Die Beurteilung der Leber metabolischen Veränderungen während Progressive Colonization von Keimfrei Maus durch ¹ H-NMR-Spektroskopie

Ziel dieses Verfahrens ist es, den Einfluss einer fortschreitenden Besiedlung auf den Leberstoffwechsel des Wirts zu beurteilen. Dies wird erreicht, indem zunächst nach und nach keimfreie Mäuse besiedelt werden. Der Besiedlungsprozess wird durch die Auswertung der Ausscheidung von mikrobiellen Cometaboliten im Urin mittels NMR-Spektroskopie überwacht.

Nach der Überwachung des Besiedlungsprozesses wird eine Leberbiopsie von der Maus entnommen und für die Erstellung eines metabolischen Profils vorbereitet. Das hepatische Stoffwechselprofil kann dann aus der intakten Biopsie mit Hilfe der zerstörungsfreien, hochauflösenden Magic-Angle-Spinning-NMR-Spektroskopie gewonnen werden. Letztendlich deckt dieser Einsatz der Protonen-NMR-Spektroskopie verschiedene Metaboliten auf, die an Stoffwechselwegen wie Energie und oxidativem Stress beteiligt sind.

Dieses Experiment kann also Aufschluss über die Leberfunktionen während der Besiedlung geben. Es kann auch über das System, wie z. B. die Niere, angewendet werden. Um die Tiere zu besiedeln, nehmen Sie keimfreie Mäuse aus Isolatoren und halten Sie sie in einem konventionellen Haltungsraum in Käfigen, ausgestattet mit einem Filter vor den konventionellen Tieren, der als Kontrolle dient.

Mischen Sie dann die Hälfte einer drei Tage alten Streu aus dem konventionellen Kontrollkäfig mit der Streu der keimfreien Tiere, sammeln Sie Urin in einem 1,5 Milliliter Mikroröhrchen, indem Sie die Maus über das Röhrchen halten und helfen Sie durch sanftes Massieren des Darms. Für die Erfassung mit einer Fünf-Millimeter-NMR-Sonde sind mindestens 20 Mikroliter erforderlich, es wird jedoch empfohlen, 30 Mikroliter zu verwenden, um die Qualität der metabolischen Profilerstellung zu verbessern. Den Urin sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren, bis zur NMR-Analyse bei mindestens minus 40 Grad Celsius lagern.

Vor der NMR-Aufnahme 0,2 molare Natriumphosphat-Pufferlösung in schwerem Wasser mit einem pH-Wert von 7,4 und einem millimolaren TSP Mischen Sie 30 Mikroliter des Thurins mit 30 Mikrolitern Natriumphosphatpuffer. Übertragen Sie 50 Mikroliter der gemischten Lösung in ein 1,7-Millimeter-NMR-Kapillarröhrchen mit einer 50-Mikroliter-Glasspritze, die mit einer Metallnadel ausgestattet ist.

Achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden. Setzen Sie den Kapillaradapter auf die Kapillare mit der Urinprobe und legen Sie ihn in ein 2,5-Millimeter-NMR-Mikroröhrchen für eine Fünf-Millimeter-NMR-Sonde. Diese Kombination von Röhren kann als Standard-Fünf-Millimeter-NMR-Röhre für die spektrale Erfassung verwendet werden.

Bei dieser Demonstration wird ein fortschrittliches 3-Megahertz-NMR-Spektrometer mit drei Megahertz verwendet, um die Daten zu sammeln. Erfassen Sie eindimensionale Protonen-NMR-Spektren unter Verwendung der Parameter, die im schriftlichen Protokoll besprochen wurden. Verwenden Sie nach der NMR-Aufnahme den Extraktionsstab, um die Kapillare aus dem 2,5-Millimeter-NMR-Röhrchen zu entfernen, indem Sie den Kapillaradapter vorsichtig anschrauben, um ihn nach der Euthanasie von Tieren herauszuziehen, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Bereiten Sie sich auf die Leberbiopsie vor. Verwenden Sie keine alkoholhaltigen Produkte, um Verunreinigungen zu vermeiden, und waschen Sie Werkzeuge mit Wasser oder Kochsalzlösung. Entnehmen Sie Leberbiopsien aus dem linken Lappen für reproduzierbare Biopsien.

Sammeln Sie konsequent in der Mitte des linken Lappens und vermeiden Sie die peripheren Bereiche, in denen das Gewebe dünner ist. Achten Sie darauf, dass die Gallenblase im Falle eines Gallenverlusts nicht perforiert wird. Waschen Sie das Tuch sofort mit Wasser oder Kochsalzlösung.

Biopsien sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und bis zur NMR-Analyse bei minus 80 Grad Celsius lagern. Zur Vorbereitung auf H-R-M-A-S-N-M-R die dritte Biopsie in einen Zirkoniumrotor einführen und den Rest des Volumens mit reinem schwerem Wasser für die NMR-Sperre füllen. Achten Sie darauf, keine Blasen zu bilden, da diese die Qualität der nachfolgenden Shimming und Datenerfassung beeinträchtigen könnten. Setzen Sie mit der zylindrischen Schraube einen 50-Mikroliter-Teflon-Abstandshalter ein.

Schrauben Sie es ab und kalibrieren Sie es mit dem Tiefenmesser an der kurzen Seite. Setzen Sie den Gewindestift auf den Abstandshalter und schrauben Sie ihn vorsichtig mit dem Schraubendreher fest. Trockenhaus, eventuelles Restwasser mit einem Stück Taschentuch.

Setzen Sie dann die Kappe oben auf den Rotor und setzen Sie sie in den Rotorpacker ein. Drücken Sie fest, bis die Kappe an Ort und Stelle ist. Zwischen dem Rotor und seiner Kappe sollte kein Platz mehr vorhanden sein. Markieren Sie die Hälfte der Unterseite des Rotors mit einem schwarzen Markierungsstift, um die optische Erkennung der Rotationsrate zu ermöglichen.

Wenn der Rotor ausreichend gepackt ist, setzen Sie ihn in das NMR-Spektrometer ein und beginnen Sie, fünf Kilohertz hochzudrehen. Hier. Zum Einsatz kommt ein bru advanced drei 500 Megahertz Spektrometer. Erfassung des Protonen-NMR-Spektrums mit einer CP MG-Pulssequenz

Gemäß den Richtlinien des Herstellers könnte der reichlich vorhandene alpha- und numerische Glukose-Doublet-Peak von 5,22 ppm zur Kalibrierung der resultierenden NMR-Spektren verwendet werden. Um den Rotor auszupacken, entfernen Sie die Kappe, verwenden Sie den Kappenentferner, schrauben Sie den Gewindestift ab und entfernen Sie den Teflon-Abstandshalter. Mit der zylindrischen Schraube kann das Gerät gründlich mit Wasser und Reinigungsmittel gewaschen werden.

Das Auftreten von mikrobiellen Co-Metaboliten des Darms während des Besiedlungsprozesses wird in diesem Protonenspektrum eines Stoffwechselprofils im Urin für ein Tier, das 20 Tage besiedelt ist, deutlich veranschaulicht. Dieses Tier schied im keimfreien Zustand kein fügsames Sulfat und sehr geringe Mengen an Phenylacetylglycin, abgekürzt PAG und que-Zellsulfat aus. Mit fortschreitender Besiedlung nehmen diese drei Marker des Proteinstoffwechsels durch die Darmmikrobiota erheblich zu und erreichen am 20. Tag ein Gleichgewicht.

Durch die Integration des spezifischen PAG-Triplett-Peaks war es möglich, den Anstieg dieses speziellen Markers im Laufe der Zeit zu quantifizieren. Dieses Diagramm stellt die durchschnittliche PAG-Konzentration während der Besiedlung für eine Gruppe von sieben Tieren unter Verwendung der Protonenspektroskopie H-R-M-A-S-N-M-R dar, wobei das hepatische Stoffwechselprofil von zwei Mäusen vor und nach der Besiedlung erhalten wurde. Diese Abbildung veranschaulicht gut die Informationen, die aus dem A-M-A-S-N-M-R-basierten Stoffwechselprofil abgeleitet werden können.

Zahlreiche Aminosäuren sowie Metaboliten, die aus dem Energiestoffwechsel stammen, können visualisiert werden. Diese Profile enthalten auch Informationen, die für oxidativen Stress, den Nukleotidstoffwechsel und den Methylaminstoffwechsel relevant sind. In diesem Beispiel wird sehr deutlich, dass die keimfreie Maus fast kein Glykogen und sehr geringe Mengen an Glukose und Triglyceriden aufweist.

Nach diesem Verfahren können also mehrere statistische Werkzeuge wie die Chemo angewendet werden, um logische Proben nach dem Stoffwechselprofil zu gruppieren und Biomarker hervorzuheben, die mit dem Stoffwechselstatus verbunden sind.