Name: Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zell-Spheroid-Ko-Kulturen. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Fibroblasten-Effekten auf das epitheliale Zellverhalten.

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1. Einrichtung Dreidimensionale Co-Kulturen <ol><li> Am Tag vor Gründung der Co-Kulturen, entfernen Sie das Matrigel aus dem Gefrierschrank und tauen auf Eis in einem 4 ° C Kühlschrank über Nacht. </li><li> Am Tag des Experiments, herzustellen Weg für die Co-Kultur, die mit dem Weg für den Epithelzellen zu verwenden (HMEC Medium in diesem Beispiel entspricht: DME/F12 Medium mit 10% bovinem Kälberserum, 5 mg / ml Insulin , 1 pg / ml Hydrocortison, und 1 ng / ml EGF). Halten Sie das Medium auf Eis mindestens 1 Stunde vor dem Mischen mit Matrigel. </li><li> Um das aufgetaute Matrigel verdünnen, bestimmen die Gesamtzahl der gewünschten Menge an Matrigel: mittel (300 ul pro Well für 24-Well-Platten) und fügen Sie die Hälfte dieses Volumens an eiskaltem HMEC Medium in ein steriles Röhrchen auf Eis. Dann fügen Sie das gleiche halbe Gesamtvolumen von aufgetaute Matrigel an das Rohr, um eine 1:1-Verdünnung zu erreichen. Halten Sie das Röhrchen auf Eis. </li><li> Platz 50 &amp;mgr; l Matrigel: Medium-Gemisch Mitte auch nur in dafür vorgesehenen Vertiefungen einer 24-Well-Platte undInkubation für 10 min in einem 37 ° C Inkubator mit befeuchteten Luft und 5% CO 2. </li><li> Fügen Sie eine weitere 450 ul Matrigel: Medium-Gemisch in die Vertiefungen pipettieren und für weitere 60 Minuten. </li><li> Während der Inkubation Herstellung einer 1:1-Suspension von Fibroblasten (hier h-TERT-immortalisierten Reduktion Mammary Fibroblasten, die GFP) und Epithelzellen (hier h-TERT-immortalisierten humanen Mamma-Epithelzellen exprimiert, RFP) in einer Konzentration von 0,5 x 10 5 Zellen jeweils in 0,5 ml Medium HMEC. </li><li> Nach der 60-minütigen Inkubation Schritt leicht fallen die Zellsuspension auf der Oberseite des erstarrten Gel, und zurück in den Inkubator Kultur. </li><li> Bitte nicht stören, die Kulturen für 2 Tage. Danach kann jedes Medium geändert werden 2-3 Tage mit sehr sanft Ansaugen Medium von der Seite des gut und leicht ersetzt mit frischem Medium HMEC. </li><li> Überwachen Sphäroid Bildung täglich unter dem Mikroskop. Kulturen sind in der Regel nach 10-14 Tagen reifen. Bild alsgegebenenfalls unter Verwendung von Licht-oder Fluoreszenz-Mikroskopie. Spheroid Größe und Auskraglänge kann unter dem Lichtmikroskop gemessen werden. </li></ol> 2. Isolierung von Zellen aus Spheroid Co-Kulturen <ol><li> Sehr sanft, pipettieren die Kultur auf und ab 10x mit einer sterilen 2-ml Glaspipette. Alternativ schneiden Sie die Spitze eines 1000 Mikroliter Kunststoff-Pipettenspitze mit einer Schere durch Autoklavieren oder Eintauchen in 70% Ethanol sterilisiert, um die Kultur pipettieren. Übertragen der Kultur mit entweder dem Glas der Pipette oder Pipettenspitze geschnittener Kunststoff in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt und für 5 min bei 2000 rpm bei Raumtemperatur. Die zellulären Sphäroide wird Sediment am Boden. </li><li> Benutzen Sie einen sterilen Pasteurpipette Spitze zur schonenden Entfernung der gestörten Matrigel von der Spitze des zentrifugierten Röhrchen. </li><li> 1 ml Medium zu den HMEC pelletiert Sphäroide, und Abpipettieren 2-3 Mal mit einer sterilen 2 ml Glaspipette und übertragen der Kultur auf eine Mulde einer 24-WellGewebekulturplatte. </li><li> Lassen Sie die Sphäroide in die Schüssel für mindestens 48 Stunden vor Wert auf Wechsel des Mediums. Im Laufe der Zeit werden die Zellen verlassen die kugelige Strukturen und wachsen als Monolayer. </li><li> Passage der Zellkulturen, wenn die Zellen 50% Konfluenz erreichen. Erste Erweiterung der Kultur auf eine 35 mm-Schale (ca. 2-4 Tage), und dann zu einem 100 mm-Schale (ca. 3-5 Tage). Unmittelbar vor jedem Durchgang Schritt, verwenden Sie einen sterilen Pasteurpipette manuell so viele Rest-&quot;Ghost Sphäroiden&quot; wie möglich zu entfernen. </li><li> Analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie für Reinheit Bevölkerung mit geeigneten Zelloberflächenmarker und weiteren separaten unterschiedlichen Zellpopulationen durch Fluoreszenz-Zell-Sortierung, wenn nötig. Die isolierten Zellen sind nun für weitere Analysen bereit, wie gewünscht. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Im dreidimensionalen Sphäroid Co-Kulturen, induzieren Fibroblasten mit technisch TIAM1 Silencing erhöht Invasion in mATrix durch Brustepithelzellen (Abbildung 1, vergleichen D, E, F bis A, B, C). Fibroblasten mit entwickelt Überexpression von TIAM1 induzieren verringerte Matrix Invasion durch die Brustkrebs-Zelllinie SUM159 (Abbildung 1, zu vergleichen, J, K, L bis G, H, I). Sobald co-kultivierten Sphäroide eingerichtet worden sind, können Zellpopulationen aus Sphäroiden durch erneutes Plattieren in einer zweidimensionalen Rahmen isoliert werden, wie in 2 gezeigt. Je nach den relativen Wachstumsraten der Zellen getestet, kann reine Populationen durch serielle Passage entstehen (wie in Abbildung 3 dargestellt) oder können sortiert mit geeigneten Zell-Marker werden. Nach der Isolierung von 3D Co-Kultur behalten epithelialen Zellen die Eigenschaften von Co-Kultur mit Fibroblasten über längere Zeit übertragenen, so dass reichlich Gelegenheit zur Analyse. In diesem Beispiel induziert Exposition gegenüber TIAM1-defizienten Fibroblasten erhöhte Migration in co-kultivierten HMECs, die für Wochen es weiterhin eineach isoliert von 3D-Co-Kultur (Abbildung 4). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3760/3760fig1.jpg" /> Abbildung 1. Imaging etablierter Sphäroid Co-Kulturen unter Licht-und Fluoreszenzmikroskopie. Spheroid Kulturen werden mit Brustepithelzellen und Fibroblasten-Zelllinien etabliert und man ließ sie in der Kultur für 10-14 Tage wachsen. AF: = HMEC-epithelialen Zellen mCherry. GL: Epithelzellen = SUM159 mCherry-Zellen. AC, GI: = Fibroblasten Kontrolle RMF-GFP-Zellen. DF: Fibroblasten = RMF-GFP mit TIAM1 Silencing. JL: Fibroblasten = RMF-GFP mit TIAM1 Überexpression. Die Pfeile zeigen Epithelzapfen Invasion in Matrix. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3760/3760fig2.jpg" /> Abbildung 2. Serial-Bildgebung der Kulturen unter Licht-und Fluoreszenzmikroskopie nach Isolierung aus Matrigel Kultur. Tag 0 darstellt Bildgebung unmittelbar nach der Isolierung, den Tagen 1, 2 und5 zeigen Tage nach Isolation. Die Korona der Zellen aus dem Sphäroid mit der Zeit zunimmt. Schließlich ein &quot;Geist&quot; Sphäroid mit sehr wenigen Zellen bleibt (Pfeil). Nur sehr wenige Sphäroiden bleiben nach Entfernung Geist und erste Durchgang. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3760/3760fig3.jpg" /> 3. Durchflusszytometrie-Analyse von Zellen nach der Isolierung aus Matrigel Co-Kultur. Nach Sphäroids Co-Kulturen gereift sind, werden die Zellen aus dem 3D-Co-Kultur mit Pipettieren und serielle Passage isoliert. Beispiel Aliquote mittels Durchflusszytometrie analysiert (in diesem Beispiel mit grüner Fluoreszenz und rote Fluoreszenz zu identifizieren GFP-exprimierende Fibroblasten und mCherry-exprimierenden Epithelzellen jeweils), um den relativen Häufigkeiten der Epithel und Fibroblasten-Zellen zu bestimmen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3760/3760fig4.jpg" /> Abbildung 4. Transwell Migration von HMECs besteht, nachdem isolatiauf Matrigel von Co-Kultur. Sobald reine Populationen durch Kultur oder Fluoreszenz Zellsortierung gewonnen worden sein, können Zellen analysiert, wie gewünscht. Hier Migration von HMECs cokultiviert mit beiden Steuerkabel (C) oder TIAM1 schlecht (SHT) in Fibroblasten perforierten Transwells wurde nach 2, 4 und 8 Wochen nach der Isolierung aus Co-Kultur bewertet.

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100, 57-70 (2000).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).</li>
<li>Li, H., Fan, X., Houghton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment%3A+the+role+of+the+tumor+stroma+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer.</a> J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).</li>
<li>Tse, J. C., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+metastasis%3A+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+contribution+of+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment.</a> J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).</li>
<li>Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+in+fibroblasts+modulates+the+oncogenic+potential+of+adjacent+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia.</a> Science. 303, 848-851 (2004).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-stroma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Tumor-stroma interactions.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 15, 97-101 (2005).</li>
<li>Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+optimization+of+an+organotypic+assay+system+that+imitates+human+hair+follicle-like+epithelial-mesenchymal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions.</a> Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).</li>
<li>Kilani, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cytotoxicity+of+gemcitabine+in+bladder+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines.</a> Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).</li>
<li>Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fibroblast-tumor+cell+interaction+causes+downregulation+of+RACK1+mRNA+expression+in+breast+cancer+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro.</a> Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).</li>
<li>Silzle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+fibroblasts+recruit+blood+monocytes+into+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue.</a> Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).</li>
<li>Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+stimulus+of+lung+fibroblasts+on+lung+cancer+cells+is+impaired+by+the+receptor+for+advanced+glycation+end-products%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+fibroblasts+to+regulate+the+formation+of+three-dimensional+vessel-like+structures+from+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).</li>
<li>Liu, T., Lin, B., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinoma-associated+fibroblasts+promoted+tumor+spheroid+invasion+on+a+microfluidic+3D+co-culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device.</a> Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).</li>
<li>Zengel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+therapy+for+synergic+inhibition+of+tumour+cell+invasion+and+tumour-induced+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis.</a> BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterologous+3-D+coculture+model+of+breast+tumor+cells+and+fibroblasts+to+study+tumor-associated+fibroblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation.</a> Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).</li>
<li>Djordjevic, B., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+spheroids+maintained+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension.</a> Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).</li>
<li>Hirschhaeuser, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reexpression+of+the+TJ+protein+CLDN1+induces+apoptosis+in+breast+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids.</a> Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).</li>
<li>Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D%2C+tamoxifen+and+beta-estradiol+modulate+breast+cancer+cell+growth+and+interleukin-6+and+metalloproteinase-2+production+in+three-dimensional+co-cultures+of+tumor+cell+spheroids+with+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium.</a> Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).</li>
<li>Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+fibroblast+Tiam1+in+tumor+cell+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis.</a> Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier vorgestellte Methode stellt einen einfachen Ansatz zur Analyse der Auswirkungen von stromalen Fibroblasten auf Epithelzellen, einschließlich Tumorzellen. Es ermöglicht die direkte Zell-Zell-Wechselwirkung in einem dreidimensionalen Rahmen durch extrazelluläre Basalmembran-Matrix unterstützt und gleichzeitig einfachem Gewinnung der Zellen aus der Matrix für die weitere Analyse. Dies ist auf die Untersuchung von Tumor-assoziiertem Stroma angewendet werden, wie Fibroblasten-Linien manipulieren kann, um die Signalw...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> BD Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356237 </td><td> Phenolrot-frei </td></tr><tr><td> Hyclone klassischen flüssigen Medium: DMEM F12 </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30023.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone Rinderkalbserum </td><td> ThermoScientific </td><td> SH3007303 </td><td></td></tr><tr><td> Insulin </td><td> EMD Chemicals </td><td> 407709 </td><td> Man löst in 0.005N HCl; 0,22 um Filter </td></tr><tr><td> Hydrocortison </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4001 </td><td> Man löst in 50% EtOH; 0,22 um Filter </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9644 </td><td> Man löst in 10 mM Essigsäure, 0,22 um Filter </td></tr></tbody></table>

isolierung von brustepithelzellen aus dreidimensionalen mixed-zelle spheroid co-kultur

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Während die enormen Anstrengungen haben sich identifizieren Signalwege und Moleküle in normalen und malignen Zelle Verhaltensweisen 1-2, einen Großteil dieser Arbeit geleistet worden ist mit klassischen zweidimensionalen Zellkultur-Modellen, die für eine einfache Handhabung ermöglichen Zelle beteiligt sind verschwunden. Es ist deutlich geworden, dass intrazelluläre Signalwege durch extrazelluläre Kräfte, einschließlich der Dimensionalität und Zelle Oberflächenspannung 4.3 sind betroffen. Mehrere Ansätze wurden ergriffen, um dreidimensionale Modelle zu entwickeln, dass mehr genau darstellen biologische Gewebe-Architektur 3. Während diese Modelle verfügen über Multi-Dimensionalität und architektonischen betont, ist der Studie die resultierenden Auswirkungen auf Zellen weniger leicht als in zweidimensionalen Zellkultur aufgrund der Einschränkungen der Modelle und der Schwierigkeiten bei der Gewinnung von Zellen für die anschließende Analyse. Die wichtige Rolle der Mikroumgebung um Tumoren in der Tumorgenese und Tumor-Verhalten is zunehmend erkannt 4. Tumor-Stroma besteht aus mehreren Zelltypen und extrazellulären Molekülen zusammengesetzt. Während der Tumor-Entwicklung gibt es bidirektionale Signale zwischen Tumorzellen und Stromazellen 5. Obwohl einige Faktoren, die an Tumor-Stroma-Co-Evolution identifiziert wurden, gibt es immer noch ein Bedarf an einfachen Techniken systematisch zu identifizieren und untersuchen die volle Palette von diesen Signalen 6 zu entwickeln. Fibroblasten sind die am häufigsten vorkommende Zelltyp im normalen oder Tumor-assoziierten Stroma-Gewebe, und tragen zur Abscheidung und Wartung der Basalmembran und parakrine Wachstumsfaktoren 7. Viele Gruppen haben dreidimensionale Kultur-Systemen verwendet werden, um die Rolle der Fibroblasten auf verschiedenen zellulären Funktionen, einschließlich Ansprechen des Tumors auf Therapien, Rekrutierung von Immunzellen, Signalmolekülen, Proliferation, Apoptose, Angiogenese und Invasion 8-15 studieren. Wir haben eine einfache Methode zum Arsch optimiertEsser die Auswirkungen von Mamma-Fibroblasten auf Milchdrüsenepithelzellen Verwendung eines kommerziell erhältlichen extrazellulären Matrix Modell dreidimensionalen Kulturen von gemischten Zellpopulationen (Co-Kulturen) 16-22 erstellen. Mit weiterem Co-Kultur wurden die Zellen bilden Sphäroide mit dem Fibroblasten-Clustering im Inneren und die Epithelzellen überwiegend auf der Außenseite der Sphäroide und Bilden mehrzelligen Vorsprünge in die Matrix. Die Manipulation der Fibroblasten, die zu veränderten Epithelzellen führt Invasivität kann leicht durch Änderungen in Zahlen und Länge der epithelialen Vorsprünge 23 quantifiziert werden. Darüber hinaus haben wir ein Verfahren zur Isolierung von Epithelzellen aus der dreidimensionalen Co-Kultur, die Analyse der Auswirkungen von Fibroblasten-Exposition auf epithelialen Verhalten ermöglicht entwickelt. Wir haben gefunden, dass die Wirkungen der Co-Kultur für Wochen noch nach Epithelzelle Isolation ermöglicht ausreichend Zeit, um mehrere Tests durchzuführen. Diese Verfahren ist an Zellenunterschiedlichen malignen Potential und benötigt keine spezielle Ausrüstung. Diese Technik ermöglicht eine schnelle Auswertung der In-vitro-Zell-Modelle unter mehreren Bedingungen, und die entsprechenden Ergebnisse können in in vivo Modellen tierischem Gewebe sowie menschlichen Gewebeproben verglichen werden.

Eine einfache Methode ist für die Analyse von Auswirkungen von Fibroblasten aus dem Bindegewebe auf verbundene Epithelzellen beschrieben. Die Kombination dieser Verfahren und dreidimensionalen Gewebekultur Analyse von Zellen nach der Isolierung aus 3D zu erleichtern. Die Technik ist für Zellen unterschiedlicher maligne Potential, so dass systematische Untersuchung der Wirkungen von Tumor-assoziiertem Stroma auf Tumorzellen.

Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

Während enorme Anstrengungen in die Identifizierung von Signalwegen und Molekülen geflossen sind, die an normalen und malignen Zellverhaltensweisen beteiligt sind1-2, ist ein Großteil dieser Arbeit ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, epitheliale Zellen aus dreidimensionalen gemischten Zellgewebekulturen zu gewinnen, um die Auswirkungen von stromalen Fibroblasten auf die Biologie epithelialer Zellen zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst dreidimensionale gemischte Zell-Steroid-Kokulturen etabliert werden. Anschließend werden die Sphäroide von der Matrixkultur getrennt, um die epithelialen Zellen nach der Kokultur zu isolieren.Der nächste Schritt besteht darin, die epithelialen Zellen nach der Co-Kultur so lange zu passagieren, bis sie zur Analyse bereitstehen. Letztendlich können die Auswirkungen der Exposition gegenüber Fibroblasten in der dreidimensionalen Kultur auf das Verhalten epithelialer Zellen durch mikroskopische Bildgebung der Kulturen und Analyse nach der Co-Kultur bewertet werden. Epitheliale Zellen, beispielsweise im Hinblick auf die Fluoreszenzbildgebung der Matrixinvasion und die Transwell-Migration, wie hier gezeigt, werden von Quin, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Labor, demonstriert, am Tag vor der Einrichtung der Co-Kulturen.Entfernen Sie das Matre-Gel aus der Gefriertruhe und tauen Sie es über Nacht in einem

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Forschung

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Biology

Biologie

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Unter Verwendung menschlicher primärer Prostataepithelzellen berichten wir über eine neuartige biomarkerfreie Methode der funktionellen Charakterisierung von stammähnlichen Zellen durch einen sphäroidbasierten Labelretentionstest. Für die Beschriftung von BrdU-, CFSE- oder Far Red 2D-Zellen wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll beschrieben. dreidimensionale Sphäroidbildung; kennzeichnungserhaltende stammähnliche Zellidentifikation durch Immunzytochemie; isolierung durch FACS.

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Die Brustdrüse ist eine zweischichtige Struktur, die äußere myoepitheliale und innere luminale Epithelzellen umfasst. Präsentiert ist ein Protokoll zur Vorbereitung von Organoiden mit Differential-Trypsinisierung. Diese effiziente Methode ermöglicht es Forschern, diese beiden Zelltypen getrennt zu manipulieren, um Fragen über ihre Rolle in der Form und Funktion der Brustdrüse zu untersuchen.

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Die vorliegende Studie berichtet über ein einfacheres, zeitsparendes und wirtschaftliches Protokoll zur effizienten Isolierung und Züchtung von primären humanen Brustepithelzellen (HMECs) aus kleinen Mengen von Brustgewebe. Dieses Protokoll eignet sich für die schnelle Herstellung von primären HMECs sowohl für Labor- als auch für klinische Anwendungen.

Isolierung und Kultivierung primärer humaner Brustepithelzellen

Es besteht ein dringender Bedarf an 3D-Krebsmodellen, die heterozelluläre Wechselwirkungen erfassen, um Krebsmetastasen zu untersuchen. Unsere Studie stellt die Erzeugung von heteromultizellulären Stroma-Epithel-Epithelen in einer gerüstfreien und gerüstfreien Umgebung vor, die zur Untersuchung der Invasion und der zellulären räumlichen Verteilungen verwendet werden kann.

Heteromultizelluläre Stromazellen in gerüstfreien 3D-Kulturen von Epithelkarzinomzellen treiben die Invasion voran

Lernen Sie die Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zell-Spheroid-Ko-Kulturen. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Fibroblasten-Effekten auf das epitheliale Zellverhalten.

Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

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