Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

In diesem Video werden die Kinase- und Phosphatase-Aktivitäten während des gesamten Zellzyklus mit Hilfe des Forrester Resonance Energy Transfer oder Bündes überwacht. Hier hat eine Polo-ähnliche Kinase eins oder LK eine Aktivitätssonde mit cyan fluoreszierendem Protein CFP an einem Ende und gelb fluoreszierendem Protein YFP mit gelb fluoreszierendem Protein YFP an einem Ende. Diese Sonde wird in U2-OS-Zellen transfiziert.

Um dann den Phosphorylierungsstatus von LK one Targets während des G two two M Übergangs zu untersuchen, werden die TRANSFIZIERTEN U2 OS-Zellen einer Zeitraffer-Fluoreszenzbildgebung unterzogen. Wenn CFP und YFP in unmittelbarer Nähe sind und CFP angeregt wird, wird Energie auf YFP übertragen und der YFP-Eintritt kann nachgewiesen werden. Wenn die Sonde jedoch phosphoryliert wird, trennt eine bestätigende Veränderung des Proteins CFP und YFP.

Wenn nun CFP angeregt wird, wird eine starke CFP-Emission und nur eine schwache YFP-Emission nachgewiesen. Die Quantifizierung des Verhältnisses der YFP-Emission nach CFP- und YFP-Anregung zeigt, dass die PLK-Aktivität in G zwei zunimmt und während der Mitose ihren Höhepunkt erreicht. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der standardmäßigen geometrischen Filmung besteht also darin, dass besonders darauf geachtet wird, dass der Zellzyklus weder durch die Filmbedingungen noch durch die Expression einer Sonde gestört wird. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Zellzyklus zu beantworten, z. B. wo und wann bestimmte Kinasen oder Phosphatasen aktiviert werden.

Obwohl diese Methode Einblicke in zellzyklusregulierte Enzyme geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, bei denen unaufgelöste Bedingungen erforderlich sind, wie z. B. Zellproliferationsassays. Um den menschlichen Zellzyklus zu überwachen, werden U2-OS-Zellen mit einer bundbasierten PK-Eins-Aktivitätssonde transfiziert. Bei einer Standardmethode der Calciumphosphat-Transfektion werden die Zellen für mindestens sieben Tage in purem Mycin selektiert.

Dadurch wird die Population der Zellen, die die Sonde exprimieren, angereichert und die Anzahl der Zellen mit toxischen Expressionsniveaus oder Expressionsniveaus, die den Zellzyklus stark beeinflussen, begrenzt. Stabile Klone werden dann durch begrenzte Verdünnungsexpression von CFP selektiert und YFP untersucht, um sicherzustellen, dass sie in allen Zellen in etwa demselben Verhältnis vorhanden sind. Wenn einige Zellen nur CFP oder YFP enthalten, ist in diesem Fall wahrscheinlich eine Rekombination aufgetreten, wiederholen Sie die Plasmidvorbereitung mit Bakterien, die weniger anfällig für homologe Rekombination sind, wie z. B. zwei Zellen, die dann das Plasmid linearisieren und die Transfektion wiederholen.

Sobald die Zellen die Sonde stabil exprimieren, säen Sie sie auf Glasbodenschalen Nummer 1,5, nachdem sie sich anheftet haben und zu 30 bis 50 % konfluent sind. Wechseln Sie das Medium zu einem Medium, das CO2-unabhängig ist und kein Phenolrot enthält. Montieren Sie die Zellen auf ein motorisiertes Epi-Fluoreszenzmikroskop mit einer Temperaturregelung von 37 Grad Celsius. Das Mikroskop sollte mit CFP- und YFP-Anregungs- und Emissionsfiltern ausgestattet sein.

Ein ROIC-Spiegel, der für die Überwachung von CFP und YFP geeignet ist, und ein Objektiv, das für die erforderliche Auflösung geeignet ist. Hier kommt ein 20 x NA 0,75 Luftobjektiv zum Einsatz. Bringen Sie die Zellen mit Durchlicht in den Fokus.

Verwenden Sie zu diesem Zeitpunkt kein Leuchtstofflicht, da dies eine Stressreaktion hervorruft, die den Zellzyklus stören kann. Um Phototoxizität zu vermeiden, stellen Sie die Biegung auf das Maximum ein, das die erforderliche subzelluläre Auflösung zulässt. Für dieses Experiment sollte es möglich sein, den Zellkern und das Zytoplasma zu unterscheiden.

Stellen Sie eine kurze Belichtungszeit ein und setzen Sie einen Filter mit hoher Neutraldichte ein. Nehmen Sie dann ein 12- oder 16-Bit-Testbild auf. Passen Sie unter Verwendung der YFP-Anregung und -Emission die Belichtungszeit und die Neutraldichtefilter so an, dass die durchschnittliche Intensität in einer Zelle ungefähr der Hintergrundintensität zuzüglich des Fünffachen der Differenz zwischen minimaler und maximaler Hintergrundintensität entspricht. Um sicherzustellen, dass die Bilder nicht gesättigt sind, untersuchen Sie die Fluoreszenzintensität für das Probenbild.

Die maximale Intensität im Bild sollte weniger als die Hälfte des Dynamikbereichs betragen, um Intensitätsunterschiede zu berücksichtigen, wenn Zellen in die Mitose eintreten. Wiederholen Sie diesen Vorgang anschließend mit CFP-Anregung und YFP-Emissionsfiltern. Wählen Sie mehrere Bereiche mit transfizierten Zellen aus, mit Ausnahme der Bereiche, die zum Fokussieren und Optimieren der Belichtungsbedingungen verwendet werden.

Da diese Verfahren möglicherweise eine Stressreaktion hervorgerufen haben, stellen Sie sicher, dass die maximale Intensität in allen Zellen weniger als die Hälfte des dynamischen Bereichs beträgt. Weisen Sie die Software an, alle 45 Minuten zwei Bilder mit YFP-Anregung, YFP-Emission und CFP-Anregung aufzunehmen. YFP-Emissionsfilter.

Legen Sie außerdem fest, dass die Gesamtlänge des Experiments die Dauer des Zellzyklus überschreitet. Sobald alles eingestellt ist, beginnen Sie mit der Bildaufnahme, nachdem die Aufnahme abgeschlossen ist, öffnen Sie die aufgenommenen Bilder und überwachen Sie die Zellzykluszeit von Mitose zu Mitose. Bei Zellen, die die transfizierte Sonde hier exprimieren, betrug die Zellzykluszeit etwa 20 bis 25 Stunden.

Vergleichen Sie dies mit den Kontrolldaten für den verwendeten Zellentyp. Wenn die Zellzykluszeit den Referenztimings entspricht, kann der Bund analysiert werden. Sobald das Timing überprüft wurde, können die Bilder analysiert werden.

Die Analyse kann von den meisten Softwares für die Mikroskopie durchgeführt werden. Hier wird die Freeware image j mit dem ratio plus Plugin verwendet. Beginnen Sie die Analyse, indem Sie die Bilder in Bild J öffnen.Wenn die Bilder in einem mehrfarbigen Stapelformat vorliegen, trennen Sie die einzelnen Kanäle, indem Sie sie in einen Hyperstapel konvertieren

Dann Hyper-Stack und dann Stack zu Hyper-Stack. Das Fenster "In Hyper-Stack konvertieren" wird geöffnet, in dem die Einstellungen angezeigt werden. Klicken Sie auf "OK". Das Bild wird nun mit zwei Schiebereglern darunter angezeigt.

Klicken Sie neben dem Aufteilen der Bilder in Einzelkanal-Stacks auf das Bild und wählen Sie Hyper-Stack Reduce Dimensionality. Dadurch wird das Verkleinerungsfenster geöffnet, stellen Sie sicher, dass Frames und Quelle beibehalten ausgewählt sind. Klicken Sie dann auf OK.

Ein neues Bild, das nur einen Kanal enthält, wird angezeigt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um ein neues Bild mit dem zweiten Kanal aufzurufen. Um die visuelle Klarheit der endgültigen Bilder zu erhöhen, wählen Sie als Nächstes den YFP-Anregungs-YFP-Emissionsstapel aus.

Klicken Sie auf Prozess und dann auf Mathematik. Dann multiplizieren Wenn sich das Multiplikationsfenster öffnet, geben Sie drei ein, um den YFP-Anregungs-YFP-Emissionsstapel mit drei zu multiplizieren. Der Schritt ist optional und stellt sicher, dass die Verhältnisse nicht im Bereich zwischen Null und Eins liegen.

Wählen Sie als Nächstes in der Symbolleiste von Bild J das Freihandwerkzeug aus. Zeichnen Sie dann in der YFP-Anregung, dem YFP-Emissionsstack, einen Bereich of Interest oder ROI in einem Bereich, der frei von Zellen ist, aber in der Nähe einer Zelle, die gemessen wird, um den ROI zum ROI-Manager hinzuzufügen, klicken Sie auf Analysewerkzeuge. Dann ROI-Manager.

Das Fenster des ROI-Managers wird angezeigt. Klicken Sie auf Hinzufügen, um die ROI-Koordinaten zu speichern und die durchschnittliche Intensität des ROI im YFP-Anregungs-YFP-Emissionsstack zu messen. Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie dann Messen.

Das Ergebnisfenster wird geöffnet. Wählen Sie den CFP-Anregungs-YFP-Emissionsstapel aus. Doppelklicken Sie dann im ROI-Manager auf den ROI und wiederholen Sie die Messung.

Die Messung wird dem Ergebnisfenster hinzugefügt. Scrollen Sie zu anderen Stellen im Stapel, um diesen Vorgang zu mehreren Zeitpunkten zu wiederholen. Stellen Sie sicher, dass die Hintergrundintensitäten in der Nähe der interessierenden Zelle im gesamten Film ähnlich sind, indem Sie die Messungen im Ergebnisfenster vergleichen.

Um die Messungen so einzustellen, dass sie eine minimale Intensität enthalten, klicken Sie auf Analysieren, klicken Sie dann auf Messungen festlegen und geben Sie den minimalen und maximalen Grauwert an. Als nächstes erscheint ein Fenster mit Messalternativen. Nachdem Sie Helligkeit und Kontrast nach Bedarf angepasst haben, zeichnen Sie einen ROI, der den größten Teil einer Zelle abdeckt, und messen Sie die minimale Intensität in beiden Stapeln.

Nehmen Sie dann Messungen wie zuvor vor, diesmal mit einer Zelle anstelle des Hintergrunds. Berechnen Sie anhand der Werte aus den Ergebnisabschnitten die Differenz zwischen der gemessenen minimalen Intensität und der Hintergrundintensität und dividieren Sie diese durch zwei. Dies bietet eine anfängliche Schätzung für ein Verhältnis von Clipping-Wert zu Öffnungen plus ausgewählte Plugins.

Dann Verhältnis plus. Wählen Sie dann für das Bundverhältnis den CFP-Anregungs-YFP-Emissions-S-Stack eins oder für das invertierte Bundverhältnis die Visualisierung von Sonden, bei denen die Bundeffizienz bei Phosphorylierung abnimmt. Wählen Sie den YFP-Anregungs-YFP-Emissions-S-Stack eins aus, um die gemessenen Hintergrundintensitäten und Clipping-Werte einzufügen.

Verwenden Sie die Werte aus dem Ergebnisfenster und fügen Sie sie in das Plus-Fenster ein. Legen Sie die Skalierung des resultierenden Verhältnisstapels fest, und wenden Sie eine geeignete Nachschlagetabelle an, um Verhältnisänderungen zu visualisieren. U2 OS-Zellen, die eine bundbasierte Sonde exprimieren, die die Aktivität von PLK 1 überwacht, wurden 60 Stunden lang gefilmt, wie in diesem Video beschrieben.

Dieses Bild zeigt den kumulativen mitotischen Eintritt von 50 Bundsonden-exprimierenden Zellen, einschließlich der Teilung von Tochterzellen. Die Mehrheit der Zellen, die die Sonde exprimieren, vermehren sich mit einer Zellzykluszeit zwischen 20 und 25 Stunden, was darauf hindeutet, dass die Bildgebungsbedingungen und die Expressionsniveaus der Sonde den Zeitpunkt des Zellzyklus nicht beeinflussen. Eine Falschfarbendarstellung des invertierten Bundverhältnisses, das einer Zelle durch vier Teilungen folgt, zeigt, dass trotz erheblichem Rauschen ein Trend zu beobachten ist, bei dem die PK-Eins-Aktivität in G zwei zunimmt und während der Mitose ihren Höhepunkt erreicht.

Wenn die Rohdaten nach Mittelwerten gefiltert und als Diagramm dargestellt werden, ist die Zeit zwischen Aktivitätsspitzen leicht zu schätzen. Diese Abbildung zeigt die Quantifizierung des invertierten Bundverhältnisses der Zelle, die in den vorherigen Bildern aus dem Diagramm gezeigt wurde. Der Zeitpunkt der Aktivierung kann abgeschätzt werden, und wie hier zu sehen ist, wird die Phosphorylierung der Sonde etwa vier Stunden vor dem Höhepunkt der Phosphorylierung in der Mitose sichtbar.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Zellen in einem stressfreien Zustand zu halten, indem die Lichteinwirkung minimiert und Änderungen der Temperatur oder des pH-Werts minimiert werden. Es ist auch wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Methode das Gleichgewicht zwischen Kinase- und Phosphatase-Aktivität in einer Zelle überwacht. Dieses Verfahren kann mit RNA-Interferenz- oder Inhibitor-Screenings kombiniert werden, um die vorgeschalteten Regulatoren dieser Kinasen und Phosphotasen zu identifizieren.