Stammzellen Basierend Engineered Immunität gegen HIV-Infektion in der humanisierten Maus-Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humanisierte Mäuse zu erzeugen, die mit einem chimären Antigenrezeptor modifiziert wurden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich HIV und Immunologie zu beantworten, insbesondere hinsichtlich der Wirksamkeit einer auf Stammzellen basierenden, technisch optimierten Immunität gegen HIV-Infektionen sowie andere chronische Infektionen und Malignome. Beispielsweise bezüglich der Mechanismen des Immunversagens und möglicher Ansätze, das Immunsystem zu stärken und Therapien zu entwickeln, die eine verbesserte antivirale oder anti-tumorale Immunität hervorrufen.

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine große Anzahl experimenteller Manipulationen ermöglicht. Das humanisierte BLT-Mausmodell bildet die menschliche Immunität nach und erlaubt in diesem Fall präklinische Testungen von zellbasierten Gentherapien gegen eine HIV-Infektion. Die Durchführung des Verfahrens wird Valerie Rezek und Brianna Lam demonstrieren, die Technikerinnen aus meinem Labor sind.

Beginnen Sie damit, mithilfe von Skalpellen die Thymusdrüse in einer Schale mit supplementiertem RPMI-Medium in kleine Stücke von etwa einem Kubikmillimeter zu zerschneiden. Verwenden Sie dann gebogene stumpfe Pinzetten, um jedes einzelne Thymusstück in jeweils ein einzelnes Loch einer 96-Loch-Platte zu legen. Geben Sie 100–200 Mikroliter Medium in alle Löcher, damit das Gewebe nicht austrocknet.

Unter dem Mikroskop das Gewebe untersuchen, um jegliches Material, das möglicherweise kein Thymus ist oder an dem Bindegewebe anhängt, auszuschließen. Anschließend die bestätigten Thymusstücke entnehmen und in einen T25-Zellkulturkolben geben. Sieben Milliliter mit Antibiotikum angereichertes RPMI-Medium zum Kolben hinzufügen und vorsichtig schwenken, um es zu vermischen.

Stellen Sie dann den Kolben in den Zellkultur-Inkubator. Dieser Schritt verhindert eine bakterielle Kontamination des Gewebes. Beginnen Sie die Isolierung von CD34-positiven HSCs aus fetaler Leber, indem Sie die Leber mit zwei Skalpellen in einer Schale mit IMDM in kleine Stücke von etwa drei Kubikmillimetern schneiden.

Entfernen und entsorgen Sie jegliches weißes Bindegewebe. Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Spritze mit einer stumpfen 16-Gauge-Nadel, um die Leberstücke und das Medium zu entnehmen und in ein 50-Milliliter-Konischgefäß zu überführen. Saugen Sie die Probe vorsichtig fünf bis sieben Mal auf und geben Sie sie wieder ab, um das Gewebe vollständig zu homogenisieren.

Nach der Herstellung von 10 Milliliter IMDM-Medien diese mit Kollagenase, Hyaluronidase, Antibiotika, Dnase und Antimykotikum versetzen. Das Medium durch einen 0,22-Mikron-Filter filtrieren. Anschließend das filtrierte Medium zur Leber-Suspension geben.

Nachdem der 50-Milliliter-Kegelrohr, das die Lebersuspension enthält, verschlossen wurde, dicht mit einer selbstverschließenden Folie wie Parafilm abgedichtet, um Leckagen zu verhindern. Im 37-Grad-Celsius-Inkubator 90 Minuten lang in einem Röhrenrotator rotieren lassen. Nach der Inkubation die aufgeschlossene Zellsuspension durch ein 100-Mikron-Zellsieb in ein frisches 50-Milliliter-Röhrchen filtrieren.

Fügen Sie PBS zur Suspension hinzu, um das Gesamtvolumen auf 50 Milliliter aufzufüllen. Verteilen Sie diese Menge auf zwei 50-Milliliter-Röhrchen, von denen jedes 25 Milliliter Zellsuspension enthält. Unterlagern Sie die Zellen in jedem Röhrchen langsam und vorsichtig mit jeweils 10 Milliliter eines Dichtezentrifugationsmediums, wie beispielsweise Ficoll.

Zentrifugieren bei 1200 × g für 20 Minuten ohne Pause. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig die Grenzfläche aus jedem Röhrchen und überführen Sie sie in zwei separate 50-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie das Volumen jeder Grenzflächenprobe mit PBS auf 50 Milliliter ein.

Und dann bei 300 × g sieben bis 10 Minuten lang zentrifugieren. Vereinigen und waschen Sie die Zellpellets dreimal mit 50 Milliliter PBS, der 2 % FBS enthält, wobei jedes Mal bei 300 × g sieben bis 10 Minuten zentrifugiert wird. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt das Pellet in 50 Milliliter RPMI-Medium mit 10 % FBS resuspendieren.

Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Danach sortieren Sie die CD34-positiven Zellen unverzüglich unter Verwendung eines CD34-Sortierkits gemäß der Herstelleranleitung und bewahren Sie sowohl den CD34-positiven als auch den CD34-negativen Anteil auf. Gießen Sie die Thymusstücke und das Medium aus dem Kolben in eine 60-Millimeter-Schale.

Kühlen Sie einige Kolbenhub-Pipettenspitzen, indem Sie sie in offene sterile 1,5-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen auf Eis legen. Stellen Sie außerdem die Zellpellets und eine Menge einer gelartigen Proteinmischung, wie beispielsweise Matrigel, auf Eis. Betäuben Sie die Empfängermäuse mit einem injizierbaren Anästhetikum gemäß einem genehmigten Tierversuchsprotokoll.

Überprüfen Sie die Anästhesietiefe der Maus durch leichtes Zusammendrücken einer Pfote. Das Fehlen einer Reaktion auf den Druckreiz zeigt eine operative Anästhesietiefe an. Rasieren Sie die linke Seite jeder Maus von der Hüfte bis zur Schulter zwischen der Rückenmitte und dem Bauch.

Injizieren Sie sechs Milligramm pro Kilogramm verdünntes Carprofen subkutan in das Schulter- oder Leisten-Dreieck des Tieres. Spülen Sie die Kanüle des Trokar mit PBS in einer 60-Millimeter-Schale aus. Legen Sie mit einem Paar stumpfer gekrümmter Pinzetten ein Stück Thymus aus der 60-Millimeter-Schale direkt neben die Öffnung der Kanüle und ziehen Sie anschließend den Trokar zurück, um das Gewebe in die Kanüle aufzusaugen.

Als Nächstes eine positive-Verdrängungspipette und eine gekühlte Spitze verwenden, um fünf Mikroliter kalte, gelartige Proteinmischung in das Röhrchen mit dem Zellpellet hinzuzufügen. Vorsichtig umrühren, um die Zellsuspension herzustellen. Die Zellsuspension in die Öffnung der Kanüle pipettieren und den Trokar langsam zurückziehen, um die Nadel zu beladen.

Bepinseln Sie den rasierten Bereich der Maus dreimal abwechselnd mit Povidon-Iod und Isopropanol. Bestimmen Sie die dunkelste Stelle unter der Haut, die die Lage der Milz anzeigt. Die Niere befindet sich etwa fünf Millimeter dorsal zur Milz.

Nachdem durch das Fehlen einer Reaktion auf einen Pfotenquetsch eine geeignete Anästhesietiefe sichergestellt wurde, die Haut mit einer gebogenen Pinzette anheben und mit einer chirurgischen Schere einen 15 Millimeter langen Schnitt in der Haut parallel zur Milz durchführen. Danach einen ähnlichen Schnitt in der darunterliegenden Peritonealschicht anlegen. Bei Männchen ist die Niere leicht sichtbar und kann durch Druck auf den Bauch einfach hervortreten.

Stützen Sie die Niere mit einer Hämostaseklemme oder einem Paar gebogener stumpfer Pinzetten. Bei weiblichen Tieren behindern die Eierstöcke häufig die einfache Entnahme der Niere. Heben Sie mit einer Hämostaseklemme den Eierstock an und legen Sie vorsichtig die Niere frei.

Verwenden Sie eine nadelspitze Pinzette, um ein winziges Loch am hinteren Ende der Nierenkapsel zu erzeugen. Führen Sie den Trokar in dieses Loch und entlang der Niere ein, bis die Öffnung der Kanüle vollständig von der Nierenkapsel bedeckt ist. Drücken Sie das Gewebe unter der Nierenkapsel vorsichtig heraus und ziehen Sie den Trokar anschließend zurück.

Verwenden Sie die gebogenen Pinzette, um sicherzustellen, dass das Thymusstück nicht zusammen mit der Nadel wieder herauskommt. Heben Sie anschließend das Peritoneum mit der Pinzette an und schieben Sie vorsichtig mit der Hämostaseklemme die Niere wieder in ihre Position. Führen Sie einen doppelt verknoteten Stich mit chirurgischem Nahtmaterial im Peritoneum aus.

Platzieren Sie außerdem zwei Autoclips-Wundclips, um die Haut zu schließen. Mischen Sie nun die transduzierten CD34-positiven Zellen und pipettieren Sie 0,5 mal 10 hoch 6 Zellen in einem Volumen von 100 Mikroliter in eine Insulinspritze. Injizieren Sie diese Zellen über eine retroorbitale Veneninjektion in die Maus.

Nach der Injektion einen kleinen Tropfen Augenschmiermittel auf jedes Auge tupfen und die Maus wieder in einen Käfig auf die Seite legen. Nachdem alle Mäuse implantiert wurden, überprüfen, ob die Tiere das Bewusstsein wiedererlangt haben und sich fortbewegen können, bevor sie in den Aufzuchtraum zurückgebracht werden. Die Mäuse wurden 10 Wochen nach der Operation getötet, und Blut, Milz, Thymus und Knochenmark wurden entnommen.

Die resultierenden Zellen wurden mit anti-humanen CD45- und anti-humanen CD4-Antikörpern gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Wie hier zu sehen ist, können CD4-Chimäre-Antigen-Rezeptor-modifizierte Zellen in mehreren lymphatischen Geweben mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Die CD4-Chimäre-Antigen-Rezeptor-modifizierten Zellen können sich in mehrere Linien differenzieren.

Hier wurden Splenozyten von CD4-Chimären-Antigen-Rezeptor-modifizierten Mäusen gewonnen und für Marker von T- und B-Zellen gefärbt. Zellen, die negativ für T- und B-Zellmarker waren, zeigten Positivität für Marker von Monozyten und Makrophagen sowie für natürliche Killerzellen. Splenozyten von HIV-infizierten CD4-Chimären-Antigen-Rezeptor-Mäusen wurden entweder mit HIV-infizierten oder nicht infizierten T-Eins-Zellen stimuliert, und ihre intrazelluläre Zytokinproduktion ist dargestellt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie humanisierte BLT-Mäuse, die mit chimären Antigenrezeptoren modifiziert wurden, hergestellt werden. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 48 Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, ein gleichmäßiges Arbeitstempo beizubehalten und genau auf den Zustand der operierten Maus zu achten.

Für Anfänger ist es wichtig, die Chirurgie und Augeninjektionen zu üben, bevor sie mit wertvolleren Geweben und Stammzellen arbeiten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet von HIV und anderen Infektionskrankheiten den Weg, um die Krankheitspathogenese und immunbasierte Therapien im humanisierten Mausmodell zu erforschen.