Die Beurteilung der Leber metabolischen Veränderungen während Progressive Colonization von Keimfrei Maus durch ¹ H-NMR-Spektroskopie

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Auswirkungen einer progressiven Kolonisation auf den hepatischen Stoffwechsel des Wirts zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst keimfreie Mäuse schrittweise kolonisiert werden. Der Kolonisierungsprozess wird durch die Bewertung der mikrobiellen Cotaboliten-Ausscheidung im Urin mittels NMR-Spektroskopie überwacht.

Nach der Überwachung des Kolonisationsprozesses wird eine Leberbiopsie von der Maus entnommen und für die metabolische Profilierung aufbereitet. Das hepatische Stoffwechselprofil kann anschließend aus der intakten Biopsie mittels nichtdestruktiver NMR-Spektroskopie mit hoher Auflösung und unter dem magischen Winkel gewonnen werden. Letztendlich ermöglicht dieser Einsatz der Protonen-NMR-Spektroskopie den Nachweis verschiedener Metaboliten, die an Stoffwechselwegen wie beispielsweise den Energie- und oxidativen Stresswegen beteiligt sind.

Daher kann dieses Experiment Einblicke in die Leberfunktionen während der Besiedlung geben. Es kann auch an anderen Organen wie der Niere angewendet werden. Um die Tiere zu besiedeln, nehmen Sie keimfreie Mäuse aus Isolatoren heraus und halten Sie sie in einem konventionellen Tierhaltungsraum in Käfigen, die mit einem Filter ausgestattet sind, vor den konventionellen Tieren, die als Kontrollen dienen.

Danach mischen Sie die Hälfte eines dreitägigen Nestes, das aus dem kontrollierten konventionellen Käfig stammt, mit dem Einstreu der keimfreien Tiere. Sammeln Sie den Urin in einem 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen, indem Sie die Maus über dem Röhrchen halten und durch sanftes Massieren des Darms helfen. Für die Messung mit einer Fünf-Millimeter-NMR-Sonde sind mindestens 20 Mikroliter erforderlich, es wird jedoch empfohlen, 30 Mikroliter zu verwenden, um die Qualität des metabolischen Profilings zu verbessern. Schockgefrieren Sie den Urin unverzüglich in flüssigem Stickstoff und lagern Sie ihn bei mindestens minus 40 Grad Celsius bis zur NMR-Analyse.

Vor der NMR-Aufnahme bereiten Sie eine 0,2-molare Natriumphosphat-Pufferlösung in schwerem Wasser vor. pH 7,4 enthaltend ein Millimolar TSP, mischen Sie 30 Mikroliter des Harns mit 30 Mikrolitern Natriumphosphat-Puffer. Geben Sie 50 Mikroliter der gemischten Lösung mit einer 50-Mikroliter-Glasspritze, ausgestattet mit einer Metallnadel, in ein 1,7-Millimeter-NMR-Kapillarrohr.

Achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden. Setzen Sie den Kapillaradapter auf die Kapillare, die die Urinprobe enthält, und platzieren Sie sie in ein 2,5-Millimeter-NMR-Mikroröhrchen für eine 5-Millimeter-NMR-Sonde. Diese Kombination von Röhrchen kann als Standard-5-Millimeter-NMR-Röhrchen für die Spektralaufnahme verwendet werden.

In dieser Demonstration wird ein Bruer Advanced 700-Megahertz-NMR-Spektrometer verwendet, um die Daten zu erfassen. Nehmen Sie eindimensionale Protonen-NMR-Spektren unter Verwendung der im schriftlichen Protokoll beschriebenen Parameter auf. Verwenden Sie nach der NMR-Aufnahme die Extraktionsnadel, um die Kapillare aus dem 2,5-Millimeter-NMR-Röhrchen zu entfernen, indem Sie den Kapillaradapter vorsichtig aufschrauben, um sie herauszuziehen, nachdem die Tiere gemäß dem schriftlichen Protokoll euthanasiert wurden.

Bereiten Sie die Leberbiopsie vor. Verwenden Sie kein alkoholhaltiges Produkt, um Kontaminationen zu vermeiden, und reinigen Sie die Instrumente mit Wasser oder Kochsalzlösung. Entnehmen Sie Leberbiopsien aus dem linken Leberlappen, um reproduzierbare Biopsien zu erhalten.

Entnehmen Sie das Gewebe konsequent aus der Mitte des linken Lappens und vermeiden Sie die peripheren Bereiche, in denen das Gewebe dünner ist. Achten Sie darauf, die Gallenblase nicht zu perforieren, falls eine Bile-Leckage vorliegt. Waschen Sie das Gewebe sofort mit Wasser oder einer Kochsalzlösung.

Die Biopsien sofort in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und bis zur NMR-Analyse bei minus 80 Grad Celsius lagern. Für die H-R-M-A-S-N-M-R-Analyse die dritte Biopsie in einen Zirkoniumrotor geben und den restlichen Raum mit reinem schwerem Wasser für die NMR-Signalstabilisierung auffüllen. Dabei darauf achten, keine Blasen zu erzeugen, da diese die Qualität der anschließenden Abstimmung und Datenaufnahme beeinträchtigen könnten. Einen 50-Mikroliter-Teflon-Abstandshalter mit Hilfe der zylindrischen Schraube einführen.

Lösen Sie es und kalibrieren Sie es mithilfe des Tiefenmessers an der kurzen Seite. Setzen Sie den Gewindestift auf den Abstandshalter und schrauben Sie ihn vorsichtig mit dem Schraubendreher fest. Trocknen Sie das Gehäuse und restliches Wasser mit einem Stück Papiertuch.

Als Nächstes setzen Sie die Kappe oben auf den Rotor und führen Sie sie in den Rotorverdichter ein. Drücken Sie fest, bis die Kappe sicher sitzt. Zwischen Rotor und Kappe sollte kein Spalt verbleiben. Markieren Sie die Hälfte der Unterseite des Rotors mit einem schwarzen Markierstift, um die optische Drehzahlmessung zu ermöglichen.

Wenn der Rotor ausreichend befüllt wurde, setzen Sie ihn in den NMR-Spektrometer ein und beginnen Sie mit dem Anlaufen auf fünf Kilohertz. Hier wird ein Bruker Avance III 500-Megahertz-Spektrometer verwendet. Nehmen Sie das Protonen-NMR-Spektrum mit einer CP MG-Pulssequenz auf.

Entsprechend den Herstellerangaben kann der intensive Doppelsignalpeak für Glukose bei 5,22 Teilen pro Million aus den alpha- und numerischen Signalen zur Kalibrierung der resultierenden NMR-Spektren verwendet werden. Um den Rotor zu öffnen, entfernen Sie die Kappe mit dem Kappe-Entferner, schrauben die Gewindestift ab und nehmen den Teflon-Abstandshalter heraus. Mithilfe der zylindrischen Schraube kann die Apparatur gründlich mit Wasser und Reinigungsmittel gespült werden.

Das Auftreten von mikrobiellen Kolonisationsnebenprodukten im Darm wird in diesem Protonenspektrum eines urinären Stoffwechselprofils für ein 20 Tage lang kolonisiertes Tier deutlich veranschaulicht. Dieses Tier scheidete im keimfreien Zustand kein Indoxylsulfat und nur geringe Mengen an Phenylacetylglycin, abgekürzt PAG, sowie Quecksilbersulfat aus. Während die Kolonisation fortschreitet, nehmen diese drei Marker des Proteinstoffwechsels durch die Darmmikrobiota deutlich zu und erreichen am Tag 20 ein Gleichgewicht.

Durch die Integration des spezifischen PAG-Triplettsignals konnte die Zunahme dieses bestimmten Markers im Zeitverlauf quantifiziert werden. Dieses Diagramm zeigt die durchschnittliche PAG-Konzentration während der Kolonisation für eine Gruppe von sieben Tieren, ermittelt mittels Protonen-H-R-M-A-S-N-M-R-Spektroskopie; der hepatische Stoffwechselprofil von zwei Mäusen vor und nach der Kolonisation wurde aufgenommen. Diese Abbildung veranschaulicht gut die Informationen, die aus einem A-M-A-S-N-M-R-basierten Stoffwechselprofil gewonnen werden können.

Zahlreiche Aminosäuren sowie Metaboliten des Energiestoffwechsels können sichtbar gemacht werden. Diese Profile enthalten auch Informationen zur oxidativen Belastung, Nukleotidstoffwechsel und Methylamin-Stoffwechsel. In diesem Beispiel ist deutlich erkennbar, dass die keimfreie Maus nahezu kein Glykogen sowie sehr geringe Mengen an Glukose und Triglyceriden aufweist.

So können nach diesem Verfahren mehrere statistische Werkzeuge wie Chemo angewendet werden, um logische Proben entsprechend ihres Stoffwechselprofils zu gruppieren und Biomarker hervorzuheben, die mit dem Stoffwechselstatus assoziiert sind.