Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Das übergeordnete Ziel dieses in vitro Kinase-Assays ist es, Phosphorylierungsstellen in einem Protein von Interesse zu identifizieren, die spezifisch für die Kinase-Cyclin-abhängige Kinase 1 sind. Die Identifizierung von CDK1-spezifischen Phosphorylierungsstellen ist wichtig, da sie mechanistische Einblicke in die Art und Weise liefern, wie CDK1 den Zellzyklus steuert. Die Regulation des Zellzyklus ist entscheidend für die Phasen-Voll-Chromosomensegregation, und Defekte führen zu Chromosomenaberrationen und Krebs.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie auf gereinigten Proteinen beruht und daher auf jeden Modellorganismus angewendet werden kann und zuverlässige Ergebnisse liefert, insbesondere in Kombination mit funktionellen Studien in Zellen. Diese Methode ist wichtig, da die bekannte Anzahl von CDK1-Zielen immer noch gering ist, obwohl CDK1 schätzungsweise acht bis 13% des Proteums phosphoryliert. Obwohl dieses Verfahren CDK1-spezifische Phosphorylierungsstellen identifiziert, kann es modifiziert werden, um Phosphorylierungsstellen für andere Kinasen zu identifizieren, vorausgesetzt, dass die gereinigte Kinase verfügbar ist.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Bedingungen für den Kinase-Assay für jedes Proteinziel optimiert werden müssen, um eine hohe Phosphorylierungseffizienz zu erzielen. Vorzugsweise 100%Verwenden Sie die IGPS 3.0-Software und besuchen Sie den Webserver, um die CDK1-spezifischen Phosphorylierungsstellen in der CENP-F-Zielproteinsequenz vorherzusagen. Überprüfen Sie die Phosphorylierungsstellen anhand der CDK1-Konsensussequenz

Beginnen Sie mit der Proteinexpression, indem Sie eine Vorkultur vorbereiten. Wandeln Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers einen Mikroliter des Expressionsplasmids in 50 Mikroliter E.coli-kompetente Zellen um. Nach der Zugabe des Plasmids inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis.

Dann inkubieren Sie die Zellen 45 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius. Legen Sie die Zellen nach der Inkubation eine Minute lang auf Eis, geben Sie dann 400 Mikroliter LB zu den Zellen und inkubieren Sie die Kultur dann eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Dann plattieren Sie 200 Mikroliter der Kultur auf LB-Agarplatten, ergänzt mit den gewünschten Antibiotika, je nach Konstrukt.

Inkubieren Sie die Platten anschließend 12 bis 20 Stunden lang bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln. Wählen Sie dann eine Kolonie von der LB-Agarplatte aus und beimpfen Sie die Kolonie mit 50 Millilitern LB-Medium, das mit der gewünschten Antibiotikakombination versetzt ist. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie 12 bis 20 Stunden lang bei 160 bis 180 Umdrehungen pro Minute.

Für jeden Liter LB-Medium werden die Antibiotika und 10 Milliliter mit 40 Vol.-% sterilisierter Glukoselösung zugegeben. Zu diesem Medium geben Sie 20 Milliliter der dicht gewachsenen Vorkultur. Dann inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und schütteln dabei mit 160 bis 180 Umdrehungen pro Minute.

Überprüfen Sie in regelmäßigen Abständen die Absorption der Kultur bei 600 Nanometern. Sobald die Extinktion 0,5 bis 0,6 erreicht, induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von 0,2 millimolar IPTG. Dann inkubieren Sie die Kultur drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln.

Nach drei Stunden werden die Zellen durch Zentrifugation bei 4.100 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius mit einem Ausschwingrotor geerntet. Nach der Zentrifugation wird der Überstand ausgestoßen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 20 Millilitern GST-Bindungspuffer für CENP-F und seinen sechs Bindungspuffern für Karyopherin alpha für jeden Liter Kultur.

Anschließend lagern Sie die Zellen bei minus 80 Grad Celsius. Um CENP-F zu reinigen, tauen Sie zunächst die Zellen mit CENP-F-Konstrukt auf. Stellen Sie dann das Volumen mit einem GST-Bindungspuffer auf 20 Milliliter ein.

Sobald das Volumen angepasst ist, fügen Sie nacheinander alle Reduktionsmittel und die Proteaseinhibitoren hinzu, um die Zellsuspension für die nachfolgende Lyse vorzubereiten. Übertragen Sie anschließend die Zellsuspension in ein Glasbecherglas und tauchen Sie das Becherglas in ein Eiswasserbad. Dann beschallen Sie die Kultur.

Nach der Beschallung fügen Sie dem Lysat 250 mikromolare PMSF hinzu und untersuchen Sie dann das Lysat, das zu diesem Zeitpunkt transparent sein sollte. Dann zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.000 bis 40.000 Mal G für 25 Minuten bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie als nächstes die Säule vor, indem Sie zwei Milliliter Glutathion-Agarose eins zu eins in eine Einweg-Chromatographiesäule geben.

Um die Säule auszugleichen, waschen Sie sie zuerst mit 25 Millilitern Reinstwasser und dann mit 25 Millilitern GST-Bindungspuffer. Sobald die Zentrifugation beendet ist, dekantieren Sie den Überstand und filtrieren Sie den Überstand durch eine Eingießgröße von 0,2 Mikrometern. Gießen Sie als Nächstes das Lysat für den Bindungsschritt auf die verstopfte Säule.

Verschließen Sie die Säule und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius, während Sie sanft nutisieren und Schaumbildung vermeiden. Nach 30 Minuten stellen Sie die Säule auf ein Gestell und lassen Sie das Harz absetzen. Sammeln Sie dann den Durchfluss und waschen Sie die Säule zweimal mit 25 Millilitern GST-Bindungspuffer

Sobald der Waschvorgang abgeschlossen ist, schließen Sie die Säule wieder an. Geben Sie dann 400 Mikroliter GST-Bindungspuffer und 250 Mikroliter PS-Protease-Bestand mit einer Aktivität von 1000 Einheiten pro Milligramm in die Säule. Verschließen Sie die Säule erneut und schwenken Sie die Säule vorsichtig, um das Harz im Puffer wieder zu suspendieren, und inkubieren Sie die Säule dann 16 bis 20 Stunden lang bei vier Grad Celsius.

Nach Ablauf der Inkubationszeit fügen Sie vier Milliliter GST-Bindungspuffer hinzu, um das CENP-F-Fragment aus der Säule zu eluieren, das proteolytisch gespalten wurde. Schließen Sie neben dem erneuten Eluieren des GST-Tags die Spalte an. Geben Sie dann vier Milliliter GST-Elutionspuffer, der Glutathion enthält, in die Säule.

Inkubieren Sie anschließend die Spalte 10 Minuten lang, um das gebundene GST-Tag zu eluieren. Nach 10 Minuten das Eluat auffangen. Führen Sie dann eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durch, um die PS-Protease und die Glutathion-Elutionsfraktionen zu analysieren.

Um die Proteinprobe zu konzentrieren, pipettieren Sie anschließend das PS-Protease-Eluat in das obere Fach einer Zentrifugalfiltereinheit mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von drei Kilodalton. Dann zentrifugieren Sie das Eluat bei 4.100 Mal G in Schritten von 10 bis 15 Minuten bei vier Grad Celsius in einem Ausschwingrotor, um die Probe zu konzentrieren. Mischen Sie die Proteinprobe nach jedem Inkrement im Konzentrationsfilter, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, um die Bildung eines Konzentrationsgradienten zu vermeiden.

Um CENP-F durch Gelfiltration zu reinigen, schließen Sie eine Gelfiltrationssäule an ein schnelles Proteinflüssigkeitschromatographiesystem an. Als nächstes äquilibrieren Sie die Säule mit einem Säulenvolumen Gelfiltrationspuffer. Als nächstes zentrifugieren Sie das CENP-F-Fragment in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei 21, 700 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.

Nachdem die Zentrifugation beendet ist, injizieren Sie die Probe auf die Säule, eluieren Sie die Säule mit Gelfiltrationspuffer und sammeln Sie 0,6 Milliliterfraktionen des CENP-F-Fragments. Analysieren Sie als Nächstes das Gelfiltrationsprofil und führen Sie eine SDS-PAGE der Peakfraktionen aus. Poolfraktionen, die reines CENP-F enthalten.

Konzentrieren Sie dann das gereinigte CENP-F-Fragment auf 3,3 Milligramm pro Milliliter. Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wird das CENP-F-Fragment im Verhältnis eins zu 100 mit Reinstwasser verdünnt. Nehmen Sie als nächstes das Spektrum von 220 bis 300 Nanometern Wellenlänge im Spetrophotometer auf.

Als nächstes werden Aliquots von 50 Mikrolitern des gereinigten CENP-F in 0,5-Milliliter-Mikroröhrchen hergestellt, dann die Röhrchen in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Für den Kinase-Assay mischen Sie das CENP-F-Fragment mit ATP und CDK1-Cyclin B zusammen mit anderen Puffern in einem 0,5-Milliliter-Mikroröhrchen. Bereiten Sie dann eine zweite Probe ohne CDK1-Cyclin B als Negativkontrolle vor.

Anschließend inkubieren Sie die Proben in einem Wasserbad bei 30 Grad Celsius für ein bis 16 Stunden. Für die erfolgreiche Identifizierung der Phosphorylierungsstellen durch Massenspektrometrie ist es entscheidend, dass die Phosphorylierungseffizienz so hoch wie möglich ist, vorzugsweise 100 %Um die Phosphorylierungseffizienz zu erhöhen, fügen Sie mehr Kinase hinzu und erhöhen Sie die Inkubationszeit auf 16 Stunden. Geben Sie dann gleiche Volumina von sechs molaren Guanidinhydrochloridlösung zu der verbleibenden Kinase-Assay-Reaktion und der Negativkontrolle und führen Sie eine Massenspektrometrie durch, um die Phosphorylierungsstelle zu identifizieren.

Um qualitativ hochwertige massenspektrometrische Daten zu erhalten, ist es auch wichtig, dass die gereinigte Proteinprobe hochrein und homogen ist. Die erste SDS-PAGE-Analyse zeigt eine deutliche Verschiebung der Bande auf dem Gel für das phosphorylierte CENP-F im Vergleich zur Negativkontrolle ohne CDK1, was darauf hindeutet, dass es sich bei der cNLS von CENP-F um ein CDK1-Substrat handelt. Als nächstes wird eine Massenspektrometrie durchgeführt, um die Anzahl und Effizienz der CENP-F-Phosphorylierungsstellen zu analysieren.

Das ESI-Ionenfallen-Massenspektrum des intakten in vitro phosphorylierten CENP-F zeigt, dass es fünf Peaks gibt, was auf vier Phosphorylierungsstellen hinweist, und der fünfte Peak ist das unphosphorylierte Protein. Als nächstes zeigt dieses Größenausschluss-Elutionsprofil, dass sich das Elutionsvolumen des Karyopherin-alpha-Peaks bei Zugabe des Wildtyps CENP-F zu einer höheren Masse verschiebt, was bei der Zugabe der CENP-F-Mutante nicht beobachtet wird. Dies deutet darauf hin, dass die phosphomimetische Version S3048D von CENP-F die Interaktion des CENP-F cNLS mit Karyopherin alpha abschwächt.

Schließlich zeigt die durchgeführte SDS-PAGE-Analyse, dass das Wildtyp-CENP-F-Fragment mit intaktem cNLS mit Karyopherin alpha koelutiert, was auf eine starke Wechselwirkung hinweist. Die S3048D-Mutante von CENP-F und Karyopherin alpha eluiert jedoch in getrennten Peaks. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die erhaltenen Phosphorylierungsstellen mit der CDK1-Konsensus-Phosphorylierungssequenz zu vergleichen und sicherzustellen, dass das identifizierte Substrat im selben zellulären Kompartiment wie CDK1 lokalisiert ist.

Nach diesem Verfahren sollte eine funktionelle Überprüfung in den Zellen oder Tiermodellen durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass die identifizierten Phosphorylierungsstellen eine physiologische Funktion haben. Für die funktionelle Verifizierung steht eine Reihe von Werkzeugen zur Verfügung, wie z. B. spezifische CDK1-Inhibitoren und phosphomimetische Mutationen. Aufgrund der großen Anzahl von CDK1-Substraten im Proteum müssen noch viele humane CDK1-Substrate entdeckt werden, und der in vitro Kinase-Assay wird ein wichtiges Werkzeug sein, um diese Stellen zu identifizieren, zu kartieren und zu verifizieren.

Die Identifizierung dieser Phosphorylierungsstellen ermöglicht mechanistische Untersuchungen, wie CDK1 den Zellzyklus steuert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie CDK1-spezifische Phosphorylierungsstellen und Zielproteine mit einem in vitro Kinase-Assay identifizieren können.