Mit der BLT humanisierte Maus als Stem Cell based Gene Therapy Tumormodell

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Mäuse zu erzeugen, die ein manipuliertes menschliches Immunsystem tragen. Dies wird erreicht, indem die Maus zunächst für die Operation vorbereitet und dann im zweiten Schritt der Trokar mit einem Stück Thymus beladen wird. Matrigel wird mit CD 34 negativen und CD 34 positiven transduzierten Zellen gemischt und das Gemisch dann in den Trokar gegeben.

Als nächstes werden die Matrigel-Konstrukte unter die Nierenkapsel transplantiert. Letztendlich kann die Abstoßung der Zieltumoren durch die gentechnisch veränderten Zöliakie-T-Zellen durch Live-PET-Bildgebung und physikalische Tumormessungen überwacht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Meth-Methoden, wie z.B. Vollneuronenmodellen, besteht darin, dass diese Methode die Untersuchung der Entwicklung genetisch veränderter menschlicher Stammzellen innerhalb des menschlichen Thymus und die anschließende In-vivo-Wirksamkeitsprüfung abgeleiteter Abstammungslinien ermöglicht, die das Verfahren von drei Technikern aus unseren Labors demonstrieren: Gregory Bristol, Bernard Levin, und Sean Kim.

In diesem schematischen Diagramm wird das modifizierte BLT-Modell, das in diesen Studien zur Erzeugung von chimären Mäusen verwendet wurde, die Mart tragen, eine spezifische T-Zelle skizziert. Das th-Implantat wird aus transduzierten und nicht transduzierten CD 34-Zellen rekonstruiert, die aus einer autologen fetalen Leber isoliert wurden. Ein Teil der transduzierten Zellen wird dann eingefroren und vier bis sechs Wochen später in die bestrahlten Mäuse injiziert.

In diesem Video wird die Implantation des lebenden Konstrukts demonstriert, sobald die Tiere nach der Narkose träge geworden sind. Beginnen Sie damit, die linke Seite jeder Maus von der Hüfte bis zur Schulter zwischen der Mitte des Rückens und dem Bauch zu rasieren. Nachdem Sie das Gewicht jedes Tieres aufgezeichnet haben, schlagen Sie die Ohren zur Nummerierung und injizieren Sie subkutan 0,3 Milliliter Carprofen in jede ihrer Schultern.

Legen Sie dann die Mäuse auf die rechte Seite mit dem Blick nach links. Spülen Sie nun den Trokar einer 16-Gauge-Krebsimplantatnadel mit einer runden Feilenspitze mit PBS. Geben Sie mit einer Nadelzange ein Stück Thymus in die PBS-Schale und halten Sie dann den Trokar mit der Stange waagerecht.

Direkt in der Spitze wird das Gewebe abgesaugt. Das Schieben des Trokars unter die Nierenkapsel und das Injizieren des Gewebes ist einer der schwierigsten Aspekte dieses Eingriffs. Als nächstes haben Sie einen Helfer.

Verwenden Sie eine Eend Orph-Verdrängerpipette, um fünf Mikroliter kaltes Matrigel unter leichtem Rühren in ein Röhrchen mit Zellen zu mischen. Halten Sie den Trokar waagerecht. Ziehen Sie den Stab langsam zurück, während der Helfer das Matri-Gel pipetiert.

Für jede Maus in den Trokar mischen. Tupfen Sie zuerst die nackte Haut des Tieres mit Betadin ab und wischen Sie sie dann mit einem Isopropanol-Tuch ab. Bestimmen Sie zweimal den dunkelsten Fleck unter der Haut, der die Lage der Milz anzeigt.

Die Niere befindet sich etwa fünf Millimeter dorsal der Milz, wobei eine stumpfe Pinzette verwendet wird, um die Haut über der Niere aufzunehmen. Machen Sie einen etwa 15 Millimeter langen Schnitt in der Haut parallel zur Milz. Machen Sie einen ähnlichen Schnitt in der Bauchmuskelschicht darunter.

Bei Männern sollte die Niere direkt sichtbar sein. Drücken Sie einfach den Bauch zusammen, um ihn herauszuholen. Halten Sie mit der linken Hand Druck auf den Bauch, um die Niere freizulegen, verwenden Sie bei Frauen zuerst ein Hämostatum, um den Eierstock zu heben, und ziehen Sie dann die Niere heraus, um das Organ außerhalb des Körpers zu halten.

Zupfen Sie ein kleines Loch in das hintere Ende der Nierenkapsel und schieben Sie dann den Trokar in dieses Loch und entlang der Niere, bis die Öffnung des Trokars vollständig von der Nierenkapsel bedeckt ist. Injizieren Sie dann mit dem kleinen Finger der rechten Hand das Gewebe. Verwenden Sie nun das geschlossene Hämostatum, um die Niere vorsichtig wieder an ihren Platz zu drücken.

Binden Sie einen Stich mit einer Doppelschleife in das Bauchfell, drücken Sie die Haut wie eine Handtasche zusammen und stecken Sie sie dann in zwei gewundete Klammern. Geben Sie zum Schluss einen Tropfen PBS auf jedes Auge und legen Sie die Maus auf die Seite in einen Käfig auf etwas Einstreu. Nachdem Sie alle Mäuse auf die gleiche Weise implantiert haben, vergewissern Sie sich, dass die Tiere wieder auf dem Bauch liegen, bevor Sie sie verlassen.

Diese erste Abbildung zeigt ein repräsentatives Bild des THI-Lebendimplantats in humanisierten Mäusen. In dieser Abbildung ist die normale Entwicklung des Thymusgewebes und die physiologische Gewebsverteilung des humanen CD 4 und CD 8 positiven T dargestellt. Nach der Rekonstitution tragen die Tiere ein menschliches Immunsystem mit einer Normalverteilung von CD-4- und CD-8-positiven T-Zellen in sich.

Hier wird ein repräsentatives Bild einer Maus gezeigt, die einen Melanomtumor trägt. Die grauen Bereiche zeigen das CT-Scanbild an. Die farbigen Flächen zeigen die metabolische Aktivität des Tumors, wie sie durch den PET-Scan nachgewiesen wurde.

Der CT-Scan allein in diesem Experiment zeigte eine große Tumormasse in dem durch den weißen Kreis angezeigten Bereich. Wie die In-vivo-PET-Bildgebung jedoch zeigt, besteht dieser Bereich hauptsächlich aus nekrotischem Gewebe und Narbengewebe, was den Nutzen der PET-Bildgebung als empfindlichere und genauere Methode zur Beurteilung der Tumorregression und -clearance unterstreicht. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Assays wie T-Zell-, Phänotypisierung und ex vivo-Aktivierung durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, die für die T-Zell-Funktion relevant sind.