Visualisierung von Caenorhabditis elegans Cuticle Strukturen mit der lipophilen Vital Dye, DiI

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Nagelhaut in transparenter, lebendiger Meereseleganz mit dem rot fluoreszierenden lipophilen Farbstoff "Dye Eye" sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem eine Population von Nematoden für die Färbung vorbereitet wird. Als nächstes wird der Population verdünntes Färbeauge hinzugefügt und sie dürfen inkubieren.

Dann werden die Tiere aus der Färbelösung geborgen. Die Fluoreszenzbildgebung der Dai-gefärbten Kutikula zeigt Details auf der Oberfläche, einschließlich der Fortpflanzungsstrukturen der Augen von Ailey und Ann und anderer äußerer morphologischer Merkmale. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Visualisierung der Kutikula in diesem transparenten Organismus wie direkte Bildgebung, Fluoreszenz, Transgenexpression, Antikörperfärbung, Elektronenmikroskopie und markiertes Weizenkeim-Agglutinin besteht darin, dass diese Technik relativ schnell und kostengünstig durchzuführen ist und eine schöne Auflösung der Kutikularstrukturen bei lebenden Tieren liefert.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in vielen Bereichen zu beantworten, die das Sea Elegance-Modellsystem und seine Kutikula verwenden, wie z. B. Zellsekretion und Kutikulaorganisation, epidermale Zellentwicklung, heterochronische Genwege, angeborene Immunität, Entwicklung morphologischer Merkmale und Nematodenevolution. Das Verfahren wird von Robbie Schultz, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Wenn Sie mit D Eye arbeiten, denken Sie daran, dass es lichtempfindlich ist.

Schützen Sie D Auge immer vor Licht, indem Sie es in Folie einwickeln. Tragen Sie auch Handschuhe und einen Laborkittel, da DMF giftig ist und DAI ein Auto ist. Cyanid Dai ist sehr stark.

Eine Arbeitsverdünnung in Standardstärke beträgt 30 Mikrogramm pro Milliliter DII in M neun, und eine einzelne Population benötigt nur 400 Mikroliter Arbeitsverdünnung. Beginnen Sie mit einer 60-Millimeter-Platte, die mit nicht kontaminierten Nematoden besiedelt ist. Waschen Sie die Tiere vom Teller in 1,5 Millilitern 0,5% Triton X 100.

In M nine buffer die Flüssigkeit vorsichtig in kreisenden Bewegungen schwenken, um alle Larven und erwachsenen Tiere zu lösen, und dann die Wäsche in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Schleudere die Tiere sofort 30 Sekunden lang bei 2000 UVP M herunter, um die Tiere am Boden der Röhre einzusammeln. Entsorgen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne die Tiere zu stören.

Sei vorsichtig, nicht gierig. Waschen Sie die Tiere mit einem Milliliter M neun. Schleudern Sie nach unten und entfernen Sie den Überstand.

Wiederholen Sie den Waschvorgang. Wieder nach unten drehen und den Überstand entfernen. Weiter bei 400 Mikrolitern von 30 Mikrogramm pro Milliliter Dai in M neun zur Tube.

Wirbeln Sie das Rohr kurz ein, um die Tiere wieder aufzuwirbeln. Schütteln Sie dann das Rohr bei 20 Grad Celsius in horizontaler Position für drei bis 16 Stunden bei 350 U/min in einer lichtgeschützten Umgebung. Das Timing dieser letzten Schritte ist wichtig.

Zuerst muss der Triton X abgewaschen werden, bevor er die Lipide entfernt, die der Dai bindet. Zweitens müssen die Tiere lange genug in Färbeaugenlösung gefärbt werden, damit die Kutikula gleichmäßig gefärbt werden kann. Wenig später sollte man die Tiere lange genug auf dem Futter erholen lassen, um das ungebundene Auge zu entfernen.

Am Ende der Färbung schleudern Sie die Tiere herunter und entfernen Sie die Färbelösung. Waschen Sie die Tiere mit einem Milliliter M nine. Um ungebundene Farbe zu entfernen, schleudern Sie die Tiere herunter und entfernen Sie den Überstand.

Die Tiere werden wieder in 400 Mikroliter M neun Puffer suspendiert und auf einen bakterienfreien Teil einer NGM-Mikroplatte gegossen. Mit OP 50 E besiedelte Coli ermöglichen es den Tieren, sich im Dunkeln mindestens 30 Minuten lang zu erholen, jedoch nicht länger als einen Tag, da die Fluoreszenz des Farbstoffs während der Erholungszeit nachlässt. Die Tiere sollten von der Färbeflüssigkeit wegkriechen und auf das Futter kriechen.

Diese Tiere sind leichter abzubilden, da sie weniger Hintergrundfluoreszenz durch freies Farbauge haben. Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines Agri-Pads auf einer Folie, um eine gleichmäßige Dicke des verwendeten Agri-Pads zu gewährleisten. Zwei Abstandshalter.

Ein Abstandshalter wird hergestellt, indem zwei Stücke Laborklebeband auf einen Objektträger geschichtet werden. Abstandshalter können unbegrenzt verwendet werden. Ordnen Sie als nächstes einen sauberen Glasobjektträger der Länge nach zwischen zwei Abstandshaltern an und pipettieren Sie etwa 150 Mikroliter geschmolzenes Vier-Agar.

Auf die Mitte des sauberen Objektträgers. Decken Sie die geschmolzene AER schnell mit einem zusätzlichen Objektträger ab, der senkrecht über die AER und beide Abstandshalter gelegt wird, um ein Agarpad zu bilden. Schieben Sie den Abdeckschieber vorsichtig ab und halten Sie das Pad mittig auf der Oberseite des Montageschlittens.

Pipettieren Sie nun fünf Mikroliter Nematoden-Anästhetikum auf das Pad, setzen Sie acht bis 12 Tiere in die Betäubung und bedecken Sie sie vorsichtig mit einem Mikroskop-Deckblatt. Beobachten Sie die Tiere mit einem Verbund- oder Konfokalmikroskop, das mit mindestens einem 40-fach-Objektiv und einem Trissy-Filter oder einem anderen kompatiblen Filter ausgestattet ist. Das Fluoreszenzanregungsmaximum des Farbstoffauges beträgt 549 Nanometer und das Emissionsmaximum 565 Nanometer.

Für gebundene Die ist die Bildgebung der anspruchsvollste Teil dieses Protokolls. Wir zeigen, wie man Tiere für die Bildgebung montiert, aber Sie müssen auf dem Gelände oder dem konfokalen Zielfernrohr, das Sie verwenden werden, richtig geschult sein. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung eines Objektivs mit mindestens 60-facher Vergrößerung am besten geeignet ist, um die mit der Färbemethode beleuchteten Details aufzulösen.

Jedes der Bilder in diesem Abschnitt wurde mit einem 63-fach-Objektiv in Poster-embryonaler Robben-Eleganz aufgenommen. Die Nagelhautoberfläche enthält jährlich voneinander getrennte umlaufende Furchen und in einigen Stadien Längsleisten, die Ailey genannt werden. Jedes der Bilder in diesem Abschnitt wurde mit einem 63-fach-Objektiv in postembryonaler C-Eleganz aufgenommen.

Die Kutikulaoberfläche enthält annualisiert, getrennt durch umlaufende Furchen und in einigen Stadien Längsleisten, die Aley genannt werden. Jedes Entwicklungsstadium weist Kutikulastrukturen mit unterschiedlichen Zusammensetzungen und Mustern, Rillen oder Furchen sowohl aus aley- als auch aus Aly-Fluoreszenzfärbung auf. Abhängig von der Oberflächenbeschaffenheit.

In allen Larven- und adulten Stadien, in denen diese Färbemethode angewendet wird, bleiben sie bis zu einem Tag nach der Genesung sichtbar. Fluoreszierende Hintergrundflecken werden manchmal, aber nicht routinemäßig beobachtet. Dies ist die Kutikula adulter mutierter Tiere mit mäßigen Defekten der Kutikulaorganisation.

Ailey-Grate sind diskontinuierlich und überzählig. Ailey-Leisten sind verschmolzen und verzweigt oder gegabelt, ein häufiger transgener Marker. Ein dominantes Roll-Six-Allel verursacht eine Verdrehung der Kutikula, die in der Ailey zu sehen ist und zu einer unregelmäßigen Musterung der Anulen führen kann.

Dai färbt auch andere äußere Kutikulastrukturen, einschließlich des adulten Hermaphroditen, der Vulva und des adulten männlichen Schwanzes, und Fan Dai kann auch subtile Defekte in der äußeren Morphologie hervorheben, wie z. B. diesen gegabelten Schwanz, eine unzureichende Färbung. Zum Beispiel führt eine zweistündige Färbung zu einer fleckigen kutikulären Färbung, obwohl sich Neuronen mit Umwelteinflüssen verfärben können. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden durchgeführt werden, ohne Bildgebung, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Eleganz des Meeres mit dem Auge für die Beobachtung der Nagelhaut und anderer äußerer morphologischer Strukturen färbt.