DOI: 10.3791/3410-v
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FRET-basierten Reporter werden immer häufiger eingesetzt, um Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten in lebenden Zellen zu überwachen. Hier beschreiben wir eine Methode auf, wie FRET-basierten Reporter nutzen, um den Zellzyklus-abhängige Veränderungen in Ziel-Phosphorylierung zu beurteilen.
In diesem Video werden die Kinase- und Phosphatase-Aktivitäten während des gesamten Zellzyklus mit Hilfe des Forrester Resonance Energy Transfer oder Bündes überwacht. Hier hat eine Polo-ähnliche Kinase eins oder LK eine Aktivitätssonde mit cyan fluoreszierendem Protein CFP an einem Ende und gelb fluoreszierendem Protein YFP mit gelb fluoreszierendem Protein YFP an einem Ende. Diese Sonde wird in U2-OS-Zellen transfiziert.
Um dann den Phosphorylierungsstatus von LK one Targets während des G two two M Übergangs zu untersuchen, werden die TRANSFIZIERTEN U2 OS-Zellen einer Zeitraffer-Fluoreszenzbildgebung unterzogen. Wenn CFP und YFP in unmittelbarer Nähe sind und CFP angeregt wird, wird Energie auf YFP übertragen und der YFP-Eintritt kann nachgewiesen werden. Wenn die Sonde jedoch phosphoryliert wird, trennt eine bestätigende Veränderung des Proteins CFP und YFP.
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