Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

Ziel dieses Verfahrens ist es, den Anteil der Zellen in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus bestimmen zu können. Dies wird erreicht, indem zuerst das Zellproliferationsmarkierungsreagenz BRDU zu einer lebensfähigen Zellkultur hinzugefügt wird, um es in die neu synthetisierte DNA einzubauen, dann wird die DNA in den Zellen gefärbt, die die Reagenzien eingebaut haben, dann wird die DNA mit Propidiumiodid gefärbt. Der letzte Schritt besteht darin, den Anteil der Zellen in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie zu bewerten.

Letztendlich kann die Zellzyklusverteilung einer Population von experimentellen Zellen durch durchflusszytometrische Analyse von BRDU-markierten Zellen sichtbar gemacht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Triathlon-zu-Thymian-Einbau und der Szintillationszählung besteht darin, dass mit der BRD-Markierung der Anteil der Zellen in jeder Zellzyklusphase bestimmt werden kann. Die visuelle Demonstration dieser Aussage ist von entscheidender Bedeutung, da die anderen zytometrischen Analysegeräte ohne begleitende Bilder der verschiedenen Parameter, die angepasst werden müssen, schwer zu erklären sind.

Das Verfahren wird von zwei Doktoranden aus meinem Labor, Matt Chii und mir, Miri, demonstriert. Fügen Sie BRDU in einer Verdünnung von 1 bis 1000 zu den experimentellen Zellkulturen hinzu, inkubieren Sie eine Stunde lang, um die Zellen zu ernten, aspirieren Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen dann zweimal gründlich mit PBS, um alle Spuren des Mediums zu entfernen. Diesmal mit PBS, ergänzt mit drei Millimolar EDTA, spülen Sie die Kulturen noch einmal schnell aus und aspirieren Sie dann die P-B-S-E-D-T-A-Lösung gründlich, um die Zellen zu lösen.

Geben Sie etwa 0,5 Milliliter P-B-S-E-D-T-A in jede sechs Zentimeter große Kulturschale und inkubieren Sie die Schalen bei 22 Grad Celsius für etwa fünf Minuten. Dann überführen Sie die Zellkulturen von jeder Platte in einzelne konische 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie nun die Zellen bei 500-facher Schwerkraft für fünf Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie dann das Supinat, dann resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern PBS.

Zum Schluss fixieren Sie die Zellen, indem Sie fünf Milliliter 95%iges Ethanol tropfenweise hinzufügen, während Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500-facher Schwerkraft zentrifusionieren. Entfernen Sie erneut das Ethanol und suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter von zwei normalen HCL mit 0,5 % Triton X 100, indem Sie die Lösung während des Vortexens tropfenweise zu den Zellen hinzufügen und die Zellen dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Pelletieren der Zellen den S-Überstand erneut ansaugen, wobei besonders vorsichtig zu beachten ist, da die Zellen in diesem Schritt ein sehr lockeres Pellet bilden.

Suspendieren Sie dann das Pellet vorsichtig wieder in einem Milliliter 0,1 molare Natrium-Tetra-Bohrrate und inkubieren Sie die Zellen erneut. Pelletieren Sie nun die Zellen erneut und inkubieren Sie sie diesmal in 0,5 Millilitern Antikörperlösung, die Maus-Anti-BRDU-Antikörper enthält, verdünnt von eins zu 50, nachdem Sie die Zellen wieder reus pelletiert haben. Dieses Pellet wird in 50 Mikrolitern Antikörperlösung suspendiert, die konjugierte Kaninchen-Anti-US-ZI-Sekundärantikörper enthält, verdünnt auf 25.

Inkubieren Sie die Zellen dann im Dunkeln für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Zellen der Endzeit zentrifugiert haben, inkubieren Sie sie in 0,5 Millilitern Propidiumiodid und RNA-Lösung im Dunkeln bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Zum Schluss wird die verdaute Zelllösung durch ein Zellsieb geleitet, um Aggregate zu entfernen.

Dann überführen Sie die einzelnen Zellen in ein geeignetes Röhrchen zur Probenaufnahme auf dem Durchflusszytometer für asynchron proliferierende Zellpopulationen wie die gezeigte. Platzieren Sie in diesem Beispiel ein Gate um die beiden häufigsten Peaks im Dublett-Diskriminationsdiagramm, um Einzelzellereignisse für alle nachfolgenden Analysen auszuwählen. Analysieren Sie dann eine asynchron proliferierende Kulturprobe, die als Positivkontrolle für die Färbung und die Einstellung der Durchflusszytometerparameter dient.

Die Empfindlichkeit der Photomultiplier-Röhre für die Propidiumiodid-Färbung ist so einzustellen, dass die zwei N- und vier N-Peaks der einzelnen Zellen in den willkürlichen Einheiten von 200 und 400 auf der x-Achse zentriert sind. Passen Sie als Nächstes die Empfindlichkeit der FXI-Detektor-Photomultiplier-Röhre so an, dass die negativen FXI-Zellen über den Hintergrundwerten liegen. BRDU-positive Zellen sollten etwa 10-mal heller sein und die x-Achse sollte als logarithmische Skala dargestellt werden.

Die Einzelereignisse, die vom Durchflusszytometer erfasst werden, bilden einen hufeisenförmigen Bogen von der G eins-Phase unten links nach oben zur S-Phase und dann wieder nach unten nach rechts unten für die G zwei M-Phasen. Wie in dieser repräsentativen Abbildung zu sehen ist, sammeln Sie 5.000 bis 10.000 Einzelzellereignisse, um den gewünschten Bereich des DNA-Gehalts zu erreichen. Nach der Messung des Propidiumiodid- und BRDU-Gehalts ordnen Sie die Zellen der G eins s- oder G zwei MPH-Phase zu, mit Gates um die beiden BRDU-negativen Populationen, die bei 200 für G eins und 400 für G zwei M zentriert sind. Schließen Sie alle Ereignisse über diesen beiden Boxen in ein einzelnes Gate zur Messung der S-Phase ein. Der prozentuale Anteil der Zellen in jedem Gatter stellt die relative Anzahl der Zellen in den Phasen G eins s und G zwei M dar, wie hier in diesem Balkendiagramm für die vorherige Scatterplot-Abbildung gezeigt.

Nach der Färbung für einen Zellmarker, der in diesem Beispiel für CD 20 von Interesse ist, zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 22 Grad Celsius bei 500-facher Schwerkraft und resuspendieren Sie dann das Pellet in fünf Millilitern PBS, ergänzt mit 1 % BSA. Nachdem Sie die Zellen erneut bei 500-facher Schwerkraft für fünf Minuten bei Raumtemperatur pelletiert haben, verwenden Sie 0,5 Milliliter des Propidiumiodids und der RNA-Lösung, um die Zellen zu rehydrieren. Färben und verdauen Sie dann die Zellen, wie gerade gezeigt, nun die zwei n und vier endigen Einzelzellpeaks und stellen Sie dann die Empfindlichkeit der Photomultiplier-Röhre für die FXI-Detektion so ein, dass die ungefärbten Zellen über den Hintergrundwerten liegen.

Im Idealfall werden die CD 20 FXI-positiven Zellen 10- bis 100-mal intensiver gefärbt als der Hintergrund. Auch hier sollte die x-Achse als logarithmische Skalenskala dargestellt werden. Wählen Sie schließlich die CD 20-positiven Zellen aus, die 10-mal heller als die Hintergrundwerte sind, und mit einer Propidiumiodid-Färbung zwischen 200 und 400 für die Darstellung in einem Histogramm von Propidiumiodid im Vergleich zur Zellzahl, wie hier in dieser Beispielabbildung gezeigt, sammeln Sie mindestens 1000 CD 20 positive Ereignisse für jede Probe, um die Variabilität in dieser Abbildung zu begrenzen.

Dargestellt wird die dreidimensionale durchflusszytometrische Analyse von Propidiumiodid- und BRDU-Färbezellen. Beachten Sie, dass die Zellen mit zwei n und vier NDNA-Gehalten über den Markierungen 200 und 400 auf der X-Axi-Skala zentriert sind. Für die Intensität der Propidiumiodid-Färbung wird die BRDU-Färbungsintensität auf einer logarithmischen Skala gemessen.

Beachten Sie auf der Y-Achse die Positionen der Gates, die zur Quantifizierung der Zellen in den Phasen G eins s und G zwei M des Zellzyklus verwendet werden. Hier ist das relative Verhältnis der Zellen in jedem der G-Eins- und G-Zwei-M-Gatter aus der vorherigen Abbildung dargestellt. Hier Propidium, Jodid und CD 20.

Färbung aus einer Mischung von Zellen, von denen einige ektopisch CD 20 und PRB exprimieren, ist dargestellt. Beachten Sie, dass die Zellen mit zwei n und vier NDNA, die am häufigsten vorkommen, über den 200- und 400-Markierungen auf der x-Achse zentriert sind. Die Position des positiven Gangs von CD 20 wählt Zellen aus, die mindestens 10-mal heller gefärbt sind als der Hintergrund.

Dieses Histogramm stellt die Zellzahlen im Vergleich zur Propidiumiodid-Färbung für CD 20-negative Zellen aus dem vorherigen Scatterplot dar, die asynchron proliferieren. In diesem Histogramm sind CD 20-positive Zellen aus dem früheren CD 20-Scatterplot dargestellt, die mit der p rrb-Expression zum Stillstand induziert wurden und Zellen mit hauptsächlich zwei NDNA-Gehalten enthalten. Diese Daten zeigen, dass eine verhaftete Subpopulation mit dieser Färbetechnik von anderen Zellen in der Kultur unterschieden werden kann. In den nächsten drei Abbildungen sind Daten aus der durchflusszytometrischen Analyse der retroviralen Expression des Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitors P 27 KIP one in embryonalen Fibroblasten der Maus dargestellt.

Die Propidiumiodid-BRDU-Analyse wurde verwendet, um die Zellzyklusphasen in einer asynchron proliferierenden Population von Zellen zu messen, die mit einem leeren retroviralen P babe-Vektor transduziert wurden, wie hier gezeigt. Nur wenige BRDU-positive Ereignisse waren im S-Phasen-Gate als Reaktion auf P 27 offensichtlich. Beachten Sie auch die größere Intensität der Ereignisse in den G-Eins- und G-Zwei-M-Gattern.

Ebenso ist der Prozentsatz der Zellen in der S-Phase für P 27-exprimierende Zellen recht gering, wie in dieser Abbildung dargestellt. Diese Art der Analyse hat sich als sehr effektiv bei der Charakterisierung von Defiziten der Zellzykluskontrolle in Zellen erwiesen, die von verschiedenen Stämmen von Gen-Zielmäusen abstammen. In den nächsten beiden Abbildungen wurden ungeformte Gedächtnisepithelzellen 24 Stunden lang mit dem wachstumshemmenden Zytokin TGF beta one behandelt.

Wie in dieser ersten Abbildung gezeigt, wird die BRDU-Markierung in S-Phasenzellen durch den TGF-beta-1-Signalweg stark verringert. Zu beachten ist die Akkumulation von Zellen vor allem in der G-Phase des Zellzyklus, wie in der mittleren Abbildung zu sehen ist. Die Quantifizierung der verschiedenen Phasen des Zellzyklus bestätigt, dass TGF beta one in erster Linie die Proliferation in der G 1-Phase des Zellzyklus hemmt, was zu einer Akkumulation in dieser Phase führt.

In dieser letzten experimentellen Analyseserie wurden zwei Zellen mit PRB-defizientem SAS mit dem CMV CD 20-Expressionsvektor und entweder CMV RB oder CMV beta GAL als Kontrolle transfiziert. Diese erste Abbildung zeigt die Zellzyklusverteilung der transfizierten Zellen der Negativkontrolle im Vergleich zu ihrer Verteilung nach 72 Stunden PRB-Expression. Beachten Sie, dass das fast ausschließliche Vorhandensein eines Zwei-N-Peaks im rechten Feld in dieser abschließenden Abbildung, die Kurvenanpassung durch Mehrzyklus-Software zeigte, dass sich die Zellen hauptsächlich in G eine Phase nach der PRB-Expression akkumulierten.

Während die Populationen in den s- und G-zwei M-Phasen relativ dezimiert waren. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie angepasst werden, um andere Zellzyklusmarker wie Phosphorylat-Histone in mph zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Zellzyklusverteilung einer Zellpopulation bestimmen können.

Vergessen Sie nicht, dass die beiden normalen Salzsäure ätzend und propidium ist. Jodid ist ein potentielles Karzinogen. Sie können gefährlich sein.

Bei der Verwendung dieser Chemikalien sollten immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.