Stammzellen Basierend Engineered Immunität gegen HIV-Infektion in der humanisierten Maus-Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine humanisierte Maus zu schaffen, die mit chimären Antigenrezeptoren modifiziert ist. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen HIV und Immunologie zu beantworten, wenn es darum geht, die Wirksamkeit einer stammzellbasierten künstlichen Immunität gegen HIV-Infektionen und andere chronische Infektionen und Malignome zu testen. Wie zum Beispiel ein Mechanismus des Immunversagens und Möglichkeiten, das Immunsystem zu stärken und eine Therapie zu entwickeln, um eine bessere antivirale oder antitumorale Immunität zu schaffen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zu einer großen Anzahl von experimentellen Manipulationen fähig ist. Das humanisierte BLT-Mausmodell ahmt die menschliche Immunität nach und ermöglicht in diesem Fall präklinische Tests für zellbasierte Gentherapien gegen HIV-Infektionen. Das Verfahren wird von Valerie Rezek und Brianna Lam vorgeführt, sie sind Techniker aus meinem Labor.

Beginnen Sie damit, den Thymus mit Skalpellen in kleine Stücke von etwa einem Millimeter zu schneiden, die in einer Schüssel mit zugesetztem RPMI-Medium gewürfelt werden. Verwenden Sie dann eine gebogene stumpfe Pinzette, um jedes einzelne Thymusstück in eine einzelne Vertiefung auf einer 96-Well-Platte zu platzieren. Geben Sie 100-200 Mikroliter Medium in alle Vertiefungen, damit das Gewebe nicht austrocknet.

Visualisieren Sie das Gewebe unter dem Mikroskop, um Gewebe zu entfernen, das möglicherweise nicht Thymus ist oder an dem Bindegewebe befestigt ist. Entfernen Sie anschließend die bestätigten Thymusstücke und kombinieren Sie sie in einen T25-Zellkulturkolben. Geben Sie sieben Milliliter mit Antibiotika versetztes RPMI-Medium in den Kolben und schütteln Sie es vorsichtig zum Mischen.

Stellen Sie dann den Kolben in den Gewebekultur-Inkubator. Dieser Schritt verhindert eine bakterielle Kontamination des Gewebes. Beginnen Sie mit der Isolierung von CD34-positiven HSCs aus der fetalen Leber, indem Sie die Leber mit zwei Skalpellen in kleine Stücke von etwa drei Millimetern schneiden, die in einer Schale mit IMDM würfeln.

Entfernen und entsorgen Sie weißes Bindegewebe. Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer stumpfen 16-Gauge-Nadel versehen ist, um die Leberstücke und das Medium zu entnehmen und in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen zu überführen. Fünf bis sieben weitere Male sanft aufnehmen und ausstoßen, um das Gewebe vollständig zu homogenisieren.

Nachdem Sie 10 Milliliter IMDM-Medien vorbereitet haben, ergänzen Sie es mit Kollagenase, Hyaluronidase, Antibiotika, Dnase und Antimykotika. Führen Sie das Medium durch einen 0,22-Mikron-Filter. Geben Sie dann das gefilterte Medium in die Lebersuspension.

Nachdem Sie das konische 50-Milliliter-Röhrchen mit der Lebersuspension verschlossen haben, verschließen Sie es fest mit selbstversiegelnder Folie wie Parafilm, um ein Auslaufen zu verhindern. In einem Röhrenrotator im 37 Grad Celsius heißen Inkubator 90 Minuten lang drehen. Nach der Inkubation filtrieren Sie die verdaute Zellsuspension durch ein 100-Mikron-Zellsieb in ein frisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Fügen Sie der Suspension PBS hinzu, um das Gesamtvolumen auf 50 Milliliter zu erhöhen. Teilen Sie dies in zwei 50-Milliliter-Röhrchen auf, die jeweils 25 Milliliter Zellsuspension enthalten. Verlangsamen und schonen unterlegen Sie die Zellen in jedem Röhrchen mit 10 Millilitern eines Dichtezentrifugationsmediums, wie z. B. Ficoll.

Bei 1200 mal g für 20 Minuten ohne Pause drehen. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig die Grenzfläche von jedem Röhrchen und geben Sie es in zwei separate 50-Milliliter-Röhrchen. Bringen Sie das Volumen jedes Röhrchens der Grenzfläche mit PBS auf bis zu 50 Milliliter.

Und dann sieben bis 10 Minuten lang bei 300 mal g zentrifugieren. Kombinieren und waschen Sie die Zellpellets dreimal mit 50 Millilitern PBS, die zwei Prozent FBS enthalten, und drehen Sie sie jeweils sieben bis 10 Minuten lang mit dem 300-fachen g. Nach dem letzten Schleudern das Pellet in 50 Millilitern RPMI-Medium plus 10 Prozent FBS erneut suspendieren.

Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Sortieren Sie anschließend CD34-positive Zellen sofort mit einem CD34-Sortierkit gemäß dem Protokoll des Herstellers und speichern Sie sowohl die CD34-positive als auch die CD34-negative Fraktion. Gießen Sie die Thymusstücke und das Medium aus dem Kolben in eine 60-Millimeter-Schale.

Kühlen Sie einige Verdränger-Pipettenspitzen, indem Sie sie in offene, sterile 1,5-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen auf Eis legen. Legen Sie außerdem die Zellpellets und ein Volumen gallertartiger Proteinmischung wie Matrigel auf Eis. Betäuben Sie die Empfängermäuse mit einem injizierbaren Anästhetikum gemäß einem genehmigten Tierprotokoll.

Überprüfen Sie den Betäubungsgrad der Maus, indem Sie eine Pfote zusammendrücken. Das Fehlen einer Reaktion auf das Kneifen deutet auf eine chirurgische Anästhesieebene hin. Rasieren Sie die linke Seite jeder Maus von der Hüfte bis zur Schulter zwischen der Mitte des Rückens und dem Bauch.

Injizieren Sie subkutan sechs Milligramm pro Kilogramm verdünntes Carprofen in die Schulter oder das Leistendreieck des Tieres. Spülen Sie die Kanüle des Trokars mit PBS in einer 60-Millimeter-Schale. Platzieren Sie mit einer stumpfen gebogenen Pinzette ein Stück Thymus aus der 60-Millimeter-Schale direkt in der Öffnung der Kanüle und ziehen Sie dann den Trokar zurück, um das Gewebe in die Kanüle zu aspirieren.

Verwenden Sie anschließend eine Verdrängerpipette und eine gekühlte Spitze, um fünf Mikroliter kalte gallertartige Proteinmischung in das Röhrchen mit dem Zellpellet zu geben. Und vorsichtig umrühren, um die Zellsuspension zu erzeugen. Pipettieren Sie die Zellsuspension in die Öffnung der Kanüle und ziehen Sie den Trokar langsam zurück, um die Nadel zu laden.

Tupfen Sie den rasierten Bereich der Maus dreimal mit Povidon-Jod gefolgt von Isopropenyl ab. Bestimmen Sie den dunkelsten Fleck unter der Haut, der die Lage der Milz anzeigt. Die Niere befindet sich etwa fünf Millimeter dorsal zur Milz.

Nachdem Sie durch das Fehlen einer Reaktion des Pfotenkneifens ein angemessenes Anästhesieniveau sichergestellt haben, verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um die Haut anzuheben, und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen 15-Millimeter-Schnitt in die Haut parallel zur Milz zu machen. Machen Sie dann einen ähnlichen Schnitt in der Peritoneumschicht darunter. Bei Männern ist die Niere leicht sichtbar und wird daher einfach durch Drücken auf den Bauch extrudiert.

Stützen Sie die Niere mit einem Blutstillstand oder einer gebogenen stumpfen Pinzette. Bei Frauen neigen die Eierstöcke dazu, die Niere für eine einfache Entnahme zu blockieren. Nehmen Sie mit einem Hämostatikum den Eierstock auf und legen Sie die Niere vorsichtig frei.

Verwende eine Nadelzange, um ein winziges Loch am hinteren Ende der Nierenkapsel zu zupfen. Schieben Sie den Trokar in dieses Loch und entlang der Niere, bis die Öffnung der Kanüle vollständig von der Nierenkapsel bedeckt ist. Extrudieren Sie das Gewebe vorsichtig unter der Nierenkapsel und ziehen Sie den Trokar wieder heraus.

Verwenden Sie die gebogene Pinzette, um sicherzustellen, dass das Thymusstück nicht mit der Nadel wieder herauskommt. Heben Sie dann das Bauchfell mit der Pinzette an und drücken Sie die Niere vorsichtig mit dem Blutstiller wieder an ihren Platz. Binden Sie einen doppelt verknoteten Stich mit chirurgischer Naht in das Bauchfell.

Platzieren Sie außerdem zwei Autoclips Wundclips, um die Haut zu schließen. Mischen Sie nun die transduzierten CD34-positiven Zellen und aspirieren Sie 0,5 mal 10 zu den sechs Zellen in einem Volumen von 100 Mikrolitern in eine Insulinspritze. Injizieren Sie diese Zellen durch retroorbitale Veneninjektion in die Maus.

Tupfen Sie nach der Injektion einen kleinen Tropfen Augengleitmittel auf jedes Auge und legen Sie die Maus auf die Seite zurück in einen Käfig. Nachdem Sie alle Mäuse implantiert haben, bestätigen Sie, dass die Tiere wieder gewissenhaft und gehfähig sind, bevor Sie sie in den Stallraum zurückbringen. Die Mäuse wurden 10 Wochen nach der Operation getötet und Blut, Milz, Thymus und Knochenmark entnommen.

Die resultierenden Zellen wurden mit anti-humanen CD45- und anti-humanen CD4-Antikörpern gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Wie hier zu sehen ist, können CD4-chimäre Antigenrezeptor-modifizierte Zellen in mehreren lymphatischen Geweben mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Die CD4-chimären Antigenrezeptor-modifizierten Zellen können sich in mehrere Linien differenzieren.

In dieser Arbeit wurden Splenozyten von CD4-chimären Antigenrezeptor-modifizierten Mäusen entnommen und auf Marker von T- und B-Zellen gefärbt. Zellen, die negativ für T- und B-Zell-Marker waren, waren positiv für Marker von Monozyten und Makrophagen sowie für natürliche Killerzellen. Splenozyten von HIV-infizierten chimären CD4-Antigenrezeptor-Mäusen wurden entweder mit HIV-infizierten oder nicht infizierten T-1-Zellen stimuliert und ihre intrazelluläre Produktion von Zytokinen gezeigt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humanisierte BLT-Mäuse konstruiert, die mit chimären Antigenrezeptoren modifiziert sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 48 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, in einem gleichmäßigen Tempo zu arbeiten und genau auf den Zustand der zu operierenden Maus zu achten.

Für Anfänger ist es wichtig, Operationen und Augeninjektionen zu üben, bevor sie mit Geweben und Stammzellen arbeiten, die wertvoller sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet von HIV und anderen Infektionskrankheiten, um die Krankheitspathogenese und immunbasierte Therapien im humanisierten Mausmodell zu erforschen.