Name: Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Lernen Sie die Identifizierung von Cdk1-spezifischen Phosphorylierungsstellen durch einen In-vitro-Kinase-Assay. Diese Methode liefert mechanistische Einblicke in die Zellzyklusregulation und kann auf verschiedene Modellorganismen angewendet werden.

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Wir danken Dr. David King, Howard Hughes Medical Institute, University of California in Berkeley für Massenspektrometrie Analyse und hilfreichen Kommentare. Wir danken Dr. Xuelian Zhu Shanghai Institutes for Biological Sciences, chinesische Akademie von Wissenschaften, Shanghai, China für die Bereitstellung eines Full-Length CENP-F-Konstrukt. Zu guter Letzt danken wir Dr. Susan Bane, Dr. Brian Callahan und Dr. Christof Grewer an der Binghamton University für den Zugriff auf Geräte. Diese Forschung wurde von der Forschungsgemeinschaft für die State University of New York und der Fakultät für Chemie, State University of New York at Binghamton finanziert.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Unsere in-vitro- Kinase Assay ist eine sehr leistungsfähige Methode zur Identifizierung von molekularer Zielstrukturen für die Kinase Cdk1, die eine übergeordnete Steuerung des Zellzyklus und reguliert viele wichtige zelluläre Prozesse. Die Methode bestimmt, ob ein gereinigtes Protein ein Substrat für Cdk1 ist und ermöglicht die Identifizierung von spezifischen Phosphorylierung Websites. Dies erleichtert die mechanistische Studien zur Regulation zellulärer Prozesse durch Phosphorylierung durch Cdk1.
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Kinasen sind Enzyme, die Übertragung von Phosphatgruppen von ATP auf Substraten und regulieren viele zelluläre Prozesse. Diese Phosphorylierung ist reversibel, schnell, fügt zwei negative Ladungen und freie Energie speichert und gehört zu den häufigsten posttranslationale Modifikationen von Zellen verwendet. Cdk1, die auch bekannt als Zellteilung Zyklus Protein 2 Homolog (cdc2) ist ein master-Controller für den Zellzyklus in allen Eukaryoten1,2,3,4,5, und phosphorylates ein Geschätzte 8 bis 13 % des Proteoms6,7.
Während Proteomik-Studien haben viele Phosphorylierung Websites in den Proteinen, in den meisten Fällen identifiziert ist die Kinase verantwortlich für diese Änderungen unbekannt. Die Anzahl der bekannten Cdk1 Zielen, vor allem in menschlichen Zellen ist niedrig7. Die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites ist wichtig, da es mechanistische Studien, die festlegen ermöglicht, wie Cdk1 Zellzyklus steuert. Regulierung des Zellzyklus ist wichtig für Treue Chromosom Segregation und Zellteilung, und eine Vielzahl von zellulären Prozessen auftreten, um diese wichtige physiologische Funktion unterstützen müssen. Dazu gehören aufzuhalten, Transkription und Translation vor dem Beginn der Mitose sowie eine dramatische Reorganisation in zellulare Struktur und Organisation, z. B. Demontage der Kernhülle, Chromosom Kondensation und Montage der mitotischen Spindel. Deregulierung und Fehler in diesen Prozessen verursachen Krebs, Geburtsschäden oder mitotische Zelltod. Spezifische Inhibitoren des Cdk1 wie RO-3306 waren entwickelten8, die bieten leistungsstarke Tools für funktionelle Studien, und einige dieser Inhibitoren sind derzeit in klinischen Studien zur Behandlung von Krebs (siehe9 zur Überprüfung).
Hier beschreiben wir einen in-vitro- Kinase Assay, der die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites ermöglicht. In diesem Test wird kommerziell verfügbare menschliche Cdk1/cyclin B verwendet, um eine gereinigte Ziel Protein in Vitrophosphorylieren. Phosphorylierung eines Substrates erhöht seine Masse und fügt zwei negative Ladungen; daher bestätigt erfolgreiche Phosphorylierung eine aufwärts Verschiebung der Protein Gel Band auf SDS-PAGE. Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites werden anschließend durch Massenspektrometrie Analyse des Proteins in Vitro phosphoryliert identifiziert. Experimentelles Design unterstützen, überprüfen wir auch Berechnungswerkzeuge und Referenzen für die Vorhersage von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites die Proteinsequenz. Darüber hinaus erläutern wir im folgenden Reinigung-Protokolle, die sehr reine und homogene Protein Vorbereitungen für die Kinase Assay ergeben. Schließlich identifizierte Phosphorylierung Websites durch funktionelle Studien überprüft werden müssen, und eine einfache Bindung-Assay wird hier beschrieben, für diesen Zweck. Kombiniert, ist dies ein sehr leistungsfähiges Ansatz, der Renditen Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites und mechanistische Studien in wie Cdk1 den Zellzyklus7,10,11 steuert. Da diese Methode auf gereinigten Proteinen angewiesen ist, kann es zu jedem Modell Organismus und Erträge zuverlässige Ergebnisse angewendet werden. Funktionale Überprüfung des erhaltenen Phosphorylierung Websites in Vitro wird jedoch empfohlen, wie Zellen zusätzliche regulatorische Mechanismen, z. B. posttranslationale Modifikationen, Interaktionspartner oder zellulären Lokalisation verfügen, kann Phosphorylierung Websites oder unzugänglich für die Anerkennung von Cdk1 rendern.
Cdk1 erkennt eine Konsens-Phosphorylierung-Website, die besteht aus (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), wo X ist keine Rückstände und ein Serin oder Threonin der Ort der Phosphorylierung ist. Besonders wichtig für die Anerkennung ist das Vorhandensein von Prolin in der + 1-Position. Darüber hinaus werden grundlegende Rückstände in den + 2 oder + 3 Positionen bevorzugt, mit die meisten Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites mit einer Lys oder Arg auf die + 3 position6,12.
Aktivierung des Cdk1 ist streng geregelt und führt zu Beginn der Mitose1,2,3,4,5. Im Allgemeinen hängt die Aktivität von cyclin-abhängigen Kinasen ihre Assoziation mit deutlichen Cyclin (cyclin A, B, C, D und E in den Menschen), die bei oszillierenden Ebenen in der gesamten Zellzyklus13ausgedrückt werden. Cdk1 Ausdruck ist konstant über den Zellzyklus und die Regulierung ihrer Tätigkeit stützt sich auf seine Assoziation mit den regulatorischen Untereinheiten cyclin A und cyclin B5,13,14,15, als gut als Post-translationalen Modifikationen. Bildung des Cdk1/cyclin B-Komplex ist erforderlich für die Kinase Aktivierung5,14,15,16,17,18. In der G2-Phase cyclin B übersetzt in das Zytosol und importiert in den Zellkern, wo es an Cdk15,14,15,16,17,18 bindet; jedoch wird Cdk1/cyclin B inaktiviert durch Phosphorylierung an Thr14 und Tyr15 Rückstände von der menschlichen Cdk1-hemmenden Kinasen Myt1 (cdc2-hemmenden membranassoziierten Tyrosin und Threonin-spezifische Kinase) und Wee1, bzw.19gehalten, 20,21. In der Spätphase der G2 Dephosphorylation Thr14 und Tyr15 durch Zellteilung Zyklus 25 Phosphatase (cdc25) aktiviert die Kinase-Aktivität des Cdk1/cyclin B-Komplex und löst die Einleitung der Mitose12,14, 18 , 20 , 22 , 23. Phosphorylierung des Thr161 auch für Cdk1/cyclin B Aktivierung ist erforderlich und wird durch Cdk7, die Aktivierung von Cdk-Kinase (CAK)18vermittelt. Abbau von cyclin B in Anaphase inaktiviert Cdk1, so dass Ausstieg aus Mitose24,25. Aktivierung des Cdk1/cyclin B wird daher ein komplizierter Prozess. Die hier vorgestellten Protokoll erfolgt mit handelsüblichen Cdk1/cyclin B. Während rekombinante Expression dieses Komplexes in Insektenzellen es aktiviert in Vivo durch endogene Kinasen14,20 ist und bleibt aktiv im gereinigten Zustand. Die daraus resultierende aktive, rekombinante menschliche Cdk1/cyclin B eignet sich für in-vitro- Kinase-Assays.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites in den menschlichen Zentromer Protein F (CENP-F)10. CENP-F ist ein Kinetochor-Protein, das befindet sich im Zellkern während der meisten Zeit der Interphase (G1 und S-Phase) und der Ausfuhr nach dem Zytosol in der G2 Phase26,27,28 in einer Cdk1-abhängigen Weise10, 11. nuklearen Lokalisierung durch einen zweiseitigen cNLS26gewährt wird. cNLSs werden von den Nukleartransporten Faktor Karyopherin α, erkannt, die zusammen mit Karyopherin β und RanGDP, die Einfuhr von cNLS-Cargo in den Zellkern29erleichtert. Nuclear Export in der G2-Phase wird über eine unbekannte Export Weg10erleichtert. Sobald CENP-F in die Zellflüssigkeit befindet, es wird eingestellt, um die Kernhülle und wiederum stellt den motor Protein Komplex dynien30,31. Dieser Weg ist wichtig, den Kern der Centrosome entsprechend während der Anfangsphase der mitotischen Spindel Baugruppe in ein dynien-abhängigen Weise positionieren ist wichtig für das richtige Timing der mitotischen Eintrag und ein grundlegender Vorgang im Gehirn Entwicklung30,31,32. Beginnend in der G2-Phase, wird CENP-F auch in das Kinetochor eingebaut wo hat wichtige Aufgaben für Treue Chromosom Abtrennung27,28,33,34,35 . Ein wichtigster regulatorische Schritt dieser Wege ist der nuklearen Export von CENP-F in der G2-Phase, die Cdk110,11abhängig ist. Wir beschreiben hier ein Protokoll für die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites in die cNLS CENP-f Phosphomimetic Mutationen dieser Seiten verlangsamen nuclear Import von CENP-F, was darauf hindeutet, dass Cdk1/cyclin B direkt zellulären Lokalisation der CENP-F durch Phosphorylierung von seinem cNLS10regelt.
Insgesamt, dieser in-vitro- Kinase Assay ermöglicht die Identifikation von spezifischen Substraten für die Kinase Cdk1. Purified Zielproteine phosphorylierten in Vitro durch die im Handel erhältlichen Cdk1/cyclin B-Komplex und die Phosphorylierung Websites sind werden anschließend durch Massenspektrometrie identifiziert. Die Identifikation des Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites unterstützt mechanistische Studien, die zeigen, wie Cdk1 Zellzyklus steuert.

<table><tbody><tr><td>2800 mL Fernbach-Kolben mit Schallwand</td><td>Corning</td><td>44232XL</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidinhydrochlorid</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6506-25</td><td></td></tr><tr><td>Flaschenfilter</td><td>Corning</td><td>431161</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/Cyclin B rekombinant, human 20.000 U/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/Cyclin B (alternative Quelle)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-450</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/Cyclin B (alternative Quelle)</td><td>Invitrogen</td><td>PV3292</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/Cyclin B + 10x PK Puffer</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>CENP-F (Rückstände 2987 &ndash; 3065) pGEX6P1 Plasmid</td><td>Auf Anfrage erhältlich.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge: Heraeus Multifuge X3R, gekühlt, mit TX-1000 Ausschwingrotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugalfiltereinheiten: Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheiten, 3 kDa Cutoff, Ultracel-PL Membranen</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Chlorampenicol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-100</td><td></td></tr><tr><td>D/L Methionin</td><td>Agros Organics / Fisher</td><td></td><td></td>125650010</tr><tr><td>Pipettenspitzen zum Entsalzen: Zip-Spitzen</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZTC18S008</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Chromatographiesäulen, Econo-Pac 1,5 x 12 cm</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS Stamm</td><td>EMD Millipore</td><td>71403</td><td></td></tr><tr><td>Elektrospray-Ionisation Fourier-Transformations-Ionen</td><td>Bruker Amazon</td><td>Apex III</td><td></td></tr><tr><td>Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrospray-Ionisations-Ionenfallen-Massenspektrometer</td><td>Bruker Amazon</td><td>kundenspezifischer</td><td></td></tr><tr><td>Festwinkelrotor: Fiberlite F15-8x-50cy</td><td>Thermo Scientific</td><td>97040-276</td><td></td></tr><tr><td>FPLC-System: &Auml; kta Pure FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29032697</td><td></td></tr><tr><td>Gel Filtrationssäule: Superdex 200 Erhöhung 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion Agarose</td><td>Pierce</td><td>16101</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion, reduziert</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>Inkubationsschüttler: Multitron-Schüttler</td><td>Infors</td><td>I10102</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>karyopherin &alpha; pet-28a pres plasmid</td><td>Auf Anfrage erhältlich.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani Medium</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge 5418R, gekühlt</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen (0,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen (1,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Nickel Affinitätsgel: His-Select Nickel Affinitätsgel</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6611-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-6P-1 Plasmid</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9546-48</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>P470-10</td><td></td></tr><tr><td>PS-Protease: PreScission Protease</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Phos-Tag Acrylamid</td><td>Wako Pure Chem. Ind.</td><td>304-93521</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen mit reduziertem Gluthathion (Oakridge-Röhrchen)</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>055291D</td><td></td></tr><tr><td>ortsgerichtetes Mutagenese-Kit: QuikChange Lightning</td><td>Agilent</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>ortsgerichtete Mutagenese Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonifikator: Branson S-250D Sonifikator</td><td>Branson</td><td>15 338 125</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1RC Dialysemembran (6-8 kDa Cutoff)</td><td>Spectrum Labs</td><td>08 670B</td><td></td></tr><tr><td>Ausschwingrotor TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr></tbody></table>

identifizierung von cyclin-abhängige kinase 1 spezifische phosphorylierung websites durch eine in-vitro- kinase assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-abhängige Kinase 1 (Cdk1) ist ein master-Controller für den Zellzyklus in allen Eukaryoten und schätzungsweise 8-13 % des Proteoms phosphorylates; die Anzahl der identifizierten Ziele für Cdk1, besonders in den menschlichen Zellen ist jedoch nach wie vor niedrig. Die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites ist wichtig, da sie mechanistische Einblicke in wie Cdk1 Zellzyklus steuert. Regulierung des Zellzyklus ist entscheidend für die treuen Chromosom Abtrennung und Mängel in diesen komplizierten Prozess zu Chromosomenaberrationen und Krebs führen.
Hier beschreiben wir einen in-vitro- Kinase Assay, der verwendet wird, um Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites zu identifizieren. In diesem Test ist ein gereinigtes Protein phosphorylierten in Vitro kommerziell verfügbare menschliche Cdk1/cyclin B. erfolgreich Phosphorylierung wird bestätigt durch SDS-PAGE und Phosphorylierung Websites werden anschließend durch Massenspektrometrie identifiziert. Wir beschreiben auch Reinigung-Protokolle, die Ausbeute sehr reine und homogene Protein Vorbereitungen für die Kinase Assay und eine verbindliche Assay für die funktionale Verifikation der identifizierten Phosphorylierung-Standorte, die die Interaktion zwischen den Sonden ein klassischer nuklearen Lokalisierung-Signal (cNLS) und seine Nukleartransporten Rezeptor Karyopherin α. Experimentelles Design unterstützen, überprüfen wir Ansätze für die Vorhersage von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites von Proteinsequenzen. Zusammen stellen diese Protokolle einen sehr leistungsfähigen Ansatz, der Renditen Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites und mechanistische Studien in wie Cdk1 Zellzyklus steuert. Da diese Methode stützt sich auf gereinigten Proteinen, kann es zu jedem Modell Organismus und Erträge zuverlässige Ergebnisse, vor allem in Kombination mit Zelle funktionelle Studien angewendet werden.

Wir haben vor kurzem einen in-vitro- Kinase Assay (Abbildung 1) verwendet, um Cdk1-spezifische Phosphorylierung Seiten in einem Fragment CENP-F zu ermitteln, die ein cNLS10enthalten. Dieses Signal verleiht nuklearen Lokalisierung von CENP-F während des größten Teils der Interphase. In der G2-Phase ist CENP-F aus dem Zellkern in das Zytosol in gewissem Sinne Cdk1-abhängige exportiert. Mechanistische Einblicke, wie Cdk1 regelt d...

Cyclin-abhängige Kinase 1 (Cdk1) wird in der G2-Phase des Zellzyklus aktiviert und reguliert viele zelluläre Signalwege. Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine in-vitro- Kinase Assay mit Cdk1, wodurch die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites für zellulare Ziele von diesem wichtigen Kinase.

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Das übergeordnete Ziel dieses in vitro Kinase-Assays ist es, Phosphorylierungsstellen in einem Protein von Interesse zu identifizieren, die spezifisch für die Kinase-Cyclin-abhängige Kinase 1 sind. Die Identifizierung von CDK1-spezifischen Phosphorylierungsstellen ist wichtig, da sie mechanistische Einblicke in die Art und Weise liefern, wie CDK1 den Zellzyklus steuert. Die Regulation des Zellzyklus ist entscheidend für die Phasen-Voll-Chromosomensegregation, und Defekte führen zu Chromosomenaberrationen und Krebs.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie auf gereinigten Proteinen beruht und daher auf jeden Modellorganismus angewendet werden kann und zuverlässige Ergebnisse liefert, insbesondere in Kombination mit funktionellen Studien in Zellen. Diese Methode ist wichtig, da die bekannte Anzahl von CDK1-Zielen immer noch gering ist, obwohl CDK1 schätzungsweise acht bis 13% des Proteums phosphoryliert. Obwohl dieses Verfahren CDK1-spezifische Phosphorylierungsstellen identifiziert, kann es modifiziert werden, um Phosphorylierungsstellen für andere Kinasen zu identifizieren, vorausgesetzt, dass die gereinigte Kinase verfügbar ist.Im Allgemeinen werden Personen, die mit

identification-cyclin-dependent-kinase-1-specific-phosphorylation

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Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

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Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

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