Name: Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung quieszenter Stammzellen aus 3D-Sphäroidkulturen mittels biomarkerfreier Label-Retention-Assay. Diese Methode ermöglicht die FACS-basierte Trennung lebender Stammzellen von Tochterprogenitorzellen für die Prostatakrebsforschung.

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Diese Studie wurde durch Stipendien des National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH) unterstützt. Wir danken dem Flow Cytometry Core an der University of Illinois in Chicago für die Unterstützung bei der Zellsortierung.

Alle Zellhandhabungs- und Medienpräparate sollten mit aseptischer Technik in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II (BSC) durchgeführt werden.
1. Kultur und Pflege von HPrEC-Zellen in 2D
<ol><li>100 mm Kulturgerichte mit 2 ml 2,5 g/cm2 Fibronectinlösung über Nacht bei Raumtemperatur (RT) beschichten. Die Lösung ansaugen und die Kulturgerichte im BSC 45 min lufttrocknen lassen. Fibronectin-beschichtete Kulturgerichte können 2–4 Wochen bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Fügen Sie 9 ml des Prostataepithelzellwachstumsmediums (z.B. PrEGM) zu einer fibronectinbeschichteten 100-mm-Kulturschale hinzu und halten Sie die Schale in einemCO2-Inkubator bei 37 °C warm.</li>
	<li>Eine Durchstechflasche mit gefrorenen HPrEC-Zellen (2 x 105/ml) in einem 37 °C-Wasserbad auftauen und die Zellen in 10 ml warmem Medium wieder aufhängen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 x g für 5 min bei RT. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Die Zellen in 1 ml des warmen Kulturmediums gründlich wieder aussetzen. Samenzellen durch Pipettieren von 1 ml der Zellsuspension direkt in die fibronectinbeschichtete 100 mm Kulturschale, die 9 ml des vorgewärmten Mediums enthält (Gesamtvolumen von Medium und Zellen beträgt 10 ml). Kulturgerichte bei 37 °C wieder in einen CO2-Inkubator geben.</li>
	<li>Füllen Sie das Medium alle 2 Tage auf. Um dies zu tun, sorgfältig alle Medien aspirieren und fügen Sie 10 ml frisches warmes Medium.</li>
	<li>Stellen Sie in ca. 5 Tagen sicher, dass die Kulturen zu 70–80 % konfluent sind. Führen Sie die enzymatische Verdauung durch Inkubation der Zellen mit 3 ml 0,05% Trypsin/EDTA bei 37 °C für 5 min.</li>
	<li>Beenden Sie die Verdauung, indem Sie 3 ml warme PBS mit 10% FBS hinzufügen.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellen in einem 50 ml Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 500 x g für 5 min bei RT. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Das Zellpellet in 30 ml warmem Medium aufhängen und gleichmäßig in drei neue fibronectinbeschichtete 100-mm-Kulturgerichte für den nächsten Durchgang geben. HINWEIS: Primäre HPrEC-Zellen können 3–5x durchgesiedelt werden, ohne ihre Basalepithelzelleigenschaften zu verändern. Epitheliale Phänotyp wird durch Ausdrücke der basalen Epithelzellmarker Cytokeratin 5 und p63 mit Immunozytochemie/Immunfluoreszenz (ICC/IF) Assays getestet.</li>
</ol>2. Etikettierung von HPrEC mit BrdU-, CFSE- oder Far Red-Pro-Farbstoffen
HINWEIS: Die Zellen können entweder mit Schritt 2.1 oder Schritt 2.2 fortfahren, gefolgt von der Übertragung in die 3D-Prostasphärenkultur, wie in Schritt 3.1 beschrieben.
<ol><li>
Einzelbeschriftung von Zellen mit BrdU
	<ol>
<li>Kultur 2 x 105 HPrEC-Zellen in fibronectinbeschichteten 100-mm-Kulturgerichten mit 10 ml warmem Medium mit 1 'M BrdU. Kultur die Zellen für 10 Tage (über zwei Passagen), um die Kennzeichnung aller Zellen einschließlich Prostatastamm und Vorläuferzellen zu gewährleisten.</li>
		<li>Nach 10 Tagen das PrEGM-Medium, das die BrdU enthält, sorgfältig ansaugen und die Zellen mit 5 ml warmem PBS waschen. Wiederholen Sie 1x.</li>
		<li>Führen Sie die enzymatische Verdauung mit 0,05% Trypsin/EDTA durch, wie in den Schritten 1.7–1.8 beschrieben. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei RT. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Setzen Sie die BrdU-markierten Pelletzellen (5 x 104) in 500 l eiskalte (1:1) Kellermembranmatrix/-medium aus und übertragen Sie sie 5 Tage lang in eine 3D-Prostasphärenkultur (beschrieben in Schritt 3.1), um brdU-Auswaschen während der Sphäroidbildung zu ermöglichen (ca. 6 Zellzyklen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Doppelte Kennzeichnung von Zellen mit BrdU und CFSE oder Far Red Pro-Farbstoffen
	<ol>
<li>Wenn eine Co-Etikettierung für lebende Zellen gewünscht ist, nehmen Sie voretikettierte Zellen, die mit BrdU bebrütet werden, für 10 Tage ab Schritt 2.1 und co-label mit 5 'M CFSE oder Far Red Live Cell fluorescent pro-dyes für 30 min. Führen Sie die Co-Labeling an Tag 10 durch.</li>
		<li>Das Medium, das BrdU und CFSE oder Far Red Pro-Farbstoffe enthält, vorsichtig ansaugen. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml warmem PBS. Wiederholen Sie die Wäsche 1x.</li>
		<li>Führen Sie die enzymatische Verdauung mit 0,05% Trypsin/EDTA durch, wie in den Schritten 1.7–1.8 beschrieben. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei RT. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Setzen Sie die ko-markierten Zellen (5 x 104) in 500 l eiskalte (1:1) Kellermembranmatrix/-medium aus und übertragen Sie sie für 5 Tage in eine 3D-Prostasphärenkultur (siehe Abschnitt 3.1), um BrdU und CFSE oder Far Red während der Sphäroidbildung (6 Zellzyklen) zu ermöglichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die Detektion von etikettenerhaltenden Zellen in Kugeln (Tag 5 Prostasphären) durch, wie in den Schritten 4.1, 4.2, 4.3 oder 5 beschrieben. HINWEIS: Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFSE) und Far Red sind langlebige fluoreszierende Profarbstoffe und werden in den markierten Zellen gut zurückgehalten. Intrazelluläre Esterase in lebenden Zellen spalten die Acetatgruppen, die die grünen oder roten fluoreszierenden Moleküle aktivieren, die jetzt membranimpermeant sind.</li>
</ol>3. Prostasphärenbildung im 3D-Kellermembrankultursystem
<ol><li>
Prostasphärenkultur im 3D-Kellermembranmatrixsystem
	<ol>
<li>Die Kellermembranmatrix über Nacht bei 4 °C auftauen und vor Gebrauch auf Eis halten.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml eiskalte Kellermembranmatrix vorsichtig in ein gleiches Volumen des eiskalten Kulturmediums ein. Langsam mischen, indem Sie nach oben und unten, Vermeidung von Blasen. ANMERKUNG: Beschichten Sie den Boden von 12 Brunnenplattenbrunnen mit 100 l dieser Lösung vor. Dadurch wird die Anzahl der Zellen minimiert, die durch die Matrix fallen und als Monolayer wachsen.</li>
		<li>5 x 104 HPrEC-Zellen in eiskalter (1:1) Kellermembranmatrix/Kulturmittelmischung in einem Gesamtvolumen von 500 l resuspendieren.</li>
		<li>Pipette 500 l dieser Zelllösung um den unteren Rand jedes Brunnens.</li>
		<li>Wirbeln Sie die Platte, um die Mischung gleichmäßig um den Rand des Brunnens zu verteilen. Legen Sie die Platte 30 min in einen CO2-Inkubator bei 37 °C, damit sich die Matrix erstarren lässt.</li>
		<li>Sobald sich die Matrix verfestigt hat, decken Sie mit 1 ml warmem Kulturmedium pro Brunnen ab. Stören Sie den Kellermembran-Matrixring nicht. Zielen Sie vorsichtig auf die Pipettenspitze und geben Sie das Kulturmedium in die Mitte des Brunnens. HINWEIS: Das Kulturmedium muss auf 37 °C erwärmt werden, wenn es der erstarrten Kellermembranmatrix hinzugefügt wird. Die Kellermembranmatrix verliert ihre Integrität und löst sich auf, wenn sie kalten/kühlen Medien ausgesetzt ist.</li>
		<li>Auffüllen Medium alle 2 Tage. Saugen Sie vorsichtig 500 L des verbrauchten Mediums an und fügen Sie 500 l frisches warmes Kulturmedium hinzu.</li>
		<li>Überwachen Sie die Prostasphärenbildung und das Wachstum für 5–7 Tage mit einem invertierten Mikroskop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passage von Prostasphären
	<ol>
<li>Ernte Prostasphären aus der Matrix, indem sie so viel Medien wie möglich sorgfältig absaugt. Vermeiden Sie es, schwimmende Teile der erstarrten Matrix zu stören oder aufzusammeln.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml Dispase-Lösung hinzu (Kellermembranmatrix:Dispase im Verhältnis 1:2). Mischen Sie gründlich durch Pipettieren nach oben und unten mehrmals.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Kulturplatten in einemCO2-Inkubator bei 37 °C für 30 min.</li>
		<li>Nehmen Sie Bilder von Prostasphären, die am unteren Ende des Kulturgerichts für Kugelzahlenzählung und Größenmessungen sind.</li>
		<li>Sammeln Sie das Kugelgemisch in ein 15 ml Rohr. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 500 x g für 5 min bei RT, um die Kugeln zu pellet. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Dispergieren Sie die Kugeln in einzelne Zellen, indem Sie mit 500 l warmem 0,05% Trypsin/EDTA verdauen und die Suspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen.</li>
		<li>Inkubieren Sie das Mikrozentrifugenrohr in einemCO2-Inkubator bei 37 °C für 5 min.</li>
		<li>Beenden Sie die Trypsin-Aktion mit 500 l warmen PBS, die 10% FBS enthalten. Passieren Sie die verdaute Kugelsuspension durch eine 1 ml Spritze mit einer 26 G Nadel 5x, um die Kugeln in einzelne Zellen zu dissoziieren.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Suspension bei 500 x g für 5 min, um die Zellen bei RT zu pellet. Den Überstand ansaugen und entsorgen.</li>
		<li>Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml warmes Kulturmedium wieder auf und filtern Sie es durch ein 40 m porengroßes Nylonzellsieb.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 x g für 5 min, um die Zellen bei RT zu pellet. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml eiskalter (1:1) Kellermembranmatrix/Kulturmedium und Subkultur in einer 3D-Kellermembranmatrix für den zweiten Durchgang der Prostasphäre wieder auf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Identifizierung von BrdU-erhaltenden Prostatastammzellen durch immunfluoreszierende Färbung
<ol><li>Outgrow die angeschlossenen Prostasphären gefolgt von Immunfluoreszenz (IF) Färbung für Prostata-Stammzell 2D-Bildgebung.
	<ol>
<li>Ernte prostasphärend durch Dispase-Verdauung, wie in den Schritten 3.2.1–3.2.3 beschrieben. Zentrifugieren Sie die Kugeln in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr bei 500 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Resuspend Kugeln in 1 ml warmen Kulturmedium.</li>
		<li>In einem 37 °C-Inkubator über Nacht in einem 37 °C-Inkubator 50 Prostasphären pro Brunnen pro Brunnen in 8 Brunnenkammerrutschen in 200 L Kulturmedium inkubieren, um das An- und Auswachsen von Kugeln zu ermöglichen.</li>
		<li>An Tag 2 das Kulturmedium ansaugen und verwerfen. Waschen Sie die ausgewachsenen Kugeln mit 200 l PBS für 5 min.</li>
		<li>Fixieren Sie die Kugeln in 200 l/Well von eiskaltem Methanol bei -20 °C für 20 min.</li>
		<li>Waschen Sie die Kugeln mit 200 L/Well von PBS für 5 min. Wiederholen Sie 2x.</li>
		<li>Säure-Waschkugeln mit 200 l/Well von 2N HCl für 30 min bei RT.</li>
		<li>Waschen Sie die Kugeln mit 200 L/Well von PBS für 5 min. Wiederholen Sie 3x.</li>
		<li>Fügen Sie 100 l Blockierlösung mit 5% normalem Ziegenserum in PBST (PBS mit 0,25% Triton X-100) hinzu und brüten 30 min bei RT.</li>
		<li>Apirieren Sie die Blockierlösung ab und fügen Sie jedem Brunnen 100 l PBST mit 2% normalem Ziegenserum und primärem Maus-Antihuman-BrdU-Antikörper (1:200) hinzu und in einer befeuchteten Box bei 4 °C über Nacht inkubieren. HINWEIS: Mouse IgG Antikörper wird als Negativkontrolle verwendet.</li>
		<li>Aspirieren und entfernen Sie die primäre Antikörperlösung. Waschen Sie die Kugeln mit 200 l PBS für 5 min. Wiederholen Sie 2x.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Bohrkörper 100 l PBST mit 2% normalem Ziegenserum und sekundärem Ziegenanti-Maus-Antikörper Alexa Fluor 488 (1: 500) hinzu und inkubieren Sie bei RT im Dunkeln 2 h.</li>
		<li>Aspirieren und entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung. Waschen Sie die Kugeln mit 200 l PBS für 5 min. 3x wiederholen.</li>
		<li>Montieren Sie die Dias mit einem wässrigen Montagemedium mit DAPI-Haltigem Montagemedium von 25-40 l.</li>
		<li>Erhalten Sie Bilder der gebeizten Kugeln/Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop und einer Farb-Digitalkamera.</li>
	</ol></li>
	<li>Ganze Mount IF Färbung von Prostasphären für Prostatastammzell 3D-Bildgebung HINWEIS: Für die gesamte Mount IF Färbung werden Prostasphären mit 1,5 ml Mikrozentrifugenrohren behandelt.<ol>
<li>Ernte der Prostasphären durch Dispase-Verdauung, wie in den Schritten 3.2.1–3.2.3 beschrieben. Zentrifugieren Sie die Kugeln in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr bei 500 x g für 5 min. Den Überstand ansaugen und entsorgen.</li>
		<li>Die Kugeln mit 1 ml 4% Paraformaldehyd bei RT für 20 min aufheben und fixieren. Zentrifugieren Sie die Kugeln bei 500 x g für 5 min. Den Überstand ansaugen und entsorgen.</li>
		<li>Waschen Sie die Kugeln, indem Sie das Pellet in 1 ml PBS wieder aufhängen. Zentrifugieren Sie die Kugeln bei 500 x g für 5 min. Den Überstand ansaugen und entsorgen. Wiederholen Sie 1x.</li>
		<li>Säure waschen Sie die Kugeln durch Wiederaufhängen des Pellets in 1 ml von 2N HCl für 30 min.</li>
		<li>Waschen Sie die Kugeln mit 1 ml PBS für 5 min und Zentrifuge bei 500 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und entsorgen. Wiederholen Sie 3x.</li>
		<li>15–30 Kugeln in 100 l Blockierlösung, die 5% normales Ziegenserum in PBST (PBS mit 0,25% Triton X-100) enthält, wieder aufhängen und 30 min bei RT inkubieren.</li>
		<li>Um die Blockierlösung zu entfernen, zentrieren Sie die Kugeln bei 500 x g für 5 min. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Setzen Sie die Kugeln in 100 l PBST mit 2% normalem Ziegenserum und primärem Maus-Antihuman-BrdU-Antikörper (1:200) wieder aus und inkubieren Sie sie bei 4 °C über Nacht.</li>
		<li>Waschen Sie die Kugeln, indem Sie das Pellet in 1 ml PBS wieder aufhängen. Zentrifugieren Sie die Kugeln bei 500 x g für 5 min. Den Überstand ansaugen und entsorgen. Wiederholen Sie 1x.</li>
		<li>Setzen Sie die Kugeln in 100 l PBST mit 2% normalem Ziegenserum und sekundärem Ziegenanti-Maus-Alexa Fluor 488-Antikörper (1:1.000) wieder aus und brüten bei RT für 2 h.</li>
		<li>Waschen Sie die Kugeln, indem Sie das Pellet in 1 ml PBS wieder aufhängen. Zentrifugieren Sie die Kugeln bei 500 x g für 5 min. Den Überstand ansaugen und entsorgen. Wiederholen Sie 1x.</li>
		<li>Setzen Sie die Kugeln in 30–50 l wässrigen Montagemediums, das DAPI enthält, wieder ab. Um eine Abflachung der Kugeln zu verhindern, geben Sie sie in eine gut erstellte 35 mm unbeschichtete Kulturschale mit einem Abdeckglasboden. Dann fügen Sie einen Coverslip zum Kulturgericht hinzu und decken den Brunnen ab.</li>
		<li>Erfassen Sie ganze Kugel Z-Stack-Bilder mit einem durchlichtelichten invertierten fluoreszierenden konfokalen Mikroskop. Konvertieren Sie diese Z-Stack-Bilder in 3D-Bilder mit einer Bildverarbeitungssoftware mit Freiform-Zeichnungsfunktionen. HINWEIS: Mouse IgG Antikörper wird als Negativkontrolle verwendet.</li>
	</ol></li>
	<li>Gepaart-Zell-Analyse (4-Tage-Protokoll)
	<ol>
<li>Kultur die BrdU-markierten Kugeln bis Tag 5.</li>
		<li>Tag 1: Ernten Sie die Kugeln aus einer Kellermembranmatrix mit 1 ml Dispase-Verdauung. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, wie in den Schritten 3.2.1–3.2.11 beschrieben, in einzelne Zellen verteilt.</li>
		<li>Setzen Sie die Zellen in 1 ml warmen Kulturmedium.</li>
		<li>Die dispergierten Einzelzellen (300–500 PRO Brunnen) in 8 Wellkammer-Dias und Kultur in 200 L/Well-Kultur-Medium über Nacht verätzen, um eine Befestigung zu ermöglichen.</li>
		<li>Tag 2: Ändern Sie das Kulturmedium mit 200 l von 2 'M Cytochalasin D im Kulturmedium und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C, um eine Zellteilung zu ermöglichen, die in der späten Metaphase zur Anaphase pausiert.</li>
		<li>Tag 3–4: Aspirieren und entsorgen Sie das Medium. Fixzellen in 200 L/Well von eiskaltem Methanol bei -20 °C für 20 min. Folgen Sie dem Immunstainierungsprotokoll für BrdU, wie in den Schritten 4.1.5–4.1.14 beschrieben.</li>
		<li>Nehmen Sie Bilder von gepaarten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop auf. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen den beiden Kernen weniger als 30 m beträgt. Identifizieren Sie die gepaarten Stammzellen anhand der BrdU-Retention als symmetrische oder asymmetrische Zellteilung. ANMERKUNG: BrdU-etikettenerhaltende Prostatastammzellen durchlaufen eine symmetrische Teilung, so dass zwei Tochterstammzellen eine gleiche Menge an BrdU behalten, während Stammzellen, die sich einer asymmetrischen Teilung unterziehen, dazu führen, dass eine Tochter-Stammzelle alle BrdU und die andere Tochter-Vorläuferzelle, die das BrdU-Label verloren hat.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Isolierung der CFSE-etikettenerhaltenden Prostatastammzellen durch FACS-Sortierung
<ol><li>Tag 5: Ernte die CFSE-markierten Tag 5 Prostasphären, die in 6 Brunnenkulturplatten in der 3D-Kultur wachsen, indem sie das Medium durch 2 ml Dispase ersetzen (Kellermembranmatrix: Dispase im Verhältnis 1:2). Pipette auf und ab mehrmals gründlich mischen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten in einem CO2-Inkubator bei 37 °C für 30 min, um die Matrix zu verdauen.</li>
	<li>Sammeln Sie das Kugelgemisch in ein 15 ml Zentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie die Kugeln bei 500 x g für 5 min bei RT. Aspirieren Sie den Überstand und entsorgen.</li>
	<li>Das Kugelpellet in 500 l warmem Trypsin/EDTA aussetzen und in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr geben.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Kugeln in einem CO2-Inkubator bei 37 °C für 5 min. Fügen Sie 500 l warme PBS mit 10% FBS hinzu.</li>
	<li>Passieren Sie die Kugeln durch eine 1 ml Spritze mit einer 26 G Nadel 5x, um die Kugeln vollständig in einzelne Zellen zu trennen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei RT. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Setzen Sie die Zellen in 1 ml warmem Kulturmedium, das 1 g/ml Propidiumjodid (PI) enthält, wieder ab, um abgestorbene Zellen zu färben. 1 min bei RT inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei RT. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Setzen Sie die Zellen in 1 ml warmen Kulturmedium. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei RT. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Setzen Sie die Zellen in 500 l warmes Kulturmedium wieder auf und sammeln Sie die Zellen in 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen, indem Sie sie durch 35-m-Poren-Zellen-Sieb-Snap-Caps filtern.</li>
	<li>Führen Sie die Analyse von Trypsin-dispergierten CFSE-markierten Prostasphärenzellen mit einem einkanaligen FACS-Analysator durch.</li>
	<li>Gate die Subpopulationen der fraktionierten CFSEHi, CFSEMedund CFSELo Zellen. Verwenden Sie die negativen und positiven Steuerelemente für gating. HINWEIS: Das Vorhandensein von FACS-sortierten CFSE-kennzeichnungserhaltenden Prostatastammzellen (siehe Hu et al.13) kann durch grüne Fluoreszenzmikroskopie und ihre größere Zellgröße im Vergleich zu nicht-erhaltenden Zellen bestätigt werden. Diese größere Zellgröße ist eine Eigenschaft von Prostatastammzellen relativ zu Vorläuferzellpopulationen. Dies kann bei anderen Gewebetypen anders sein.</li>
</ol>

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<li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).</li>
<li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-initiated+transformation+of+prostate+epithelium+derived+from+normal+human+prostate+stem-progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells.</a> Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).</li>
<li>Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+endocrine+disrupting+chemicals+on+human+prostate+stem%2Fprogenitor+cells+and+prostate+cancer+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Beziehungen zu offenbaren.

Die Durchflusszytometrie mit mehreren Stammzelloberflächenmarkern ist ein häufig verwendeter Ansatz für die Stammzellforschung, obwohl es an Spezifität und Selektivität1,5,6fehlt. Während die Sphäroidbildung in einem 3D-Kultursystem eine weitere nützliche Methode zur Anreicherung der seltenen Stammzellpopulation aus primären Epithelzellen, einschließlich HPrEC, ist, sind die resultierenden Sphäroide immer noch eine heterogene Mi...

Die menschliche Prostata enthält luminale Epithel mit sekretorische Funktion und Basalzellen, die ihm zusammen mit einer ungewöhnlichen neuroendokrinen Zellkomponente zugrunde liegen. Die Epithelzellen werden in diesem Fall aus einer seltenen Population von Prostatastammzellen erzeugt, die in vivo relativ still sind und als Reparatursystem fungieren, um die Drüsenhomöostase im Laufe des Lebens aufrecht zu erhalten1. Trotz vieler Fortschritte bleibt die Identifizierung und funktionelle Isolierung von Prostatastammzellen eine große Herausforderung auf dem Gebiet. Stammzell-Biomarker, einschließlich zelloberflächenmarkerbasierter Methoden in Kombination mit Durchflusszytometrie, werden häufig für die Stammzellforschung2,3,4verwendet. Die Ergebnisse für die Anreicherung und Isolierung variieren jedoch stark als Funktion von Markerkombinationen und Antikörperspezifität5,6, was Fragen über die Identität der isolierten Zellen aufwirft. Ein weiterer weit verbreiteter Ansatz zur stammartigen Zellanreicherung ist die dreidimensionale (3D) Sphäroidkultur2,3,4. Während ansässige Stammzellen in vivo mit Nischenbeschränkungen relativ still sind, durchlaufen sie eine Zellteilung in der 3D-Matrixkultur (sowohl symmetrisch als auch asymmetrisch) und erzeugen sowohl Stamm- als auch Vorläuferzellen, die sich schnell zur Abstammungsverpflichtung7,8vermehren. Die gebildeten Sphäroide sind eine heterogene Mischung, die sowohl Stammzellen als auch Vorläuferzellen in verschiedenen Stadien der Abstammungsverpflichtung enthält, einschließlich Früh- und Spätstadium-Vorläuferzellen. So sind Assays mit den gesamten Sphäroiden nicht stammzellexklusiv, was die Identifizierung einzigartiger Stammzelleigenschaften unschlüssig macht. Daher ist es wichtig, Assays zu erstellen, um Prostatastammzellen zu identifizieren und von ihren Tochtervorläufern zu trennen. Zu diesem Zweck besteht das Ziel des aktuellen Protokolls darin, ein Assay-System zu etablieren, das eine effiziente Identifizierung und Isolierung von Stammzellen aus menschlichen Prostatageweben ermöglicht, gefolgt von einer robusten nachgelagerten Analyse ihrer biologischen Funktionen.
Langfristige 5-Brom-2'-Deoxyuridin (BrdU) Etikettenretention ist weit verbreitet für in vivo und In-vitro-Lineage-Tracing von Stammzellen auf der Grundlage ihrer verlängerten Verdoppelungszeit9,10. Der aktuelle Ansatz zur Identifizierung und Isolierung von Prostatastammzellen basiert auf ihren relativen Ruhecharakteristik- und Beschriftungsretentionseigenschaften innerhalb einer gemischten Epithelpopulation. Darüber hinaus können auf der Grundlage der unsterblichen Strang-DNA-Hypothese nur Stammzellen asymmetrische Zellteilung durchlaufen. Die Stammzelle stellt die Tochterzelle dar, die die ältere elterliche DNA enthält, während die Vorläuferzelle, die eine engagierte Tochterzelle ist, die neu synthetisierte DNA empfängt. Die oben beschriebene einzigartige Stammzelleigenschaft wird genutzt, um brdU-Kennzeichnung enthoben Stammzellen in Primärkulturen durchzuführen und dann ihr Etikett nach BrdU-Waschung nach dem Transfer in die 3D-ankerfreie Sphäroidkultur nachzuverfolgen. Während die Mehrheit der primären Prostataepithelzellen einen basalen und transitverstärkenden Phänotyp in der 2D-Kultur behält, gibt es auch eine seltene Population von multipotenten Stammzellen, die die epitheliale Homöostase auffüllen und aufrechterhalten, wie die Bildung von Sphäroiden oder vollständig differenzierten Organoiden mit entsprechenden Kulturmedien beim Transfer auf 3D-Systeme3,12belegt. In unserem aktuellen Protokoll identifizieren wir durch die Verwendung von HPrEC Prostatasphäroiden oder prostasphärenbasierten BrdU-, CFSE- oder Far Red Retentionstests, gefolgt von fluoreszaktivierter Zellsortierung (FACS), etikettenhaltende Stammzellen in Sphäroiden auf einer Einzelzellebene13.
Wichtig ist, dass wir die Stammzelleigenschaften von etikettenerhaltenden Zellen in frühen Sphäroiden im Vergleich zu den Vorläuferzellen mit Lineage-Verpflichtung weiter bestätigt haben. Dazu gehören Stammzell asymmetrische Teilung, In-vitro-Sphäroid-Bildungsfähigkeit und In-vivo-Geweberegenerationsfähigkeit, erhöhte Autophagie-Aktivität, augmentierte Ribosome-Biogenese und verminderte metabolische Aktivität. Anschließend wurde die RNAseq-Analyse durchgeführt. Es wurden differenziell exprimierte Gene in etikettenerhaltenden Sphäroidzellen beobachtet, die als neuartige Biomarker für menschliche Prostatastammzellen dienen können. Dieser sphäroidbasierte Label-Retaining-Ansatz kann auf Krebsproben angewendet werden, um eine kleine Anzahl von krebsstammähnlichen Zellen zu identifizieren, wodurch translationale Möglichkeiten zur Verwaltung der therapeutischen resistenten Populationen13. Im Folgenden wird der prostasphärenbasierte Labelretentionstest am Beispiel menschlicher Primärprostataepithelzellen (HPrEC) vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Tuberkulinspritzen</td><td>Bectin Dickinson</td><td>BD 309625</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, sterile</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm Kulturschalen</td><td>Corning/Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Kulturplatte</td><td>Corning/Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Zentrifuge Röhrchen</td><td>Corning/Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm Deckgläser, sq</td><td>Corning</td><td>284522</td><td>Für MatTek 35 mm Kulturschale</td></tr><tr><td>24 x 50 mm</td><td>Deckgläser Corning</td><td>2975245</td><td></td></tr><tr><td>26G x 1,5 Zoll Injektionsnadel</td><td>Monoject</td><td>1188826112</td><td></td></tr><tr><td>2N HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Kulturschale mit Deckglasboden</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-10-C</td><td>Glasboden Nr. 0, unbeschichtet, <img src="/files/ftp_upload/60357/60357img1.jpg"> bestrahlt</td></tr><tr><td>40 &amp; Mikro; m Poren-Zellsieb aus Nylon</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5 % CO2-Kultur-Inkubator, 37 &gt; C</td><td>Forma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning/Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polystyrol Rundbodenröhrchen mit Siebschnappkappe</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>35 &amp; micro; m Nylonnetz</td></tr><tr><td>6-Well-Kulturplatten</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>8-Well-Objektträger</td><td>Millipore Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Wässriges Einbettmedium mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>A nuklearer Fluoreszenzfarbstoff</td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkstatt, Level 2 zertifiziert</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BrdU (5-Brom-2'-Desoxyuridin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002</td><td>1 mM Stammlösung in DMSO</td></tr><tr><td>Zentrifuge für 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge für 15 mL Röhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Allegra 6</td></tr><tr><td>CFSE (Carboxyfluorescein Succinimidylester)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td><td>5 mM Stammlösung in DMSO</td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>PHZ1063</tr><tr><td>Dispase 1U/mL</td><td>StemCell Technologies</td><td>07923</td><td></td></tr><tr><td>FACS CellSorter MoFlo XDP</td><td>Beckman Coulters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Far-Red Pro-Farbstoff</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34564</td><td>5 mM Stammlösung in DMSO</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>Zum Beschichten von 100 mm Kulturschalen</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop mit Farb-Digitalkamera</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Axioskop 20 Fluoreszenzmikroskop; Farb-Digitalmikroskop Axiocamera</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus-IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>HPrEC (Primäre normale menschliche Prostataepithelzellen)</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>FC-0038</td><td>Gepoolt von 3 jungen (19-21 Jahre alten) krankheitsfreien Organspendern; 1 x 105 Zellen/ml; gelagert in flüssigem</td></tr><tr><td>Stickstoff-Eiskübel und Eis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invertiertes Mikrosope mit Digitalkamera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, niedriger Wachstumsfaktor, phenolrotfrei</td><td>Corning</td><td>356239</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Corning</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-BrdU Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>5292S</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG Antikörper ( Santa</td> <td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten und Spitzen, verschiedene Größen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0041</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid (PI)</td><td>R &amp; D Systems</td><td>5135/10</td><td>10 μ g/mL PI in PBS gelagert bei 4 ° C im Dunkeln</td></tr><tr><td>Serologische Pipetten, verschiedene Größen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software für Kugelzählung und Größenmessungen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software: 3D-Bilder mit Imaris, einer Bildbearbeitungssoftware mit Freiform-Zeichenfunktionen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad, 37 &gt; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>z-Stapel-Bilder mit einem inversen Fluoreszenz-Konfokalmikroskop</td><td></td><td></td><td></td> mit Durchlicht</tr></tbody></table>

isolierung von stammzellen aus 3-dimensionalen sphäroidkulturen

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Trotz der Fortschritte in der adulten Stammzellforschung bleibt die Identifizierung und Isolierung von Stammzellen aus Gewebeproben eine große Herausforderung. Während ansässige Stammzellen mit Nischenbeschränkungen in erwachsenen Geweben relativ still sind, treten sie in einer ankerfreien dreidimensionalen (3D) Kultur in den Zellzyklus ein und durchlaufen sowohl eine symmetrische als auch eine asymmetrische Zellteilung, was sowohl Stamm als auch Vorläufer Zellen. Letztere vermehren sich schnell und sind die Hauptzellpopulation in verschiedenen Stadien der Abstammungsbindung, die heterogene Sphäroide bilden. Unter Verwendung der primären normalen menschlichen Prostataepithelzellen (HPrEC) wurde ein sphäroidbasierter, etikettenretentionsbezogener Assay entwickelt, der die Identifizierung und funktionelle Isolierung der sphäroid-initiierenden Stammzellen bei einer einzelzelligen Auflösung ermöglicht.
HPrEC oder Zelllinien werden mit BrdU für 10 Tage zweidimensional (2D) kultiviert, um ihre Aufnahme in die DNA aller teilenden Zellen, einschließlich selbsterneuernder Stammzellen, zu ermöglichen. Das Auswaschen beginnt mit der Übertragung in die 3D-Kultur für 5 Tage, in denen sich Stammzellen durch asymmetrische Teilung selbst erneuern und die Sphäroidbildung initiieren. Während relativ stille Tochterstammzellen BrdU-markierte Eltern-DNA behalten, vermehren sich die Tochtervorläufer schnell und verlieren das BrdU-Label. BrdU kann durch CFSE- oder Far Red Pro-Dyes ersetzt werden, die eine livee Stammzellisolierung durch FACS ermöglichen. Die Merkmale der Stammzellwerden werden durch in vitro sphäroide Bildung, In-vivo-Geweberegenerationstests und durch Dokumentation ihrer symmetrischen/asymmetrischen Zellteilungen bestätigt. Die isolierten, etikettenerhaltenden Stammzellen können durch nachgeschaltete molekulare und biologische Studien, einschließlich RNA-seq, ChIP-seq, Einzelzellerfassung, Metabolische Aktivität, Proteomprofilierung, Immunzytochemie, Organoidbildung und In-vivo-Geweberegeneration, streng abgefragt werden. Wichtig ist, dass dieser markerfreie funktionelle Stammzellisolationsansatz stammähnliche Zellen aus frischen Krebsproben und Krebszelllinien aus mehreren Organen identifiziert, was auf eine breite Anwendbarkeit hindeutet. Es kann verwendet werden, um Krebsstamm-ähnliche Zell-Biomarker zu identifizieren, Sieb-Arzneimittel, die auf Krebsstammzellen-ähnliche Zellen abzielen, und neue therapeutische Ziele bei Krebs zu entdecken.

Primäre normale menschliche Prostataepithelzellen werden in fibronectinbeschichtete Kulturgerichte gelegt und das Zellwachstum wird in der 2D-Kultur beibehalten (Abbildung 1a). Beim Transfer in die 3D-Kultur mit einer Kellermembranmatrix sterben differenzierte Epithelzellen langsam aus. Nur Prostatastammzellen können in einer ankerfreien Kultur überleben und in 5 Tagen Sphäroide bilden (Abbildung 1b).
<p class="jove_content"...

Unter Verwendung menschlicher primärer Prostataepithelzellen berichten wir über eine neuartige biomarkerfreie Methode der funktionellen Charakterisierung von stammähnlichen Zellen durch einen sphäroidbasierten Labelretentionstest. Für die Beschriftung von BrdU-, CFSE- oder Far Red 2D-Zellen wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll beschrieben. dreidimensionale Sphäroidbildung; kennzeichnungserhaltende stammähnliche Zellidentifikation durch Immunzytochemie; isolierung durch FACS.

Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Die Stammzellisolation bleibt eine große Herausforderung durch die Ko-Isolation von Vorläuferzellen mit aktuellen Methoden. Wir haben einen neuartigen biomarkerfreien Assay entwickelt, um ruhende Stammzellen von gemischten Vorläufern zu isolieren. Der Hauptvorteil dieses sphäroidbasierten, Etikettenretentions-Assays, es kann lebende Stammzellen von ihren Tochtervorläufern durch FACS mit CFSE- oder Far Red-Etikettierung erweitern und isolieren.Während konventionelle Therapien die meisten Prostatakrebszellen ausrotten, bleiben Krebsstammzellen aufgrund therapeutischer Resistenz enden, was das Fortschreiten der Krankheit antreibt. Die stammartige Zellisolierung ermöglicht die Identifizierung neuartiger Gene, die therapeutisch für eine wirksame Krankheitsremission mitgezielt werden können. Unser Label-Retention-Assay ist für die normale Stammzellisolierung aus verschiedenen Geweben und Zellen sowie für die Krebsstammzellforschung geeignet.Wichtig ist, dass dieser Assay auf andere Epithelzellkrebsarten wie Brust- und Dickdarmkrebs anwendbar ist. Beginnen Sie mit der Beschichtung von 100-Millimeter-Kulturgerichten mit zwei Millilitern 2,5-Mikrogramm-Fibronectin-Lösung und inkubieren Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur. Dann die Lösung ansaugen und die Kulturgerichte 45 Minuten lang im Biosicherheitsschrank trocknen lassen.Fügen Sie neun Milliliter des Prostataepithelzellwachstumsmediums zu einer fibronectinbeschichteten Schale hinzu und halten Sie es im Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius warm. Eine Durchstechflasche mit gefrorenen menschlichen Prostataepithelzellen in einem 37 Grad Celsius Wasserbad auftauen und die Zellen in 10 Milliliter warmem Medium wieder aufhängen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 mal g für fünf Minuten.Dann den Überstand ansaugen und entsorgen. Die Zellen in einem Milliliter warmen Kulturmedium aussetzen und einen Milliliter der Suspension direkt auf die fibronectinbeschichtete Schale mit dem vorgewärmten Medium übertragen. Dann inkubieren Sie die Schale im Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius.Wenn Sie die Zellen mitbeschriften, bereiten Sie BrdU-markierte Zellen in einer 10-Tage-2D-Kultur vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Dann fügen Sie fünf Mikromolar CFSE oder Far Red und inkubieren die Zellen für 30 Minuten. Nach der Inkubation das Medium vorsichtig mit dem Farbstoff ansaugen und die Zellen zweimal mit fünf Millilitern warmen PBS waschen.Als nächstes führen Sie die enzymatische Verdauung mit 05%trypsin EDTA gemäß den Manuskriptrichtungen durch. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 mal g und entsorgen Sie den Überstand. Die Zellen wurden in eiskalter, eins-zu-eins-Kellermembranmatrix und Kulturmedium-Mix für 3D-Prostasphärenbildung resuspendiert.Um die Prostasphärenkultur in einem 3D-Kellermatrixsystem vorzubereiten, tauen Sie die Kellermembranmatrix über Nacht bei vier Grad Celsius auf und halten Sie sie vor dem Gebrauch auf Eis. Dann sanft einen Milliliter eiskalte Kellermembranmatrix in ein gleiches Volumen eiskaltes Kulturmedium geben. Pipette nach oben und unten zu mischen, darauf achten, keine Luftblasen einzuführen.Resuspend fünfmal 10 bis 1/4 menschliche Prostata-Epithelzellen in eiskalten Eins-zu-eins-Kellermembranmatrix und Kulturmedien mischen für ein Gesamtvolumen von 500 Mikroliter. Pipette die Lösung auf den unteren Rand jedes Brunnens und wirbeln Sie die Platte gleichmäßig verteilen die Mischung. Legen Sie die Platte 30 Minuten lang in einen 37 Grad Celsius Kohlendioxid-Inkubator, damit sich die Matrix erstarren kann.Dann bedecken Sie es mit einem Milliliter warme Kultur Medium pro Brunnen, um sicherzustellen, dass der Ring nicht stören. Um die CFSE-gekennzeichneten Prostasphären zu ernten, ersetzen Sie das Medium durch zwei Milliliter Dispase und Pipetten nach oben und unten, um es mehrmals zu mischen. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Matrix zu verdauen, und sammeln Sie das Kugelgemisch dann in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr.Zentrifugieren Sie die Kugeln fünf Minuten lang mit 500 mal g und entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet in 500 Mikroliter warmem 05%trypsin EDTA wieder aufhängen und in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr geben. Inkubieren Sie die Kugeln bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten, dann fügen Sie 500 Mikroliter warme PBS mit 10%FBS.Führen Sie sie durch eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 26-Spur-Nadel, um die Kugeln vollständig zu trennen. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500-fachm g. Dann den Überstand ansaugen und entsorgen.Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter warmen Kulturmedium mit einem Mikrogramm pro Milliliter Propidiumjodid aus, um die abgestorbenen Zellen zu färben und eine Minute bei Raumtemperatur zu bebrüten. Wiederholen Sie die Zentrifugation, und entsorgen Sie den Überstand. Dann waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter warmes Medium.Wiederholen Sie die Zentrifugation, und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter warmen Kulturmedium aus und sammeln Sie die Zellen in fünf Milliliter Polystyrol runden Bodenröhrchen, indem Sie sie durch 35-Mikron Porengröße Zellsieb Fangkappen filtern. Führen Sie eine FACS-Analyse von trypsindisperdiszierten CFSE-markierten Prostasphärenzellen durch.Verwenden Sie nicht-markierte Zellen als Negative-Control und CFSE-markierte Zellen als positivmarkierte Steuerung, um die Gates festzulegen, führen Sie die Probe aus, um die Subpopulationen von fraktionierten CFSE-hohen und CFSE-niedrigen Zellen zu sortieren und zu sammeln. Primäre normale menschliche Prostataepithelzellen wurden in fibronectin-beschichtete Kulturgerichte gelegt und das Zellwachstum wurde in der 2D-Kultur beibehalten. Beim Transfer in eine 3D-Kultur mit einer Kellermembranmatrix starben differenzierte Epithelzellen langsam aus und nur Prostatastammzellen blieben übrig.Die Dual-Labeling von Prostata-Epithelzellen in der 2D-Kultur gefolgt von Sphäroidbildung in der 3D-Kultur zeigte die Kolokalisierung von BrdU, CFSE und Far Red in den gleichen etikettenerhaltenden Zellen. Duale Immunfärbung zeigte, dass etikettenerhaltende Zellen einen niedrigeren Gehalt an Cytokeratin-Protein Keratin 14, ein vermindertes Zellknotenprotein E-Cadherin, erhöhte Stammzell-Frühmarkerproteine Wnt10b und ALDH1A1, erhöhtes Autophagieprotein LC3 und erhöhtes Myosin-IIB aufweisen. Darüber hinaus erkennt der sphäroidbasierte, etikettenretentionsbasierte Assay erfolgreich krebsstammartige Zellen in Prostatakrebsproben.CFSE-markierte, haltmähnliche Krebszellen und Sphäroide, die aus menschlichen Prostatakrebsproben gewonnen wurden, zeigten ein reduziertes E-Cadherin-Protein im Vergleich zu den nicht gekennzeichneten Vorläuferzellen. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, die Matrix in flüssiger Form für die Vorbereitung des Kulturmediums beizubehalten. Lagern Sie es über Nacht bei vier Grad, und kühlen Sie Pipettenspitzen in eiskaltem PBS vor der Dosiermatrix.Nach der Isolierung von Stammzellen mit dem sphäroidbasierten Labelretentionstest können einzellige RNA-Sequenzierungen und proteomische Analysen durchgeführt werden, um spezifische Gene und neuartige Biomarker in Stammzellen zu identifizieren. Die Isolierung lebender Krebsstammzellen durch den sphäroidbasierten Labelretentionstest ermöglicht es Forschern, krebsstammzellabgeleitete Tumoroide in vitro zu züchten und neuartige Krebsmedikamente zu untersuchen.

isolation-of-stem-like-cells-from-3-dimensional-spheroid-cultures

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Wir beschreiben eine einfache, schnelle Methode zur Erzeugung von 3D-Gewebe-like Sphäroide und ihre mögliche Anwendung auf Unterschiede in der Zell-Zell-Interaktionen zu quantifizieren.

A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Eine einfache Methode ist für die Analyse von Auswirkungen von Fibroblasten aus dem Bindegewebe auf verbundene Epithelzellen beschrieben. Die Kombination dieser Verfahren und dreidimensionalen Gewebekultur Analyse von Zellen nach der Isolierung aus 3D zu erleichtern. Die Technik ist für Zellen unterschiedlicher maligne Potential, so dass systematische Untersuchung der Wirkungen von Tumor-assoziiertem Stroma auf Tumorzellen.

Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

Sphäroide sind eine Art von 3D-Zellkulturmodell, das verwendet wird, um die Umgebung einer Zelle im Vergleich zu 2D-Zellkultur-Monolayer-Modellen genauer darzustellen. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie Wissenschaftler Sphäroide aus einer Darmkrebszelllinie erzeugen und Lebendzell-Imaging anwenden, um das Wachstum der Sphäroide zu verfolgen.

Sphäroiderzeugung aus Zelllinien: Eine dreidimensionale (3D) Zellkulturmethode

Diese Methode bewertet die Invasion von Krebszellen von Sphäroiden in eine umgebende 3D-Matrix.  Sphäroide werden über die Methode der hängenden Tropfenkultur erzeugt und dann in eine Matrix eingebettet, die aus Basalmembranmaterialien und Kollagen vom Typ I besteht.  Die Invasion aus den Sphäroiden wird anschließend überwacht.

Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

Das therapeutische Potenzial von mesenchymalen Stamm-/Stromazellen (MSCs) ist gut dokumentiert, jedoch bleibt die beste Methode, die Zellen für Patienten vorzubereiten, umstritten. Darin kommunizieren wir Protokolle zur effizienten Erzeugung und Verabreichung von therapeutischen sphärischen Aggregaten oder "Sphäroiden" von MSCs, die unter xenofreien Bedingungen für experimentelle und klinische Anwendungen geprimt wurden.

Herstellung und Verabreichung von therapeutischen mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen (MSC) Sphäroiden Primed in 3-D-Kulturen unter Xeno freien Bedingungen

Hier beschreiben wir ein schnelles und flexibles Protokoll für die Bildung von 3D-Zellsphäroiden durch Zellaggregation. Dies lässt sich leicht an mehrere Zelltypen anpassen und eignet sich für den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Zellmigrations-, Invasions- oder Anoikis-Assays sowie für die Bildgebung und Quantifizierung von Zell-Matrix-Interaktionen.

Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

Optische Kohärenztomografie (OCT), eine dreidimensionale imaging-Technologie, wurde verwendet, um zu überwachen und zu charakterisieren, die Wachstum Kinetik der vielzelligen Tumor Sphäroide. Präzise volumetrische Quantifizierung der Tumor Sphäroide mit einem Voxel zählen Ansatz und markierungsfreie abgestorbenes Gewebe-Erkennung in der Sphäroide basierend auf intrinsische optische Dämpfung dagegen wurden demonstriert.

Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der dreidimensionalen Tumor Sphäroide mit optischen Kohärenztomographie

Dieses Protokoll stellt ein neuartiges, robustes und reproduzierbares Kultursystem zur Erzeugung und zum Wachstum dreidimensionaler Sphäroide aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen dar. Die Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses Ansatzes zur Untersuchung der Krebsstammzellbiologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.

Ein dreidimensionales Modell von Sphäroiden zur Untersuchung von Darmkrebs-Stammzellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur kostengünstigen Herstellung von Gewebesphäroiden in großem Maßstab unter Verwendung eines 3D-gedruckten stempelähnlichen Geräts.

Erzeugung von Gewebesphäroiden über ein 3D-gedrucktes stempelähnliches Gerät

Wir stellen ein Protokoll für die Züchtung hochreproduzierbarer Sphäroide und deren phänotypische Charakterisierung mittels Bilderfassung und Proteomik vor.

Halbautomatische phänotypische Analyse funktioneller 3D-Sphäroidzellkulturen

In dieser Studie wird eine kostengünstige und effiziente Methodik zur Generierung von 3D-Zellstrukturen unter Verwendung eines stempelbasierten Systems zur Erstellung von Mikrovertiefungen in Agaroseformen vorgestellt. Das System fördert die Bildung einheitlicher Sphäroide/Organoide und verbessert so die Zellinteraktionen. Dieser Ansatz reduziert die experimentelle Variabilität und unterstützt Anwendungen in der Wirkstoffdiagnostik und im Tissue Engineering.

Erzeugung von dreidimensionalen Sphäroiden/Organoiden aus zweidimensionalen Zellkulturen mit Hilfe eines neuartigen Stempelgeräts

Erfahren Sie die Isolierung quieszenter Stammzellen aus 3D-Sphäroidkulturen mittels biomarkerfreier Label-Retention-Assay. Diese Methode ermöglicht die FACS-basierte Trennung lebender Stammzellen von Tochterprogenitorzellen für die Prostatakrebsforschung.

Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

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