Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

Die Stammzellisolation bleibt eine große Herausforderung durch die Ko-Isolation von Vorläuferzellen mit aktuellen Methoden. Wir haben einen neuartigen biomarkerfreien Assay entwickelt, um ruhende Stammzellen von gemischten Vorläufern zu isolieren. Der Hauptvorteil dieses sphäroidbasierten, Etikettenretentions-Assays, es kann lebende Stammzellen von ihren Tochtervorläufern durch FACS mit CFSE- oder Far Red-Etikettierung erweitern und isolieren.

Während konventionelle Therapien die meisten Prostatakrebszellen ausrotten, bleiben Krebsstammzellen aufgrund therapeutischer Resistenz enden, was das Fortschreiten der Krankheit antreibt. Die stammartige Zellisolierung ermöglicht die Identifizierung neuartiger Gene, die therapeutisch für eine wirksame Krankheitsremission mitgezielt werden können. Unser Label-Retention-Assay ist für die normale Stammzellisolierung aus verschiedenen Geweben und Zellen sowie für die Krebsstammzellforschung geeignet.

Wichtig ist, dass dieser Assay auf andere Epithelzellkrebsarten wie Brust- und Dickdarmkrebs anwendbar ist. Beginnen Sie mit der Beschichtung von 100-Millimeter-Kulturgerichten mit zwei Millilitern 2,5-Mikrogramm-Fibronectin-Lösung und inkubieren Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur. Dann die Lösung ansaugen und die Kulturgerichte 45 Minuten lang im Biosicherheitsschrank trocknen lassen.

Fügen Sie neun Milliliter des Prostataepithelzellwachstumsmediums zu einer fibronectinbeschichteten Schale hinzu und halten Sie es im Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius warm. Eine Durchstechflasche mit gefrorenen menschlichen Prostataepithelzellen in einem 37 Grad Celsius Wasserbad auftauen und die Zellen in 10 Milliliter warmem Medium wieder aufhängen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 mal g für fünf Minuten.

Dann den Überstand ansaugen und entsorgen. Die Zellen in einem Milliliter warmen Kulturmedium aussetzen und einen Milliliter der Suspension direkt auf die fibronectinbeschichtete Schale mit dem vorgewärmten Medium übertragen. Dann inkubieren Sie die Schale im Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Wenn Sie die Zellen mitbeschriften, bereiten Sie BrdU-markierte Zellen in einer 10-Tage-2D-Kultur vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Dann fügen Sie fünf Mikromolar CFSE oder Far Red und inkubieren die Zellen für 30 Minuten. Nach der Inkubation das Medium vorsichtig mit dem Farbstoff ansaugen und die Zellen zweimal mit fünf Millilitern warmen PBS waschen.

Als nächstes führen Sie die enzymatische Verdauung mit 05%trypsin EDTA gemäß den Manuskriptrichtungen durch. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 mal g und entsorgen Sie den Überstand. Die Zellen wurden in eiskalter, eins-zu-eins-Kellermembranmatrix und Kulturmedium-Mix für 3D-Prostasphärenbildung resuspendiert.

Um die Prostasphärenkultur in einem 3D-Kellermatrixsystem vorzubereiten, tauen Sie die Kellermembranmatrix über Nacht bei vier Grad Celsius auf und halten Sie sie vor dem Gebrauch auf Eis. Dann sanft einen Milliliter eiskalte Kellermembranmatrix in ein gleiches Volumen eiskaltes Kulturmedium geben. Pipette nach oben und unten zu mischen, darauf achten, keine Luftblasen einzuführen.

Resuspend fünfmal 10 bis 1/4 menschliche Prostata-Epithelzellen in eiskalten Eins-zu-eins-Kellermembranmatrix und Kulturmedien mischen für ein Gesamtvolumen von 500 Mikroliter. Pipette die Lösung auf den unteren Rand jedes Brunnens und wirbeln Sie die Platte gleichmäßig verteilen die Mischung. Legen Sie die Platte 30 Minuten lang in einen 37 Grad Celsius Kohlendioxid-Inkubator, damit sich die Matrix erstarren kann.

Dann bedecken Sie es mit einem Milliliter warme Kultur Medium pro Brunnen, um sicherzustellen, dass der Ring nicht stören. Um die CFSE-gekennzeichneten Prostasphären zu ernten, ersetzen Sie das Medium durch zwei Milliliter Dispase und Pipetten nach oben und unten, um es mehrmals zu mischen. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Matrix zu verdauen, und sammeln Sie das Kugelgemisch dann in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr.

Zentrifugieren Sie die Kugeln fünf Minuten lang mit 500 mal g und entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet in 500 Mikroliter warmem 05%trypsin EDTA wieder aufhängen und in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr geben. Inkubieren Sie die Kugeln bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten, dann fügen Sie 500 Mikroliter warme PBS mit 10%FBS.

Führen Sie sie durch eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 26-Spur-Nadel, um die Kugeln vollständig zu trennen. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500-fachm g. Dann den Überstand ansaugen und entsorgen.

Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter warmen Kulturmedium mit einem Mikrogramm pro Milliliter Propidiumjodid aus, um die abgestorbenen Zellen zu färben und eine Minute bei Raumtemperatur zu bebrüten. Wiederholen Sie die Zentrifugation, und entsorgen Sie den Überstand. Dann waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter warmes Medium.

Wiederholen Sie die Zentrifugation, und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter warmen Kulturmedium aus und sammeln Sie die Zellen in fünf Milliliter Polystyrol runden Bodenröhrchen, indem Sie sie durch 35-Mikron Porengröße Zellsieb Fangkappen filtern. Führen Sie eine FACS-Analyse von trypsindisperdiszierten CFSE-markierten Prostasphärenzellen durch.

Verwenden Sie nicht-markierte Zellen als Negative-Control und CFSE-markierte Zellen als positivmarkierte Steuerung, um die Gates festzulegen, führen Sie die Probe aus, um die Subpopulationen von fraktionierten CFSE-hohen und CFSE-niedrigen Zellen zu sortieren und zu sammeln. Primäre normale menschliche Prostataepithelzellen wurden in fibronectin-beschichtete Kulturgerichte gelegt und das Zellwachstum wurde in der 2D-Kultur beibehalten. Beim Transfer in eine 3D-Kultur mit einer Kellermembranmatrix starben differenzierte Epithelzellen langsam aus und nur Prostatastammzellen blieben übrig.

Die Dual-Labeling von Prostata-Epithelzellen in der 2D-Kultur gefolgt von Sphäroidbildung in der 3D-Kultur zeigte die Kolokalisierung von BrdU, CFSE und Far Red in den gleichen etikettenerhaltenden Zellen. Duale Immunfärbung zeigte, dass etikettenerhaltende Zellen einen niedrigeren Gehalt an Cytokeratin-Protein Keratin 14, ein vermindertes Zellknotenprotein E-Cadherin, erhöhte Stammzell-Frühmarkerproteine Wnt10b und ALDH1A1, erhöhtes Autophagieprotein LC3 und erhöhtes Myosin-IIB aufweisen. Darüber hinaus erkennt der sphäroidbasierte, etikettenretentionsbasierte Assay erfolgreich krebsstammartige Zellen in Prostatakrebsproben.

CFSE-markierte, haltmähnliche Krebszellen und Sphäroide, die aus menschlichen Prostatakrebsproben gewonnen wurden, zeigten ein reduziertes E-Cadherin-Protein im Vergleich zu den nicht gekennzeichneten Vorläuferzellen. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, die Matrix in flüssiger Form für die Vorbereitung des Kulturmediums beizubehalten. Lagern Sie es über Nacht bei vier Grad, und kühlen Sie Pipettenspitzen in eiskaltem PBS vor der Dosiermatrix.

Nach der Isolierung von Stammzellen mit dem sphäroidbasierten Labelretentionstest können einzellige RNA-Sequenzierungen und proteomische Analysen durchgeführt werden, um spezifische Gene und neuartige Biomarker in Stammzellen zu identifizieren. Die Isolierung lebender Krebsstammzellen durch den sphäroidbasierten Labelretentionstest ermöglicht es Forschern, krebsstammzellabgeleitete Tumoroide in vitro zu züchten und neuartige Krebsmedikamente zu untersuchen.