Name: Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Erfahren Sie die Analyse der Zellzyklusposition in Säugerzellen mittels Durchflusszytometrie mit BRDU- und Propidiumiodid-Färbung. Diese Methode ermöglicht die genaue Quantifizierung von Zellen in G1-, S- und G2/M-Phasen.

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Die Autoren danken der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) und der kanadischen Krebsgesellschaft für die Finanzierung des Zellzyklus Forschung in ihrem Labor danken. MJC ist ein Empfänger eines MD / PhD-Stipendium der CIHR. MJC-und MA sind Mitglieder der CaRTT Trainingsprogramm.

1. Labeling und Fixierung von Zellen <ol><li> Add 1 ul Cell Proliferation Markierungsreagens (BrdU) pro ml Zellkulturmedium (1 bis 1000 Verdünnung) 1 Stunde vor der Ernte. Die Kennzeichnung Zeitraum eventuell auf langsamer wachsende Zellen verlängert werden. </li><li> Zur Ernte Zellen absaugen Kulturmedium und gründlich mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Wiederholen Sie gründlich zu entfernen Spuren von Medium. </li><li> Wash Kulturen schnell ein drittes Mal mit PBS, 3 mM EDTA und saugen gründlich. </li><li> Fügen Sie ein kleines Volumen von PBS mit 3 mM EDTA zu jedem Gericht wird 0,5 ml für eine 6 cm Schale ideal. Inkubation bei 22 ° C für ca. 5 Minuten, um Zellen zu trennen. Transfer in ein 15 mL konischen Rohr. </li><li> Centrifuge Zellen bei 500 xg für 5 Minuten auf Pellet, Überstand entfernen und gründlich resuspendieren in 100 ul PBS. </li><li> Fix-Zellen durch Zugabe von 5 ml 95% EtOH, tropfenweise unter Vortexen. In diesem Schritt können die Zellen bei 4 ° C für mindestens ein aufbewahrt werdenim Monat. </li></ol> 2. Denaturierung und Färbung von BrdU und DNA <ol><li> Centrifuge Zellen bei 500 xg für 5 Minuten auf Pellet-Zellen und entfernen Sie 95% EtOH. Resuspendieren in 1 ml 2N HCl und 0,5% TX-100, indem in einem tropfenweise Mode unter Vortexen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. </li><li> Zentrifuge nach wie vor in Abschnitt 2.1 und sorgfältig absaugen Überstand da die Zellen eine sehr lockere Form von Pellets bei diesem Schritt. Vorsichtig in 1 ml 0,1 M NaB 4 O 7 (pH 8,5) resuspendieren und inkubiert für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Pellet-Zellen wie oben in Abschnitt 2.1 und resuspendieren in 0,5 ml Antikörper-Lösung (PBS mit 1% BSA und 0,2% Tween-20) mit Maus-Anti-BrdU Antikörper verdünnt 1 bis 50. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. </li><li> Pellet-Zellen wieder und resuspendieren in 50 ml Antikörper-Lösung mit Kaninchen-anti-Maus Sekundärantikörper konjugiert FITC verdünnt 1 bis 25. Inkubieren für 30 Minuten aufTisch-und vor Licht schützen. </li><li> Centrifuge Zellen ein letztes Mal und resuspendieren in 0,5 ml Propidiumiodid und RNase-Lösung (PI-RNase-Lösung, PBS mit 1% BSA, 10 mg / mL Propidiumiodid, 0,25 mg / mL RNase A) und inkubieren im Dunkeln bei 37 ° C für 30 Minuten. Alternativ können RNA über Nacht bei 4 ° C verdaut werden in der Dunkelheit. </li><li> Pass-Lösung durch eine Zelle Sieb, um Aggregate zu entfernen und sammeln einzelne Zellen in einem geeigneten Rohr für Probenaufnahme auf Ihrem Durchflusszytometer. Auch hier sollten Proben von direkter Lichteinwirkung geschützt werden. </li></ol> 3. Analyse mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Die Zellen sind durch eine Standard-Durchflusszytometer, die in der Lage zu diskriminieren Dubletten (zwei Zellen, die durch die Messzelle als einem Durchgang) mit den entsprechenden Nachweis Fähigkeit zur Propidiumiodid und FITC wird analysiert werden. Einzelne Zellen können in diesem Durchflusszytometrie Anwendung durch Gating für Veranstaltungen auf Vorwärtsstreuung und side scatter Pop Basis erkanntulations und mit den Eigenschaften von DNA-Färbung mit Propidiumiodid. Das Erscheinungsbild einer Dublette diskriminierenden Dot-Plot schwankt zwischen Durchflusszytometern und stützt sich auf Propidiumiodidfärbung Eigenschaften finden Sie Ihren lokalen Durchflusszytometrie Anlage zur Beratung über die Einsetzung eines Dublett-Diskriminator in Ihrer Analyse. In der Regel in einer asynchron proliferierenden Population von Zellen, werden einzelne Zellen in der Regel die beiden am häufigsten vorkommenden Peaks (2N und 4N DNA) in das Wams diskriminierenden Handlung und ein Tor sollte um sie herum gezogen werden. Diese wählt einzelne Zelle Ereignisse, die für alle nachfolgenden Analysen sind unten. </li><li> Die erste zu untersuchende Probe sollte ein asynchron proliferierenden Kultur, die als positive Kontrolle für die Färbung und Durchflusszytometer Set-up dient. Stellen Sie die Empfindlichkeit von Photomultipliern für Propidiumiodid-Färbung, so dass die 2N und 4N Spitzen von Singulett-Zellen bei 200 und 400 (willkürliche Einheiten) sind auf der X-Achse zentriert. Wir haben oft Flecken eine reiche sls dieser Zellen zu gewährleisten, dass alle Parameter des Durchflusszytometer wurden entsprechend ohne Verwendung von bis diese Probe eingestellt. Diese positive Kontrolle ist auch hilfreich für neue Benutzer besser kennen zu lernen mit dem Betrieb der Durchflusszytometer. </li><li> Passen Sie die Empfindlichkeit des Photomultipliers für FITC-Erkennung, so dass G1 und G2 / M Populationen oben Hintergrund. BrdU-positiven Zellen soll rund 10 Mal heller und der Y-Achse sollte als einer logarithmischen Skala dargestellt werden. Manchmal ist es hilfreich, eine negative Kontrolle für BrdU-Färbung (durch Austausch der anti-BrdU Antikörper mit unspezifischen IgG in Schritt 2.3) klar zu unterscheiden positiv gefärbten Zellen enthalten. </li><li> Passen Ausgleich zwischen Propidiumjodid und FITC, so dass einzelne Ereignisse, die vom Durchflusszytometer bilden eine hufeisenförmige Bogen von G1 in den unteren erfasst bis links nach S-Phase und nach unten in die untere rechte für G2 / M. Bitte beachten Sie folgenden Hinweis für eine mehr in die Tiefe disDiskussion der Grundsätze und Anwendung der Durchflusszytometrie und Referenzen gibt es in bestimmten Anwendungen 2. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> 5 000 bis 10 000 einzelne Zelle Veranstaltungen mit den gewünschten Bereich der DNA-Gehalt sollte für jede Probe gesammelt werden, um das Vertrauen, dass die Population von Zellen in der Kultur wurden gründlich abgetastet haben. </li><li> Sobald Zellen für Propidiumjodid und BrdU Inhalte, die sie benötigen, um zum G1, S, oder G2 / M Phase zugeordnet werden gemessen worden. Tun Sie dies, indem Toren rund um die beiden BrdU negativen Populationen bei 200 und 400 (G1 und G2 / M bzw.) zentriert ist. Alles über diese Boxen in einem einzigen Tor, das S-Phase (Abb. 1A) Maßnahmen einbezogen werden. Der Prozentsatz an Zellen in jedes Tor stellt die relative Anzahl der Zellen in G1, S und G2 / M (Abb. 1B). </li></ol> 5. Alternate-Protokoll für die Analyse von Zell-Zyklus in einer gemischten Population von Zellen <ol><li> Diese alternative Protokollbesonders hilfreich, wenn die Transfektion von Expressionsvektoren routinemäßig führt zu einem geringen Prozentsatz der Zellen, die das Genprodukt von Interesse, oder wenn medikamentöse Behandlung zu einer reinen Population von Zellen auszuwählen unpraktisch ist. Dies führt zu einem relativ geringen Anteil der Zellen von Interesse, die mit einer großen Population von kontaminierten untransduced Zellen. In diesem Fall Co-Transfektion von Plasmiden Ausdruck Ihrer Gen oder shRNA von Interesse zusammen mit einem Plasmid, das ein Marker drückt zum Nachweis von transfizierten Zellen mittels Durchflusszytometrie, wie eine Membran verankert GFP 3, oder einer ausländischen Zelloberflächenmarker wie CD19 4 oder CD20 5. </li><li> Für die Zwecke dieses Protokolls werden wir CD20 Färbung als Beispiel nehmen, aber Färbung für CD19 ist im Wesentlichen identisch. Im Falle der Transfektion mit CD20, gibt es keine Notwendigkeit, BrdU-Label einfach Ernte Zellen wie in den Schritten von 1,2 bis 1,5 beschrieben und durch Zugabe von 20 ul FITC-konjugierten anti-CD20-Antikörper gegen die Zellen auf i Fleckce für 20 Minuten im Dunkeln. Fix Zellen, wie in Schritt 1.6 beschrieben. Die Zellen können wieder für mindestens einen Monat bei 4 ° C gelagert werden in der Dunkelheit. Für die Detektion von GFP, lassen Sie den Antikörper-Färbung von diesem Schritt und fix und speichern Zellen, wie beschrieben. </li><li> Re-Hydrat die Zellen durch Pelletierung in der Zentrifuge bei 500 xg für 5 Minuten und Resuspendieren in 5 ml PBS mit 1% BSA. </li><li> Re-Pellet die Zellen bei 500 xg für 5 Minuten und die Zellen in 0,5 ml Propidiumiodid und RNase-Lösung wie oben in Abschnitt 2.5 beschrieben. </li><li> Weiter zum Zellpräparation Anweisungen in 2,6 und Analyse Anweisungen in 3.1 und 3.2 folgen. </li><li> Passen Sie die Empfindlichkeit des Photomultipliers für FITC-Erkennung, so dass ungefärbte Zellen oben Hintergrund. Im Idealfall wird CD20-FITC-positiven Zellen werden 10x bis 100x stärker gefärbt als Hintergrund und die Y-Achse dieses Grundstück sollte als eine logarithmische Skala (Abb. 2A) angezeigt werden. CD20-positive Zellen, die 10x heller als backg sindRunde (und mit Propidiumiodid-Färbung zwischen 200 und 400) sollten zur Anzeige in einem Propidiumiodid gegenüber Zellzahlen Histogramm gewählt werden, wie in Abb. gezeigt. 2C. Für Zelllinien, die Marker, die sich leicht gefärbt sind hell (dh 10x bis 100x höher als der Hintergrund) das CD20-positive cut-off bei 10X Hintergrund sollte sein, ausdrücken. Einbeziehung der schwächeren Färbung Zellen erhöht die Variabilität in diesen Experimenten, vermutlich, weil das Gen von Interesse ist auch schwach in diesen Zellen exprimiert werden. Für Zelllinien, die nur Rendite schwach gefärbten CD20-positive (dh weniger als 10x Hintergrund), Bestimmung von einem Cut-off sollte mit einem Negativ-Kontrolle, bestehend aus CD20 angefärbt, nicht transfizierte Zellen. </li><li> Mindestens 1000 CD20 positive Ereignisse sollten für jede Probe gesammelt werden. Experimente mit weniger als 1000 Veranstaltungen produzieren hohe Variabilität. Software-Pakete wie ModFit LT (Verity Software), Multi-Zyklus AV (Phoenix Flow Systems) und Flow-Jo (Tree Star) verwenden mathematische Schätzungen derder G1, S und G2 / M Populationen, die an die Form der Kurve in Histogrammen, wie sie in Abb. beitragen. 2B und C. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Wir bieten Ihnen drei Beispiele für experimentelle Zellzyklus-Analysen unter Verwendung unserer Ansätze. Die erste nutzt retrovirale Expression von Cyclin-abhängige Kinase-Inhibitor p27KIP1 in embryonalen Maus-Fibroblasten. Vierundzwanzig Stunden nach Medikament Auswahl für die Virusinfektion vollständig war, wurden die Zellen mit BrdU Puls für 1 Stunde beschriftet. In diesem Experiment ektopische Expression des Inhibitors wird verwendet, um die Vermehrung der Zellen (Abb. 3A und B) zu verhaften. Wie in Abb.. 3B wenig BrdU positive Ereignisse werden in der S-Phase-Gate offensichtlich in Reaktion auf p27. Ebenso ist der Anteil der Zellen in S-Phase für p27 exprimierenden Zellen sehr gering, wie in Abb. diagramed. 3C. Diese Art der Analyse ist sehr wirksam bei der Charakterisierung der Zellzyklus-Kontrolle Mängel in Zellen, die aus verschiedenen Stämmen abgeleitet gEn gezielte Mäusen 6, 7, 8. Im zweiten Experiment wurden transformierten Brustepithelzellen (MCF10A) mit dem Wachstum hemmende Zytokin behandelt, transforming growth factor beta eins (TGF-β1) für 24 Stunden. Die Zellen wurden mit BrdU für vier Stunden beschriftet unmittelbar vor der Ernte. Wie in Abb.. 4 BrdU-Markierung in der S-Phase-Zellen stark von TGF-β1 Signalisierung verringert, ist die Spezifität unseres Färbung auch mit einem IgG Negativkontrolle (Abb. 4C) validiert. Die Quantifizierung der verschiedenen Phasen des Zellzyklus bestätigt, dass TGF-β1 in erster Linie hemmt die Proliferation in der G1-Phase des Zellzyklus, was zu einer Akkumulation in dieser Phase. In unserem letzten Beispiel sind pRB mangelhaft SaOS-2-Zellen mit einer CMV-CD20-Expressionsvektor und entweder CMV-RB oder CMV-β-Gal als Kontrolle transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und gefärbt, und fixiert. Die Durchflusszytometrie Analyse dieser Zelles ist in Abb. dargestellt. 5. Dies zeigt die Zellzyklus-Verteilung der Negativ-Kontrolle transfizierten Zellen (Abb. 5A) im Vergleich mit der Verteilung nach 72 Stunden pRB Ausdruck (Abb. 5B). Nach Kurvenanpassung durch Multi Cycle-Software, ist ein direkter Vergleich der Anteil der Zellzyklus-Phasen in Abb. gezeigt. 5C. Dies zeigt die Anhäufung von Zellen in G1 folgenden pRB Ausdruck und die relative Verarmung der Zellen aus der S-und G2 / M Phase. Wir haben Variationen über dieses Tests verwendet werden, um G1-Arrest Mechanismen weitgehend 9, 10, 11, 12, 13 Sonde. Diese Beispiele zeigen, wie die Kontrolle des Zellzyklus in Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen oder Zelle Manipulationen gemessen werden kann. Dieser Ansatz kann daher für viele Anwendungen, die die Messung des Zellzyklus Position in der Kultur geben Experimente erfordern angepasst werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig1.jpg"> Abbildung 1. QuantitATION der Zellzyklusphasen durch kombinierte Propidiumiodid und BrdU-Färbung (PI-BrdU). (A) Das Panel zeigt dreidimensionale Durchflusszytometrie von Propidiumiodid und BrdU gefärbten Zellen. Beachten Sie, dass Zellen mit 2N und 4N DNA-Gehalt über die 200 und 400 Mark auf der X-Achse Skala für Propidiumiodidfärbung Intensität zentriert sind. BrdU Färbeintensität ist auf einer logarithmischen Skala auf der Y-Achse gemessen. Beachten Sie die Position von Toren verwendet, um Zellen in der G1, S und G2 / M Phase des Zellzyklus zu quantifizieren. (B) Der relative Anteil der Zellen in jeder der G1, S und G2 / M Toren von A sind in dieser Grafik dargestellt. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig2.jpg"> Abbildung 2. Quantifizierung der Zellzyklusphasen in ausgewählten Zellen mit Propidiumiodid und die Zelloberflächenmarker CD20. (A) Dieses Panel Propidiumiodid und CD20-Färbung für eine Mischung von Zellen zeigt, von denen einige ektopisch CD20 exprimieren und pRB. Beachten Sie, dass die Zellen mit2N und 4N DNA (das am häufigsten vorkommende Populationen) sind über die 200 und 400 Mark auf der X-Achse zentriert. Die Position der CD20 + Tor wählt Zellen, angefärbt mindestens 10x heller als Hintergrund. (B) Eine graphische Darstellung der Zellzahlen im Vergleich zu Propidiumiodid-Färbung für CD20-negativen Zellen in Panel A, die asynchron proliferierenden gezeigt. (C) Eine ähnliche Grafik ist für CD20-positiven Zellen von der Platte gezeigt, dass A induziert worden sein, um mit pRB Ausdruck Verhaftung und enthalten Zellen mit allem 2N DNA-Gehalt. Dies zeigt, dass eine festgenommene Subpopulation von anderen Zellen in dieser Kultur mit dieser Maltechnik unterschieden werden können. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig3.jpg"> Abbildung 3. Hemmung der Zellproliferation durch p27KIP1. (A) PI-BrdU Analyse wird verwendet, um die Zellzyklusphasen in einer asynchron proliferierenden Population von Zellen, die mit einem leeren pBABE retroviralen vecto transduziert wurden gemessenr. (B) Eine ähnliche Analyse von Zellen transduziert mit pBABE-p27. Beachten Sie das Fehlen von Zellen in der S-Phase und eine größere Intensität der Ereignisse in G1 und G2 / M Tore. (C) Quantifizierung von Zellen in den jeweiligen Phasen des Zellzyklus in asynchron proliferierenden Steuerung und p27 exprimierenden Zellen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig4.jpg"> Abbildung 4. Hemmung der Zellproliferation durch TGF-β1 (A) PI-BrdU Analyse von asynchron proliferierenden MCF10A Zellen. (B) Analyse der Zellen mit 100 pM TGF-β1 für 24 Stunden behandelt. Beachten Sie die Ansammlung von Zellen in erster Linie in der G1-Phase des Zellzyklus. (C) Validierung von BrdU Färbung durch den Austausch des anti-BrdU Primär-Antikörper mit einem nicht-spezifischen IgG-Kontrolle in asynchron proliferierenden Zellen. (D) Graphische Quantifizierung der jeweiligen Zellzyklusphasen von A und B. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig5.jpg"> Abbildung 5. Hemmung der Zellproliferation durch pRB. (A) Die Zellzahlen im Vergleich zu Propidiumiodid-Färbung von CD20 und ß-gal transfizierten Zellen gezeigt. Dies ist eine wichtige Kontrolle der Transfektion teilweise synchronisieren können Zellen, wodurch die transfizierten Population (CD20 - Zellen) als eine unangemessene Kontrolle der transfizierten Subpopulation. Die transfizierten Zellen müssen mit anderen analog transfizierten Zellen verglichen werden. (B) Die Zellzahlen im Vergleich zu Propidiumiodid Graphen von CD20 und pRB-Zellen transfiziert. Beachten Sie die fast ausschließliche Präsenz einer 2N Höhepunkt. (C) Grafische Darstellung des Zellzyklus Phase Proportionen von A und B mit Kurvenanpassung Methoden in Multi Cycle-Software bestimmt.

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<li>Dick, F. A., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+regions+of+the+pRB+pocket+domain+affect+its+inactivation+by+human+papillomavirus+E7+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Three regions of the pRB pocket domain affect its inactivation by human papillomavirus E7 proteins.</a> J. Virol. 76, 6224-6224 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Nach unserer Erfahrung ist der Erfolg mit diesen Techniken abhängig von wenigen wichtigen Bedienelemente und experimentellen Bedingungen. Man ist über ein asynchron proliferierenden Steuerung für den Einsatz in diesen Experimenten. Diese Kontrolle dient drei wichtigen Zwecken. Erstens sorgt es für die Kultur für alle experimentellen Proben ausreichen, um kontinuierliche Proliferation in Abwesenheit der Behandlung zu unterstützen. Dieses Beispiel dient auch dem Zweck einer positiven Kontrolle für die Färbung Methodik, um sicherzustellen, dass BrdU oder CD20-positive Zellen nachgewiesen werden können, wenn sie vorhanden sind. Schließlich ist in diesem Beispiel verwendet werden, um das Durchflusszytometer zu kalibrieren. Diese Kontrolle Probe kann verwendet werden, um Propidiumiodidfärbung Intensität anpassen, um 2N und 4N Zellen bei 200 und 400 jeweils zu erkennen. Darüber hinaus können Nachweisempfindlichkeit BrdU oder CD20 so eingestellt, dass negative und positive Signale zentriert sind, wie in den 1A und 2A gezeigt werden. Wenn alle Proben haben eine ähnliche Konzentration der Zellen in PI-RNase Lösung, dann einige Anpassungen der Zytometer benötigt werden, wie nachfolgende Proben ausgeführt werden. Dies ist aus Gründen in Abb. wichtig. 4B und 5B, in denen starke G1 Ansammlung schafft im wesentlichen eine einzige G1 peak, die als G2 / M. fehlinterpretiert werden könnte Der Vertreter Experimente auch andere wichtige Punkte. Vor allem zeigen sie, dass BrdU-Aufnahme und Kennzeichnung können zwischen verschiedenen Zelltypen variieren. Aus diesem Grund ist es wichtig, empirisch festzustellen, die Länge des Pulses und Färbebedingungen werden, um angemessen zu erkennen Zellen in S-Phase. Im Allgemeinen können Zelltypen, die in der Kultur in 24 Stunden oder weniger Doppelzimmer mit BrdU in einer Stunde beschriftet werden. Langsamer wachsende Zelltypen kann verlangen, mehr Impulse und Veränderungen an Antikörper-Färbung Bedingungen und die Dauer. MCF10A Zellen sind ein hervorragendes Beispiel in dieser Hinsicht, wie sie waren mit BrdU für 4 Stunden und gefärbt mit der doppelten Standard-Konzentration von Antikörpern für die viermal so lang beschriftet. Die Ermittlersollte darauf achten, nicht zu 6 Stunden BrdU überschreiten Kennzeichnung auch bei sehr langsam wachsenden Zellen, da dies fälschlicherweise Einbeziehung der G2 / M-Zellen in der S-Phase Bevölkerung führen. Zweitens, in der die Wirkungen von p27KIP1 Ausdruck mit denen von TGF-β1, ist es klar, dass p27 kann eine Anreicherung in entweder G1 oder G2 / M Phase zu induzieren, während TGF-β1 Signalisierung induziert eine G1-Arrest. Traditionelle Mittel der Nachweis der Weiterverbreitung wie 3 H-Thymidin-Einbau und Szintillationszählung sind nicht in der Lage, diese Möglichkeiten zu unterscheiden. In unserer alternativen Protokoll zeigen wir den Nachweis einer Subpopulation von Zellen in einem größeren untransfizierte Bevölkerung. Es ist wichtig, empirisch festzustellen, die am besten geeignete Reporter zum Nachweis von transfizierten Zellen. Nach unserer Erfahrung einige Zelltypen weder ausdrücklich Zelloberflächenmarker schlecht, oder kann nicht richtig Traffic sie an die Plasmamembran, was zu einer Unfähigkeit, transfizierten Zellen zu erkennen. Likewise, nicht alle Zellen tolerieren die membrangebundene Form von GFP. Die Auswahl des am besten geeigneten Reporter sollte durch die Erfassung Transfektionseffizienz der Reporter als auch die relative Intensität der Expression im Vergleich zu nicht transfizierten Kontrollen vorgenommen werden. Im Idealfall wird die heterologe Expression dieser Moleküle gut verträglich zu sein und dies ist bezeichnend, daß die Markierungen wenig bis gar keine Wirkung auf die Zellzyklus-Verteilung haben. Eine Einschränkung dieser Art von Durchflusszytometrie Ansätze ist, dass sie nur in der Lage, relativen Häufigkeiten der Zellzyklusphasen im Vergleich zueinander zu etablieren. Aus diesem Grund ist es unklar, ob Expression von p27 in Abbildung 3 wirklich induziert eine Festnahme in G1 und G2 / M, oder ob es nur verlangsamt Progression durch diese Phasen relativ zur S-Phase. Diese Möglichkeiten können durch die Behandlung einer parallel Stichprobe von Zellen mit einer mitotischen Inhibitor wie Nocodazol oder G1 / S-Hemmer wie Aphidicolin untersucht werden. Da diese Medikamente Erstellen einer Dominant Verhaftung im M-Phase oder am frühen S-Phase bzw. langsam proliferierenden Zellen bei der Medikamenten-induzierte Haltepunkt zu sammeln. Zum Beispiel Zellen in G1, weil der pRB Ausdruck verhaftet wird in G1 trotz Nocodazol Behandlung bleiben, während Kontrollzellen in M-Phase 13 ansammeln wird. Zusammengenommen bieten diese experimentelle Ansätze einer flexiblen Methodik, die eine breite Palette von Zellzykluskontrolle Fragestellungen angewendet werden können. Sie können leicht erkennen, Veränderungen in den Ablauf des Zellzyklus und zu quantifizieren Unterschiede beim Vergleich mit Kontrollen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes / Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Cell Proliferation Markierungsreagens </td><td> GE Amersham </td><td> RPN201 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-BrdU Antikörper </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus-FITC konjugierte Antikörper </td><td> Vector Labs </td><td> FI-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Zellstamm Filter </td><td> BD Falcon </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD20 Antikörper </td><td> BD Biosciences </td><td> 347673 </td><td></td></tr><tr><td> Multi Cycle Software </td><td> Phoenix Flow Systems </td><td> N / A </td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des zellzyklus position in säugerzellen

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Die Regulation der Zellproliferation ist von zentraler Bedeutung Gewebemorphogenese bei der Entwicklung von vielzelligen Organismen. Darüber hinaus unterliegt Verlust der Kontrolle der Zellteilung die Pathologie von Krankheiten wie Krebs. Als solche gibt es großen Bedarf in der Lage sein, um die Zellproliferation zu untersuchen und zu quantifizieren ist der Anteil der Zellen in jeder Phase des Zellzyklus. Es ist auch von entscheidender Bedeutung, um ununterscheidbar Zellen identifizieren, die die Replikation der DNA sind innerhalb einer größeren Bevölkerung. Da eine Zelle die Entscheidung zu vermehren ist in der G1-Phase unmittelbar vor Beginn der DNA-Synthese und Fortgeschrittene durch den Rest des Zellzyklus gemacht, ermöglicht den Nachweis von DNA-Synthese in dieser Phase für eine eindeutige Bestimmung des Status der Regulation des Wachstums in der Zellkultur Experimente. DNA-Gehalt in den Zellen kann leicht mittels Durchflusszytometrie von Zellen mit Propidiumiodid, ein Fluoreszenz-DNA interkalierende Farbstoff angefärbt quantifiziert werden.Ebenso können aktive DNA-Synthese durch Kultivierung von Zellen in Gegenwart von radioaktivem Thymidin quantifiziert werden, die Ernte der Zellen und Messung des Einbaus von Radioaktivität in eine Säure unlösliche Fraktion. Wir haben viel Know-how mit Zellzyklus-Analyse und empfehlen einen anderen Ansatz. Wir untersuchen die Zellproliferation mit Bromdesoxyuridin / Fluordeoxyuridin (abgekürzt einfach als BrdU)-Färbung, dass die Einbeziehung dieser Thymin-Analoga erkennt in letzter Zeit synthetisierte DNA. Labeling und Färben von Zellen mit BrdU, mit Gesamt-DNA-Färbung mit Propidiumiodid und Analyse mittels Durchflusszytometrie 1 kombiniert bietet die genaueste Messung von Zellen in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus. Es ist unsere bevorzugte Methode, weil es den Nachweis von aktiver DNA-Synthese kombiniert, durch Antikörper-basierte Färbung von BrdU, mit Gesamt-DNA-Gehalt von Propidiumiodid. Dies ermöglicht die klare Trennung von Zellen in G1 ab Anfang der S-Phase, oder am späten S-Phase von G2 / M.Darüber hinaus kann dieser Ansatz verwendet, um die Auswirkungen von verschiedenen Zell-Stimuli und pharmakologische Mittel zur Regulierung der Progression durch diese verschiedenen Zellzyklusphasen zu untersuchen. In diesem Bericht beschreiben wir Verfahren zur Markierung und Färbung kultivierten Zellen, sowie deren Analyse mittels Durchflusszytometrie. Wir berücksichtigen auch experimentelle Beispiele, wie diese Methode verwendet, um die Auswirkungen der wachstumshemmenden Signale von Zytokinen wie TGF-β1 und proliferative Inhibitoren wie die Cyclin-abhängige Kinase-Inhibitor, p27KIP1 messen. Wir berücksichtigen auch ein alternatives Protokoll, das für die Analyse von Zellzyklus-Position in einer Subpopulation von Zellen innerhalb einer größeren Kultur 5 ermöglicht. In diesem Fall zeigen wir, wie man einen Zellzyklusarrest in Zellen mit dem Retinoblastom-Gen, auch wenn zahlenmäßig weit überlegen durch transfizierte Zellen in der gleichen Kultur transfizierter erkennen. Diese Beispiele zeigen die vielen Möglichkeiten, die DNA-Färbung undDurchflusszytometrie genutzt und angepasst werden, um grundlegende Fragen der Zellzykluskontrolle zu untersuchen.

Die Bestimmung der Zellzyklus-Position eine Population von Zellen, oder zu verstehen, wie Signale Verbreitung beeinflussen, kann leicht durch Durchflusszytometrie mit diesem Protokoll gemessen werden. Wir berichten über einen einfachen experimentellen Ansatz zur Färbung von Zellen und die Quantifizierung ihrer Position in den Zellzyklus.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

Die Regulierung der Zellproliferation ist von zentraler Bedeutung für die Gewebemorphogenese während der Entwicklung vielzelliger Organismen. Darüber hinaus führt der Kontrollverlust über ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Anteil der Zellen in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus bestimmen zu können. Dies wird erreicht, indem zunächst das Markierungreagenz für die Zellproliferation BRDU einer lebenden Zellkultur zugesetzt wird, um dessen Einbau in neu synthetisierte DNA zu ermöglichen. Anschließend werden die Zellen, die das Reagenz eingebaut haben, gegen BRDU gefärbt, und die DNA wird mit Propidiumiodid angefärbt. Der letzte Schritt besteht darin, den Anteil der Zellen in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie zu bestimmen.Schließlich kann die Verteilung des Zellzyklus in einer Population experimenteller Zellen durch die Durchflusszytometrie-Analyse von BRDU-markierten Zellen visualisiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Thymidin-Inkorporation und Szintillationszählung besteht darin, dass mit BRD-Markierung der Anteil der Zellen in jeder Phase des Zellzyklus bestimmt werden kann. Die visuelle Darstellung dieser Aussage ist entscheidend, da die zugehörige zytometrische Analyse schwer verständlich ist, ohne begleitende Abbildungen der verschiedenen anzupassenden Parameter.Die Prozedur wird von zwei Doktoranden aus meinem Labor demonstriert: Matt Chii und ich, Miri. GEBEN SIE BRDU in einer Verdünnung von 1 zu 1000 zu den experimentellen Zellkulturen, inkubieren Sie eine Stunde lang, gewinnen Sie die Zellen, saugen Sie das Kulturmedium ab und waschen Sie die Zellen anschließend gründlich zwei Mal mit PBS, um alle Spuren des Mediums zu entfernen. Verwenden Sie diesmal PBS, der mit drei Millimolar EDTA ergänzt ist, spülen Sie die Kulturen einmal kurz damit aus und saugen Sie die PBS-EDTA-Lösung anschließend gründlich ab, um die Zellen abzulösen.Fügen Sie etwa 0,5 Milliliter P-B-S-E-D-T-A zu jeder sechs Zentimeter großen Kulturschale hinzu und inkubieren Sie die Schalen bei 22 Grad Celsius für ungefähr fünf Minuten. Überführen Sie dann die Zellkulturen von jeder Platte in einzelne 15-Milliliter-Konischgefäße. Zentrifugieren Sie nun die Zellen fünf Minuten lang bei 500 × g bei Raumtemperatur und entfernen Sie anschließend den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen dann in 100 Mikrolitern PBS.Fixieren Sie die Zellen abschließend, indem Sie fünf Milliliter 95%igen Ethanol tropfenweise unter Vortexen hinzufügen und die Zellen bei 500 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie anschließend erneut den Ethanol und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter zweifach normaler HCl, die 0,5 % Triton X-100 enthält, indem Sie die Lösung tropfenweise unter Vortexen zu den Zellen geben. Inkubieren Sie die Zellen danach 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach erneuter Pellettierung der Zellen aspirieren Sie den Überstand, wobei besondere Vorsicht geboten ist, da die Zellen in diesem Schritt ein sehr lockeres Pellet bilden.Dann resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in einem Milliliter 0,1-molarer Natriumtetrahydroborat-Lösung und inkubieren die Zellen erneut. Pelletieren Sie die Zellen nun nochmals und inkubieren Sie sie dieses Mal in 0,5 Milliliter Antikörperlösung, die mit Maus-anti-BRDU-Antikörpern im Verdünnungsverhältnis 1:50 versetzt wurde. Nach erneuter Pelletierung resuspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern Antikörperlösung, die mit konjugierten sekundären Kaninchen-anti-US-ZI-Antikörpern im Verdünnungsverhältnis 1:25 versetzt ist.Anschließend die Zellen 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der abschließenden Zentrifugation die Zellen in 0,5 Milliliter Propidiumiodidlösung und RNA-Lösung 30 Minuten im Dunkeln bei 37 Grad Celsius inkubieren. Abschließend die digestierte Zellsuspension durch einen Zellsieb filtern, um Aggregate zu entfernen.Überführen Sie anschließend die Einzelzellen in ein geeignetes Gefäß zur Probenaufnahme am Durchflusszytometer für asynchron proliferierende Zellpopulationen wie die hier gezeigte. Plazieren Sie in diesem Beispiel ein Tor um die beiden am stärksten vertretenen Peaks in der Darstellung zur Unterscheidung von Doppelzellen, um Einzelzellenereignisse für alle nachfolgenden Analysen auszuwählen. Analysieren Sie danach eine Probe aus einer asynchron proliferierenden Kultur, die als Positivkontrolle für die Färbung und die Einstellung der Durchflusszytometrie-Parameter dient.Stellen Sie die Empfindlichkeit der Fotomultiplierröhre für die Propidiumiodid-Färbung so ein, dass die Peaks der Einzelzellen mit zwei N und vier N bei den willkürlichen Einheiten 200 und 400 auf der x-Achse zentriert sind. Anschließend justieren Sie die Empfindlichkeit der Fotomultiplierröhre zur Detektion von FXI so, dass FXI-negative Zellen über dem Hintergrundniveau liegen. BRDU-positive Zellen sollten etwa zehnmal heller sein, und die x-Achse sollte in logarithmischer Skalierung dargestellt werden.Die einzelnen Ereignisse, die vom Durchflusszytometer erfasst werden, bilden einen hufeisenförmigen Bogen, der von der G1-Phase unten links über die S-Phase bis nach unten rechts zur G2/M-Phase verläuft. Wie in dieser repräsentativen Abbildung zu sehen ist, sollten 5.000 bis 10.000 Einzelzellereignisse gesammelt werden, um den gewünschten Bereich des DNA-Gehalts zu erreichen. Nach der Messung des Propidiumiodid- und BrdU-Gehalts werden die Zellen anhand von Toren um die beiden BrdU-negativen Populationen, zentriert bei 200 für G1 und 400 für G2/M, den Phasen G1, S oder G2/M zugeordnet. Alle Ereignisse oberhalb dieser beiden Felder werden in einem einzigen Tor zur Bestimmung der S-Phase zusammengefasst. Der prozentuale Anteil der Zellen in jedem Tor entspricht der relativen Anzahl der Zellen in den Phasen G1 und G2/M, wie hier in diesem Balkendiagramm für die vorherige Streudiagramm-Abbildung dargestellt.Nach der Färbung für einen Zellmarker der Wahl – in diesem Beispiel CD20 – die Zellen bei 500 × g für 10 Minuten bei 22 °C zentrifugieren und dann das Pellet in fünf Milliliter PBS, ergänzt mit 1 % BSA, resuspendieren. Nach erneuter Zentrifugation der Zellen bei 500 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur 0,5 Milliliter der Propidiumiodid- und RNA-Lösung verwenden, um die Zellen erneut zu hydratisieren. Anschließend die Zellen färben und verdauen, wie gerade gezeigt, die diploiden und tetraploiden Einzelzellspitzen erfassen und dann die Empfindlichkeit der Photomultiplierröhre für die FXI-Detektion so einstellen, dass die ungefärbten Zellen über dem Hintergrundniveau liegen.Im Idealfall sollten die CD 20 FXI positiven Zellen 10 bis 100 Mal stärker angefärbt sein als der Hintergrund. Auch hier sollte die x-Achse in logarithmischer Skalierung dargestellt werden. Schließlich sollten die CD 20 positiven Zellen ausgewählt werden, die 10 Mal heller sind als die Hintergrundwerte, und deren Propidiumiodid-Färbung zwischen 200 und 400 liegt, zur Darstellung in einem Histogramm von Propidiumiodid versus Zellanzahl, wie hier in dieser Beispielabbildung gezeigt. Sammeln Sie für jede Probe mindestens 1000 CD 20 positive Ereignisse, um die Variabilität in dieser Abbildung zu begrenzen.Die dreidimensionale Durchflusszytometrie-Analyse von Propidiumiodid- und BRDU-gefärbten Zellen wird dargestellt. Beachten Sie, dass die Zellen mit zwei n und vierfachem DNA-Gehalt über den Markierungen 200 und 400 auf der X-Achsen-Skala zentriert sind. Die Intensität der BRDU-Färbung wird im Vergleich zur Propidiumiodid-Färbungsintensität auf einer logarithmischen Skala gemessen.Auf der Y-Achse beachten Sie die Positionen der Tore, die zur Quantifizierung von Zellen in den G1- und G2/M-Phasen des Zellzyklus verwendet werden. Der relative Anteil der Zellen in jedem der G1- und G2/M-Tore aus der vorherigen Abbildung ist hier dargestellt. Hier Propidium, Iodid und CD20.Färbung aus einem Gemisch von Zellen, von denen einige CD20 und PRB ektopisch exprimieren, ist dargestellt. Beachten Sie, dass die Zellen mit zwei n und vierfacher DNA, die häufigsten Populationen, um die Markierungen 200 und 400 auf der x-Achse zentriert sind. Die Position der CD20-positiven, ausgewählten Zellen, die mindestens zehnmal heller als der Hintergrund angefärbt sind.Dieses Histogramm stellt die Anzahl der Zellen in Abhängigkeit von der Propidiumiodid-Färbung für CD20-negative Zellen aus dem vorherigen Streudiagramm dar, die in diesem Histogramm asynchron proliferieren. CD20-positive Zellen aus dem früheren CD20-Streudiagramm, bei denen durch pRb-Expression ein Arrest induziert wurde und die hauptsächlich Zellen mit einem zweifachen DNA-Gehalt enthalten, sind dargestellt. Diese Daten zeigen, dass eine arrestierte Teilpopulation mithilfe dieser Färbetechnik von anderen Zellen in der Kultur unterschieden werden kann. In den nächsten drei Abbildungen sind Daten aus der Durchflusszytometrie-Analyse der retroviralen Expression des Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitors p27KIP1 in murinen embryonalen Fibroblasten dargestellt.Die Analyse mit Propidiumjodid und BRDU diente zur Messung der Zellzyklusphasen in einer asynchron proliferierenden Zellpopulation, die wie hier gezeigt mit einem leeren P-babe-Retrovirusvektor transduziert wurde. Nur wenige BRDU-positive Ereignisse waren im S-Phasen-Tor als Reaktion auf P 27 erkennbar. Beachten Sie außerdem die höhere Intensität der Ereignisse in den G1- und G2/M-Toren.Ebenso ist der Prozentsatz der Zellen in der S-Phase für P 27 exprimierende Zellen, wie in dieser Abbildung dargestellt, sehr gering. Diese Art der Analyse hat sich als sehr effektiv erwiesen, um Defizite in der Zellzyklusregulation in Zellen zu charakterisieren, die aus verschiedenen Stämmen gezielt genveränderter Mäuse stammen. In den nächsten beiden Abbildungen wurden unreife epitheliale Gedächtniszellen 24 Stunden lang mit dem wachstumshemmenden Zytokin TGF-beta-1 behandelt.Wie in dieser ersten Abbildung gezeigt, wird die BRDU-Markierung in S-Phasen-Zellen durch TGF-beta-1-Signalgebung stark vermindert. Beachten Sie die Anreicherung von Zellen hauptsächlich in der G1-Phase des Zellzyklus, wie im mittleren Panel zu sehen ist. Die Quantifizierung der verschiedenen Phasen des Zellzyklus bestätigt, dass TGF-beta 1 die Proliferation vorwiegend in der G1-Phase des Zellzyklus hemmt, was zu einer Anreicherung in dieser Phase führt.In dieser letzten Versuchsreihe wurden PRB-defiziente SAS-Zwei-Zellen mit dem CMV-CD-20-Expressionsvektor sowie entweder mit CMV-RB oder als Kontrolle mit CMV-beta-GAL transfiziert. Diese erste Abbildung zeigt die Verteilung im Zellzyklus der negativ kontrollierten transfizierten Zellen im Vergleich zu ihrer Verteilung nach 72 Stunden PRB-Expression. Beachten Sie die nahezu ausschließliche Präsenz eines Zwei-N-Peaks im rechten Panel; die Kurvenanpassung mittels Multi-Cycle-Software in dieser letzten Abbildung ergab, dass sich die Zellen hauptsächlich in der G1-Phase nach PRB-Expression anreicherten.Während die Populationen in den Phasen S und G2/M relativ vermindert waren. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie angepasst werden, um andere Zellzyklusmarker wie phosphorylierte Histone in MPh zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Verteilung des Zellzyklus in einer Zellpopulation bestimmt wird.Vergessen Sie nicht, dass zwei normale Salzsäure ätzend ist und Propidiumiodid ein potenzieller Karzinogen ist. Beide Stoffe können gefährlich sein.Es sollten stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wenn mit diesen Chemikalien gearbeitet wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Tracking-feine Veränderungen in der Progression und die Kinetik der Zellzyklusstadien kann durch Verwendung einer Kombination von metabolische Markierung von Nukleinsäuren mit BrdU und genomischer Gesamt-DNA-Färbung über Propidiumiodid durchgeführt werden. Dieses Verfahren vermeidet die Notwendigkeit von chemischen Synchronisation der Rad-Zellen, wodurch die Einführung von nicht-spezifischen DNA-Schäden, die sich wiederum auf den Ablauf des Zellzyklus.

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Metaphase zur Anaphase Übergang durch Anaphase-promoting complex (APC / C)-abhängige Ubiquitinierung und anschließende Zerstörung von Cyclin B. Hier haben wir ein System, das Pulse-Chase-Kennzeichnung nach, ermöglicht die Überwachung Cyclin B Proteolyse im gesamten Zellpopulationen und wird ausgelöst, erleichtert den Nachweis von Störungen durch den mitotischen Checkpoint.

Studieren Proteolyse von Cyclin B an der Single Cell Level in Whole Cell Populationen

miRNA oder microRNA sind Schlüsselregulatoren der Zellzyklusprogression. Dieses Video beschreibt eine durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse von Lungenkrebszellen, die mit miRNA transfiziert wurden, um die Wirkung von miRNA auf die Zellzyklusregulation zu untersuchen. Die Hemmung der Proliferation durch Stoppen des Fortschreitens des Zellzyklus hat sich als vielversprechender Ansatz für die Krebsbehandlung erwiesen.

Zellzyklusanalyse: Ein Ansatz zur Untersuchung der Zellzyklusregulation von miRNA-transfizierten Lungenkrebszellen

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Bromdesoxyuridin (BrdU) -Aufnahme, die zeitliche Verfolgung von Zellen, die in der S-Phase auf einen bestimmten Zeitpunkt waren ermöglichen. Die Zugabe von DNA-Farbstoffen und Antikörpermarkierung erleichtert die detaillierte Analyse des Schicksals der S-Phasen-Zellen zu späteren Zeitpunkten.

Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation

Wir berichten über zwei Zellsynchronisationsprotokolle, die einen Kontext für das Studium von Ereignissen im Zusammenhang mit bestimmten Phasen des Zellzyklus bieten. Wir zeigen, dass dieser Ansatz für die Analyse der Regulation von spezifischen Genen in einem ungestörten Zellzyklus oder bei Exposition gegenüber Mitteln, die den Zellzyklus beeinflussen, nützlich ist.

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für doppelte Thymidin-Synchronisation von HeLa-Zellen, gefolgt von Analyse mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie. Diese Methode ist Schlüssel zu große Anzahl von Zellen, die synchron von S-Phase, Mitose gehen, Studien auf mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die auch Interphase Funktionen besitzen.

Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose

Eine Imaging-basierte Methode beschrieben, die kann verwendet werden, um S-Phase zu identifizieren und analysieren Zellzyklus Dynamik in C. Elegans Hermaphrodit Keimbahn mit dem Thymidin analoge EdU. Diese Methode erfordert keine transgene und ist kompatibel mit immunofluorescent Beflecken.

Cell Cycle Analysis in C. Elegans Keimbahn mit Thymidin-Analog-EdU

Dieses Protokoll beschreibt, wie Hautkeratinozyten von Mausmodellen isoliert werden, mit metallmarkierten Antikörpern gefärbt werden und wie man gefärbte Zellen durch Massenzytometrie analysiert, um das Expressionsmuster von Proteinen zu profilieren, die in den verschiedenen Zellzyklusphasen von Interesse sind.

Isolierung und Färbung der Maushaut Keratinozyten für Zellzyklus spezifische Analyse der zellulären Proteinexpression durch Massenzytometrie

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden des Hefezellzyklus-Arrests und der optionalen Freisetzung und erläutert den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von zellzyklusabhängigen Prozessen in S. cerevisiae.

Manipulation und Analyse von zellzyklusabhängigen Prozessen in knospenden Hefen

Langfristige Imaging Säugetierzellen mit Wide-Field-Mikroskopie

Erfahren Sie die Analyse der Zellzyklusposition in Säugerzellen mittels Durchflusszytometrie mit BRDU- und Propidiumiodid-Färbung. Diese Methode ermöglicht die genaue Quantifizierung von Zellen in G1-, S- und G2/M-Phasen.

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