdränger-Pipettenspitzen, indem Sie sie in offene, sterile 1,5-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen auf Eis legen. Legen Sie außerdem die Zellpellets und ein Volumen gallertartiger Proteinmischung, wie z. B. Matrigel, auf Eis.

Betäuben Sie die Empfängermäuse mit einem injizierbaren Anästhetikum gemäß einem genehmigten Tierprotokoll. Überprüfen Sie den Betäubungsgrad der Maus, indem Sie eine Pfote zusammendrücken. Das Fehlen einer Reaktion auf das Kneifen deutet auf eine chirurgische Anästhesieebene hin.

Rasieren Sie die linke Seite jeder Maus von der Hüfte bis zur Schulter, zwischen der Mitte des Rückens und dem Bauch. Injizieren Sie subkutan 6 Milligramm pro Kilogramm verdünntes Carprofen in die Schulter oder das Leistendreieck des Tieres. Spülen Sie die Kanüle des Trokars mit PBS in einer 60-Millimeter-Schale. Platzieren Sie mit einer stumpfen, gebogenen Pinzette ein Stück Thymus aus der 60-Millimeter-Schale direkt in der Öffnung der Kanüle und ziehen Sie dann den Trokar zurück, um das Gewebe in die Kanüle zu aspirieren.

Geben Sie anschließend mit einer Verdrängerpipette und einer gekühlten Spitze 5 Mikroliter kalte gallertartige Proteinmischung in das Röhrchen mit dem Zellpellet und rühren Sie vorsichtig um, um die Zellsuspension zu erzeugen. Pipettieren Sie die Zellsuspension in die Öffnung der Kanüle und ziehen Sie den Trokar langsam zurück, um die Nadel zu laden.

Tupfen Sie den rasierten Bereich der Maus dreimal mit Povidon-Jod gefolgt von Isopropanol ab. Bestimmen Sie den dunkelsten Fleck unter der Haut, der die Lage der Milz anzeigt. Die Niere ist etwa 5 Millimeter dorsal zur Milz.

Nachdem Sie durch das Fehlen einer Reaktion auf das Kneifen der Pfote ein angemessenes Anästhesieniveau sichergestellt haben, verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um die Haut anzuheben, und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen 15-Millimeter-Schnitt in die Haut parallel zur Milz zu machen. Machen Sie dann einen ähnlichen Schnitt in der Peritoneumschicht darunter.

Bei Männern ist die Niere leicht sichtbar und wird daher einfach durch Drücken auf den Bauch extrudiert. Stützen Sie die Niere mit einem Blutstillstand oder einer gebogenen stumpfen Pinzette. Bei Frauen neigen die Eierstöcke dazu, die Niere für eine einfache Entnahme zu blockieren. Nehmen Sie mit einem Hämostatikum den Eierstock auf und legen Sie die Niere vorsichtig frei.

Verwende eine Nadelzange, um ein winziges Loch am hinteren Ende der Nierenkapsel zu zupfen. Schieben Sie den Trokar in dieses Loch und entlang der Niere, bis die Öffnung der Kanüle vollständig von der Nierenkapsel bedeckt ist. Extrudieren Sie das Gewebe vorsichtig unter der Nierenkapsel und ziehen Sie den Trokar wieder heraus. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um sicherzustellen, dass das Thymusstück nicht mit der Nadel herauskommt.

Heben Sie dann das Bauchfell mit der Pinzette an und drücken Sie die Niere vorsichtig mit dem Blutstiller wieder an ihren Platz. Binden Sie einen doppelt geknoteten Stich mit chirurgischer Naht in das Bauchfell. Platzieren Sie außerdem zwei gewickelte Clips mit automatischen Clips, um die Haut zu schließen.

Mischen Sie nun die transduzierten CD34-positiven Zellen und aspirieren Sie 0,5 x 10⁶ Zellen in einem Volumen von 100 Mikrolitern in eine Insulinspritze. Injizieren Sie diese Zellen durch retroorbitale Veneninjektion in die Maus.

Tupfen Sie nach der Injektion einen kleinen Tropfen Augengleitmittel auf jedes Auge und legen Sie die Maus auf die Seite zurück in einen Käfig. Nachdem Sie alle Mäuse implantiert haben, bestätigen Sie, dass die Tiere das Bewusstsein wiedererlangt haben und gehfähig sind, bevor Sie sie in den Haltungsraum zurückbringen.