Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

Eine einfache Methode ist für die Analyse von Auswirkungen von Fibroblasten aus dem Bindegewebe auf verbundene Epithelzellen beschrieben. Die Kombination dieser Verfahren und dreidimensionalen Gewebekultur Analyse von Zellen nach der Isolierung aus 3D zu erleichtern. Die Technik ist für Zellen unterschiedlicher maligne Potential, so dass systematische Untersuchung der Wirkungen von Tumor-assoziiertem Stroma auf Tumorzellen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Epithelzellen aus dreidimensionalen Mischzellgewebekulturen abzuleiten, um die Auswirkungen von Stromafibroblasten auf die Epithelzellbiologie zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst dreidimensionale gemischtzellige Steroid-Cokulturen etabliert werden. Die Sphe werden dann von der Matrixkultur getrennt, um die Epithelzellen nach der Co-Kultur zu isolieren.

Der nächste Schritt besteht darin, die Epithelzellen nach der Co-Kultur zu passieren, bis sie für die Analyse bereit sind. Letztendlich können die Auswirkungen der Exposition gegenüber Fibroblasten in dreidimensionalen Kulturen auf das Verhalten von Epithelzellen durch mikroskopische Bildgebung der Kulturen und Analyse der Post-Co-Kultur bewertet werden. Epithelzellen, wie z.B. die Fluoreszenzbildgebung der Matrixinvasion und Transwell-Migration, wie hier gezeigt, wird das Verfahren von Quin, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Labor am Vortag, bei der Etablierung der Co-Kulturen demonstriert.

Nehmen Sie das Matre-Gel aus dem Gefrierschrank und tauen Sie es über Nacht im Kühlschrank bei vier Grad Celsius auf Eis auf. Legen Sie das Nährmedium am Tag des Experiments mindestens eine Stunde vor dem Mischen mit dem Matra-Gel auf Eis. Zum Verdünnen des aufgetauten Matra-Gels.

Geben Sie die Hälfte des für die Co-Kultur erforderlichen Volumens eiskaltes H Mac Medium in ein steriles Röhrchen auf Eis. Geben Sie dann das gleiche halbe Gesamtvolumen an aufgetautem Matrigel in das Röhrchen, um eine Eins-zu-Eins-Verdünnung zu erreichen, wobei das Röhrchen auf Eis bleibt. Als nächstes werden 50 Mikroliter Matra-Gel-Medium-Mischung in die dafür vorgesehenen Vertiefungen einer 24-Well-Platte gegeben und die Platte in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit befeuchteter Luft und 5 % CO2 10 Minuten lang inkubiert.

Geben Sie dann weitere 450 Mikroliter Matra-Gel-Medienmischung in die Vertiefungen und inkubieren Sie weitere 60 Minuten. Während der zweiten Inkubation wird eine Eins-zu-Eins-Suspension von Fibroblasten und Epithelzellen in einer Konzentration von 0,5 mal 10 bis den fünften Zellen in je 0,5 Milliliter Hme-Medium hergestellt. Wenn sich die Matrigel-Mediummischung verfestigt hat, lassen Sie die Zellsuspension vorsichtig auf die Oberseite des Gels fallen und stellen Sie die Kultur für zwei Tage in den Inkubator zurück.

Wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, indem Sie das Medium sehr vorsichtig von der Seite der Vertiefung ansaugen und es täglich vorsichtig durch frische Sphäroidbildung des HEC-Mediummonitors unter dem Mikroskop ersetzen, je nach Bedarf mit Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie. Beginnen Sie damit, die Kultur 10 Mal mit einer sterilen Zwei-Milliliter-Glaspipette auf und ab zu pipettieren. Übertragen Sie dann die Kultur mit der Glaspipette in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 350-facher G-Temperatur bei Raumtemperatur, nach dem Zentrifugieren sedimentiert das zelluläre Steroid am Boden des Röhrchens.

Verwenden Sie eine sterile Weidepipettenspitze, um das zerbrochene Matra-Gel vorsichtig von der Oberseite der Zentrifuge zu entfernen. Präparat. Geben Sie nun einen Milliliter H mac Medium in die pelletierte Steroidpipette, gehen Sie mit einer sterilen Zwei-Milliliter-Glaspipette zwei- bis dreimal auf und ab und überführen Sie die Kultur in eine Vertiefung in einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Lassen Sie das Steroid mindestens 48 Stunden lang an der Schale haften, bevor Sie das Medium wechseln.

Im Laufe der Zeit verlassen die Zellen die Sphealstruktur und wachsen als Monoschichten, nachdem die Zellkulturen 50 % Konfluenz erreicht haben. Sie durchlaufen sie unter Verwendung eines Standardisierungsprotokolls für zwei bis vier Tage in eine 35-Millimeter-Schale und dann für drei bis fünf Tage in eine 100-Millimeter-Schale, bevor die Zellen weiter analysiert werden. Verwenden Sie eine sterile Weidepipette, um das Medium abzusaugen, und entfernen Sie dann manuell so viele verbleibende Geister-Sphäroide wie möglich. In dreidimensionalen sphäroiden Co-Kulturen induzieren Fibroblasten mit manipuliertem TM one Silencing, wie hier in den Abbildungen d, E und F gezeigt, eine erhöhte Matrixinvasion durch Gedächtnisepithelzellen im Vergleich zu den Kontrollfibroblasten in den Abbildungen A, B und C. Beachten Sie, dass die epithelialen Projektionen, die in die Matrix in Sphäroide eindringen, die TM one enthalten, die Fibroblasten zum Schweigen bringen, wie mit Pfeilen in den Abbildungen D und F dargestellt, Fibroblasten mit manipulierter Überexpression von TM eins hier gezeigt in den Abbildungen JK und L induzierten eine verminderte Invasion durch die Brustkrebszelllinie Summe 1 59 im Vergleich zu Kontrollfibroblasten in den Abbildungen GH und I vergleichen das Fehlen von Epithelprojektionen bei Steroiden, die TM one manipulierte Fibroblasten enthalten, mit denen, die Kontrollfibroblasten enthalten, die durch die Pfeile in den Abbildungen G und i angezeigt werden, sobald Co-Kultursteroide etabliert wurden.

Zellpopulationen können aus Steroiden isoliert werden, indem sie in einem zweidimensionalen Kontext neu beschichtet werden. Dieses Bildkomposit zeigt Kulturen unter Licht- und Fluoreszenzmikroskopie nach ihrer Isolierung aus der Matrigelkultur. Tag Null stellt die Bildgebung unmittelbar nach der Isolation dar, die Tage eins, zwei und fünf geben Tage nach der Isolation an.

Beachten Sie, wie die Korona der Zellen, die dieses Steroid verlassen, mit der Zeit zunimmt. Schließlich bleibt ein Geistersteroid mit sehr wenigen Zellen übrig, wie hier durch den Pfeil hervorgehoben. Sehr wenige Steroide bleiben nach der Geisterentfernung und einer Passage übrig.

Abhängig von den relativen Wachstumsraten der getesteten Zellen. Reine Populationen können durch serielle Passage entstehen oder mit geeigneten Zellmarkern sortiert werden. Die Probenwatt werden in diesem Beispiel durch Durchflusszytometrie analysiert, wobei grüne Fluoreszenz und rote Fluoreszenz verwendet werden, um GFP-exprimierende Fibroblasten bzw. mCherry-exprimierende Epithelzellen zu identifizieren, um relative Populationen von Epithel- und Fibroblastenzellen zu bestimmen.

Nach der Isolierung aus 3D-Co-Kultur behalten Epithelzellen über längere Zeiträume die Eigenschaften bei, die durch die Co-Kultur mit Fibroblasten verliehen werden, was reichlich Gelegenheit zur Analyse bietet. In diesem Beispiel induzierte die Exposition gegenüber TM-1-defizienten Fibroblasten eine erhöhte Migration in kokultiviertem H max, die wochenlang nach der Isolierung aus der 3D-Co-Kultur anhielt, verglichen mit der Exposition gegenüber Kontrollfibroblasten, die hier als C gekennzeichnet sind. Nach diesem Verfahren wurde ein erhöhtes Migrationssystem induziert. Andere Methoden, wie z.B. zur Analyse von Veränderungen der Genexpression und epigenetischer Markierungen, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Auswirkungen von Fibroblasten auf Epithelzellen zu beantworten.