Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, epitheliale Zellen aus dreidimensionalen gemischten Zellgewebekulturen zu gewinnen, um die Auswirkungen von stromalen Fibroblasten auf die Biologie epithelialer Zellen zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst dreidimensionale gemischte Zell-Steroid-Kokulturen etabliert werden. Anschließend werden die Sphäroide von der Matrixkultur getrennt, um die epithelialen Zellen nach der Kokultur zu isolieren.

Der nächste Schritt besteht darin, die epithelialen Zellen nach der Co-Kultur so lange zu passagieren, bis sie zur Analyse bereitstehen. Letztendlich können die Auswirkungen der Exposition gegenüber Fibroblasten in der dreidimensionalen Kultur auf das Verhalten epithelialer Zellen durch mikroskopische Bildgebung der Kulturen und Analyse nach der Co-Kultur bewertet werden. Epitheliale Zellen, beispielsweise mittels Fluoreszenzbildgebung der Matrixinvasion und Transwell-Migration, wie hier gezeigt, werden analysiert. Das Verfahren wird von Quin, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstriert, am Tag vor der Einrichtung der Co-Kulturen.

Entfernen Sie das Matre-Gel aus dem Gefrierschrank und tauen Sie es über Nacht in einem Kühlschrank bei vier Grad Celsius auf Eis auf. Am Tag des Experiments stellen Sie das Kulturmedium mindestens eine Stunde vor der Vermischung mit dem Matra-Gel auf Eis. Zum Verdünnen des aufgetauten Matra-Gels.

Geben Sie die Hälfte des Volumens des eiskalten H-Mac-Mediums, das für die Co-Kultur erforderlich ist, in ein steriles Gefäß auf Eis. Fügen Sie dann die gleiche halbe Gesamtmenge des aufgetauten Matrigels dem Gefäß hinzu, um eine Verdünnung im Verhältnis 1:1 zu erreichen, und bewahren Sie das Gefäß weiterhin auf Eis auf. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter der Matrigel-Medium-Mischung in die Mitte der vorgesehenen Vertiefungen einer 24-Loch-Platte und inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang in einem 37 °C warmen Inkubator mit befeuchteter Luft und 5 % CO2.

Fügen Sie dann weitere 450 Mikroliter der Matra-Gel-Medienmischung zu den Vertiefungen hinzu und inkubieren Sie weitere 60 Minuten. Während der zweiten Inkubation bereiten Sie eine 1:1-Suspension von Fibroblasten und epithelialen Zellen mit einer Konzentration von 0,5 × 10⁵ Zellen in jeweils 0,5 Milliliter H-me-Medium vor. Sobald die Matrigel-Medienmischung erstarrt ist, geben Sie die Zellsuspension vorsichtig auf die Oberfläche des Gels und kehren die Kultur für zwei Tage in den Inkubator zurück.

Ersetzen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, indem Sie das Medium sehr vorsichtig von der Seite der Vertiefung abpipettieren und es sanft durch frisches HEC-Medium ersetzen. Überwachen Sie täglich die Bildung der Sphäroide unter dem Mikroskop und nehmen Sie bei Bedarf Bilder mit Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie auf. Beginnen Sie damit, die Kultur mit einer sterilen 2-Milliliter-Glaspipette 10-mal auf- und abzupipettieren. Übertragen Sie anschließend die Kultur mit der Glaspipette in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 350 × g bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation sedimentiert der zelluläre Steroid am Boden des Röhrchens.

Entfernen Sie mit einer sterilen Pasteurpipettenspitze vorsichtig das aufgelöste Matrigel von der Oberfläche der Zentrifuge. Fügen Sie nun ein Milliliter H-Mac-Medium zum pelletierten Steroid hinzu, pipettieren Sie zwei bis drei Mal auf und ab mit einer sterilen 2-Milliliter-Glaspipette und überführen Sie die Kultur in eine Vertiefung einer 24-Loch-Gewebekulturplatte. Lassen Sie das Steroid mindestens 48 Stunden lang an die Schale anheften, bevor Sie das Medium wechseln.

Mit der Zeit verlassen die Zellen die Sphäroid-Struktur und wachsen als Monolayer. Wenn die Zellkulturen eine Konfluenz von 50 % erreicht haben, sollten sie gemäß einem Standardisierungsprotokoll in eine 35-Millimeter-Schale für zwei bis vier Tage überführt und anschließend in eine 100-Millimeter-Schale für drei bis fünf Tage weitergepasst werden, bevor die Zellen einer weiteren Analyse unterzogen werden. Verwenden Sie eine sterile Pasteurpipette, um das Medium abzusaugen, und entfernen Sie manuell so viele verbleibende Reste der Sphäroide wie möglich. In dreidimensionalen Sphäroid-Kokulturen induzieren Fibroblasten mit einer künstlich herbeigeführten Abschaltung von TM1, wie hier in den Abbildungen D, E und F gezeigt, eine stärkere Matrixinvasion durch epitheliale Gedächtniszellen im Vergleich zu Kontrollfibroblasten in den Abbildungen A, B und C. Beachten Sie die epithelialen Ausläufer, die in die Matrix eindringen, in Sphäroiden, die TM1-silentierte Fibroblasten enthalten, wie mit Pfeilen in den Abbildungen D und F markiert. Fibroblasten mit einer künstlich herbeigeführten Überexpression von TM1, wie hier in den Abbildungen J, K und L dargestellt, führen zu einer verminderten Invasion durch die Brustkrebszelllinie SUM159 im Vergleich zu Kontrollfibroblasten in den Abbildungen G, H und I. Vergleichen Sie das Fehlen epithelialer Ausläufer in Sphäroiden, die TM1-modifizierte Fibroblasten enthalten, mit jenen, die Kontrollfibroblasten enthalten, wie durch die Pfeile in den Abbildungen G und I angezeigt, sobald die Kokultur-Sphäroide etabliert sind.

Zellpopulationen können durch Umpflanzen in einen zweidimensionalen Kontext aus Steroiden isoliert werden. Dieses Bildkomposit zeigt Kulturen unter Licht- und Fluoreszenzmikroskopie nach ihrer Isolation aus der Matrigel-Kultur hier. Der Tag null steht für die Bildgebung unmittelbar nach der Isolation, die Tage eins, zwei und fünf bezeichnen die Tage nach der Isolation.

Beobachten Sie, wie sich der Zellkranz, der diesen Steroid verlässt, im Laufe der Zeit vergrößert. Schließlich bleibt ein „geisterhafter“ Steroid mit nur sehr wenigen Zellen zurück, wie hier durch den Pfeil hervorgehoben. Nach der Entfernung der Geistersteroide und einem Umpassieren verbleiben nur sehr wenige Steroide.

Abhängig von den relativen Wachstumsraten der getesteten Zellen können reine Populationen durch serielle Passage entstehen oder mithilfe geeigneter Zellmarker sortiert werden. In diesem Beispiel werden die Proben mittels Durchflusszytometrie analysiert, wobei grüne Fluoreszenz und rote Fluoreszenz verwendet werden, um GFP-exprimierende Fibroblasten bzw. mCherry-exprimierende epitheliale Zellen zu identifizieren, um so die relativen Anteile epithelialer Zellen und Fibroblasten zu bestimmen.

Nach der Isolierung aus der 3D-Kokultur behalten epitheliale Zellen die Eigenschaften, die ihnen die Kokultur mit Fibroblasten über längere Zeiträume vermittelt, wodurch umfassende Analysemöglichkeiten bestehen. In diesem Beispiel führte die Exposition gegenüber TM-one-defizienten Fibroblasten zu einer erhöhten Migration in kokultivierten H-max-Zellen, die wochenlang nach der Isolierung aus der 3D-Kokultur im Vergleich zur Exposition gegenüber Kontrollfibroblasten – hier als C gekennzeichnet – anhielt. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden, wie etwa Analysen von Veränderungen in der Genexpression und epigenetischen Markern, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Wirkung von Fibroblasten auf epitheliale Zellen zu beantworten.