Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Dieses Protokoll zeigt, wie dynamische Ereignisse in frühen CL-Embryonen mit Norky DIC-Optik oder Fluoreszenz unter Verwendung weit verbreiteter Mikroskope und Open-Source-Software abgebildet werden können. Das Protokoll beginnt mit der Beschreibung, wie CL-gans-Embryonen präpariert und für die Bildgebung eingesetzt werden. Dann wird die korrekte Einstellung des DIC oder der maskierenden Optik überprüft, um optimale Bilder bei höchster Detailgenauigkeit zu gewährleisten.

Die Kalibrierung von Weitfeld-Epi-Fluoreszenz und -Beleuchtung wird ebenfalls überprüft, um gute Fluoreszenzbilddaten in Kombination mit Open-Source-Software zu sammeln. Eine gute Mikroskopie kann die zelluläre Dynamik in einem sich entwickelnden Embryo sichtbar machen. Visuelle Illustrationen dieser Methode sind von entscheidender Bedeutung, da es schwierig ist, D iic Optics richtig einzurichten, da die Terminologie verwirrend sein kann und die richtige Technik schwer in schriftlicher Form zu beschreiben ist.

Darüber hinaus sollten Forscher darauf achten, die Lichtexposition bei der Durchführung von Fluoreszenzbildgebung zu minimieren. Um Phototoxizität und Photobleiche zu begrenzen Um Embryonen für die Bildgebung vorzubereiten, stellen Sie zunächst zwei Montagelösungen her. Eine ist geschmolzene Vaseline und die andere besteht aus zwei bis 3 % Puffer.

Dichtere Aros können hergestellt werden, wenn die abzubildenden Strukturen sehr zerbrechlich sind, wobei darauf zu achten ist, dass kein Kochen entsteht. Beide Stammlösungen werden in der Mikrowelle geschmolzen und dann als vier bis fünf Milliliter Aliquote gelagert. Am Tag der Bildgebung schmelzen Sie ein Aliquot der Vaselinelösung in einem 65 bis 70 Grad Celsius heißen Block und schmelzen Sie ein Aliquot der aufgestiegenen Lösung in der Mikrowelle.

Auch hier ist das Kochen zu vermeiden. Um diese Lösungen geschmolzen zu halten, lagern Sie sie in einem Wärmeblock. Decken Sie als Nächstes die Ober- und Unterseite von zwei Objektträgern mit einem Streifen Laborklebeband ab und positionieren Sie einen sauberen Objektträger zwischen den beiden geklebten Objektträgern.

Spritzen Sie nun ein paar Tropfen des geschmolzenen Aros auf den sauberen Objektträger und bedecken Sie ihn mit einem weiteren sauberen Objektträger. Der Aros breitet sich zu einem dünnen quadratischen Pad aus, auf dem das Wurmpad vorbereitet ist. Verwenden Sie ein Präparierfernrohr und einen Platindrahtpickel, um zwei adulte Würmer auf einen neun bis 12 Mikroliter großen Puffer auf einem 18 x 18 Millimeter großen Deckglas zu übertragen.

Dann schneiden. Öffnen Sie die Würmer mit einer Nadel oder einem Skalpell, um die Embryonen mit der Agarro-Seite nach unten freizusetzen. Positionieren Sie das Wurmpad auf dem 18 x 18 Millimeter großen Deckschirm und rasieren Sie überstehende Agar ab.

Um den Deckglas zu versiegeln, tragen Sie schließlich die geschmolzene Vaselinelösung mit einem Pinsel oder Zahnstocher entlang des Umfangs auf. Die Zellen sind nun bereit für die Bildgebung. Wenn Sie den Objektträger auf das Mikroskop legen, stellen Sie sicher, dass die beiden Polarisatoren senkrecht zueinander ausgerichtet sind.

Stellen Sie sicher, dass sich sowohl die Wandelemente als auch die Prismen außerhalb des Lichtpfads befinden. Wenn das Feld nicht dunkel ist, drehen Sie den Polarisator unter dem Kondensor, bis er jetzt ist. Finden Sie die Embryonen mit dem 10-fachen Ziel.

Suchen Sie in der Nähe der Wurmkörper nach Gruppen junger Embryonen, um mehrere Embryonen im Bildgebungsfeld zu erhalten. Vermeiden Sie Embryonen im Inneren des Wurms, um die besten Bilder zu erhalten. Wenn die besten Embryonen gefunden sind, wechseln Sie zu einem Ziel mit höherer Leistung.

Schalten Sie nun den Filterwürfel auf DIC. Setzen Sie dann das obere Walstone-Prisma des Objektivs in den Strahlengang ein und drehen Sie die Torte auf dem Kondensor, um das untere Walstone-Prisma auszuwählen, das zum Objektiv passt. Wenn die Prismen angebracht sind, passen Sie den Schieberegler unter diesem Turm an die numerische Apertur des Objektivs an.

Um die optimale Kohler-Beleuchtung zu erhalten, fokussieren Sie den Kondensor, bis der Rand der Kondensorblende am steilersten erscheint. Am schärfsten ist es, wenn der Rand zwischen hellem Schwarz am schärfsten oder scharf ist. Um einen optimalen Kontrast zu erzielen, passen Sie die Apfelwand und das Prisma an, indem Sie den Knopf am Schieberegler drehen.

Jetzt ist das Mikroskop fast einsatzbereit. Es ist an der Zeit, zusätzliche Bildgebungsparameter auf dem Computer mit Mikromanagern und Open-Source-Software zu steuern. Beginnen Sie damit, die Kameraverstärkung auf Null zu setzen.

Wechseln Sie dann zum Speichern von Dateien als Acht-Bit- und nicht als 16-Bit-TIFF. TIFF-Dateien können später mit Open-Source-Software wie Image J analysiert werden.Stellen Sie anschließend die Lichtstärke so ein, dass die hellsten Pixel knapp unter den Sättigungswerten liegen. Wenn alles richtig gemacht wurde, sieht das Bild in 3D aus, wobei das Licht in einem Winkel einzufallen scheint.

Jetzt, da das Bild brillant aussieht, wählen Sie die Embryonen aus, die Sie abbilden möchten, und zeichnen Sie eine Region von Interesse. Wenn das Mikroskop über einen Fokusmotor verfügt, verwenden Sie diesen, um mehrere Fokusebenen gleichzeitig zu erfassen. Öffnen Sie das mehrdimensionale Aufnahmefenster und stellen Sie die obere und untere Ebene des Z-Stapels ein, indem Sie den Fokusregler so einstellen, dass die erste und letzte Fokusebene mit einigen Jochkörnern im Fokus gefunden werden.

Legen Sie die Schrittweite fest. Dadurch wird die Anzahl der gesammelten Fokusebenen definiert. Legen Sie nun ein Zeitintervall fest, das lang genug ist, um alle Fokusebenen zu erfassen.

Die maximalen Zeitpunkte können sehr hoch angesetzt werden, so dass die Software Bilder aufnimmt, bis sie manuell gestoppt wird. Stellen Sie die Software so ein, dass nur das zuletzt aufgenommene Bild angezeigt wird, damit der Prozess überwacht werden kann. Geben Sie nun den Bildern einen Dateinamen und beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern.

Bildanalyse wird am Ende des nächsten Abschnitts kurz besprochen. Die Erstellung eines GFP-Films ist ähnlich wie die Erstellung von Four D oder Musky DIC, aber es wird eine Konfigurationsdatei verwendet, die die Softwaresteuerung des Fluoreszenz-Shatters enthält. Stellen Sie stattdessen, wenn sich die Embryonen befinden, sicher, dass sich das obere Walstonerprisma nicht im Strahlengang befindet, und schalten Sie den Filterwürfel auf F-I-T-C-G-F-P.

Wenn dies beim Start mit der Software nicht automatisch eingestellt wurde, stellen Sie sicher, dass die Kameraverstärkung auf 255 eingestellt ist. Eine Bilddatei wird auf das 16-Bit-TIFF-Format eingestellt. Schalten Sie nun die Durchlichtquelle aus und klicken Sie auf Live-Bild.

Passen Sie die Intensität der UV-Lichtquelle und die Belichtungszeit an, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis für das Fluoreszenzsignal zu erreichen, halten Sie jedoch die Lichteinwirkung auf ein Minimum, um die Zellen zu schonen. Richten Sie als Nächstes das Zeitintervall ein. Die Anzahl der Zeitpunkte und die Anzahl der Fokusebenen verlaufen nun mit der Bildaufnahme, wie zuvor beschrieben.

Um die Filme zu analysieren, verwenden Sie Open-Source-Software. Image J mit installiertem Micromanager-Plugin Sehr große Filme können auch mit dem Loci-Plugin in Image J importiert werden. Hierbei handelt es sich um einen Wildtyp-Embryo, der mit einer nicht maskierten DIC-Optik eingefangen wurde.

Der hintere Bereich befindet sich unten rechts und der ventrale Bereich links unten. Der Film zeigt eine Sequenz von Bildern mit einer Brennebene, die alle 15 Sekunden aufgenommen werden. Die Wiedergabe ist auf 14 Bilder pro Sekunde eingestellt.

Dieser Embryo exprimiert Fluoreszenz während der ersten Embryonalteilung, hier hinten oben rechts. Dieser Film zeigt die Veränderungen in einer einzelnen Fokusebene alle 10 Sekunden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man lebende Embryonen sowohl mit der DIC-Naski-Optik als auch mit der Epi-Fluoreszenz abbildet, um dynamische Ereignisse zu untersuchen.

Wir hoffen, dass Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie Sie die DIC Nomar-Optik einrichten können, um optimale Bilder zu erhalten, und dass Sie mit der Epi-Fluoreszenzbeleuchtung qualitativ hochwertige Fluoreszenzdaten erhalten können und nicht immer auf fortschrittlichere Mikroskope angewiesen sind. Sie können diese bildgebenden Verfahren auch anwenden, um Embryonen ohne spezifische Genfunktion zu untersuchen und die genetischen Anforderungen für Ihre Lieblingsereignisse während der Zellteilung oder -entwicklung weiter zu untersuchen.