Ethanolfixierung und DAPI-Färbung: Eine Methode zur Visualisierung von DNA in C. elegans

- Beginnen Sie mit einem Tropfen Pufferlösung auf einem Objektträger und übertragen Sie intakte Würmer auf das Tröpfchen. Sobald die Würmer an Ort und Stelle sind, verwende ein fusselfreies Taschentuch, um den Puffer aufzusaugen und zu entfernen. Fixieren Sie die Probe, indem Sie die Proben mehrmals mit 90%igem Ethanol baden, damit es nach jeder Anwendung verdampfen kann.

Sobald das Ethanol nach der letzten Spülung verdampft ist, fügen Sie der Probe eine Lösung hinzu, die den Nukleinsäurefarbstoff DAPI enthält. DAPI bindet bevorzugt an Adenin- und Thyminbasen in der kleinen Rille der DNA. Wenn der DAPI-DNA-Komplex gebunden ist, absorbiert er UV-Licht und emittiert sichtbares blaues Licht.

Fügen Sie anschließend ein Anti-Fade-Konservierungsmittel hinzu, um die Haltbarkeit der Probe zu verlängern. Bringen Sie ein Deckglas an und versiegeln Sie es mit dem Objektträger. Verwenden Sie dann ein Fluoreszenzmikroskop mit Blaufilter, um DAPI-Körper sichtbar zu machen, die je nach Zelle und ihrem Zyklusstatus einzelne Chromosomen, Schwesterchromatidenpaare oder ganze Zellkerne darstellen können. In diesem Experiment werden wir DAPI-gefärbte Schwesterchromatidenpaare in Eizellen zählen, um tetraploide Stämme von Caenorhabditis elegans zu identifizieren.

- Tetraploide Stämme haben 12 Chromosomenpaare, die durch Zählen der DAPI-gefärbten Körper in unbefruchteten Eizellen validiert werden können. Geben Sie dazu fünf bis zehn Mikroliter M9-Puffer auf einen Objektträger und überführen Sie sechs bis 10 mutmaßliche Tetraploide in den Tropfen. Nehmen Sie den M9 unter einem Präpariermikroskop vorsichtig in ein fusselfreies Reinigungstuch auf.

Geben Sie dann 10 Mikroliter 90%iges Ethanol auf die Würmer und beobachten Sie, wie das Ethanol vollständig verdampft. Sobald die Verdunstung abgeschlossen ist, wiederholen Sie den Vorgang der Zugabe von Ethanol und beobachten Sie, wie es verdampft. Fügen Sie insgesamt 10 Mikroliter in vier Anwendungen hinzu. Nachdem der letzte Tropfen verdunstet ist, fügen Sie sechs Mikroliter DAPI mit zwei Nanogramm pro Mikroliter oder einen ähnlichen Farbstoff hinzu.

Für die Langzeitlagerung der Dias montieren Sie die Würmer in ein handelsübliches oder selbstgemachtes Anti-Fade-Mittel. Füge dann ein Deckglas hinzu und versiegele die Ränder mit Nagellack. Nachdem der Nagellack getrocknet ist, können die Slides geritzt werden. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop und eine 100-fache Vergrößerung.

Finden Sie zunächst die reifste unbefruchtete Eizelle, die unmittelbar an die Spermathek angrenzt und noch weder in die Spermathek noch in die Gebärmutter gelangt ist. Bei den DAPI-Körpern handelt es sich vermutlich um einzelne Chromosomenpaare. Fokussieren Sie sich dann auf den Kern der Eizelle und verwenden Sie den Feinfokus des Mikroskops, um ihn langsam von oben nach unten zu scannen, während Sie die DAPI-Körper zählen. Zählen Sie dann die DAPI-Körper im selben Kern nach, indem Sie den Fokus von unten nach oben verschieben.

Wildtyp-Eizellen haben im Durchschnitt sechs DAPI-Körper. Das Vorhandensein von 12 DAPI-Körpern deutet darauf hin, dass es sich bei den Tieren dieses Stammes entweder um partielle oder vollständige Tetraploide handelt. Analysieren Sie mindestens 10 Tiere pro Stamm. Oft liegen die Chromosomenpaare sehr nahe beieinander oder berühren sich, so dass die Anzahl der DAPI-Körper oft kleiner ist als die tatsächliche Anzahl der Chromosomenpaare.