Eine elektrophysiologische Studie von Retinogenikulat- und Kortikogenikulat-Synapsen in Hirnschnitten von Mäusen

Platzieren Sie ein Maushirnschnitt in einer Aufnahmekammer, die mit einer sauerstoffhaltigen Aufnahmelösung durchblutet ist.

Die Scheibe enthält den dorsalen lateralen Genikulatkern (dLGN), der reich an Relaisneuronen ist. Diese Neuronen bilden retinogenikulate Synapsen mit den Projektionen retinaler Ganglienzellen und kortikogenikuläre Synapsen mit neuronalen Projektionen aus dem visuellen Kortex.

Positionieren Sie eine stimulierende Pipette auf dem Sehtrakt, um retinogenikulate Synapsen zu untersuchen, oder auf dem Nucleus reticularis thalami, um kortikogenikulate Synapsen zu untersuchen.

Positionieren Sie eine Aufnahmepipette in der Nähe der Schnittscheibe. Lokalisieren Sie mit einem Mikroskop ein Relaisneuron.

Üben Sie positiven Druck aus, um ein Verstopfen der Pipette zu verhindern, während Sie sich dem Neuron nähern.

Schalten Sie auf Unterdruck um, bilden Sie eine Abdichtung mit der Zellmembran und brechen Sie sie dann, um die Kontinuität mit dem Zytoplasma herzustellen.

Geben Sie mit der stimulierenden Pipette elektrische Impulse ab, die die Projektionen dazu veranlassen, exzitatorische Neurotransmitter freizusetzen, die an synaptische Rezeptoren von Neuronen binden und den von der Aufzeichnungspipette gemessenen Ionenfluss auslösen.

Ziehen Sie bei diesem Verfahren die Aufzeichnungspipetten mit Hilfe von Borosilikatglaskapillaren und einem Filamentabzieher. Ziehen Sie anschließend die Stimulationspipetten nach dem gleichen Protokoll, aber brechen Sie die Spitze nach dem Ziehen leicht, um den Durchmesser zu vergrößern. Füllen Sie anschließend die Aufzeichnungspipetten mit intrazellulärer Lösung und Biocytin und füllen Sie die stimulierenden Pipetten mit Aufzeichnungslösung.

Legen Sie dann die Scheiben in die Aufnahmekammer und perfundieren Sie sie kontinuierlich mit sauerstoffhaltiger Aufnahmelösung bei Raumtemperatur. Visualisieren Sie die Schnitte mit einem aufrechten Mikroskop, das mit IR-DIC-Videomikroskopie ausgestattet ist. Markieren Sie alle Schichten und wählen Sie diejenigen aus, die intakte optische Bahnen anzeigen. Platzieren Sie die stimulierende Pipette auf der Schnitte, bevor Sie die Zelle mit der Aufnahmepipette flicken.

Um die retinogenikulierten Synapsen zu untersuchen, platzieren Sie die stimulierende Pipette direkt auf dem Sehtrakt, wo die Axonfasern aus retinalen Ganglienzellen gebündelt sind. Um die kortikogenikulären Synapsen zu analysieren, platzieren Sie die Stimulationselektrode auf dem Nucleus reticularis thalami, der rostroventral neben dem dorsolateralen Nucleus geniculatus liegt. Sobald die Aufzeichnungspipette in die Aufzeichnungslösung eingetaucht ist, wenden Sie einen Fünf-Millivolt-Schritt an, um den Pipettenwiderstand zu überwachen.

Stellen Sie das Haltepotenzial auf null Millivolt ein und heben Sie das Offset-Potential auf, sodass der Haltestrom null Pikoampere beträgt. Nähern Sie sich der Zelle mit einer Aufzeichnungspipette, während Sie Überdruck ausüben. Wenn die Pipette in direktem Kontakt mit der Zellmembran steht, lassen Sie den Überdruck ab und stellen Sie das Haltepotential auf minus 70 Millivolt ein.

Üben Sie dann einen leichten Unterdruck aus, damit sich die Zellmembran so an der Glaspipette festsetzen kann, dass sich eine Gigaohm-Dichtung bildet. Kompensieren Sie die Pipettenkapazität und öffnen Sie die Zelle durch Anlegen von Unterdruckimpulsen. Um die synaptische Funktion zu untersuchen, legen Sie 0,1-Millisekunden-Stromimpulse über die Stimulationspipette an. Überwachen Sie den Serienwiderstand kontinuierlich, indem Sie einen Fünf-Millivolt-Schritt anlegen.

Der Serienwiderstand kann geschätzt werden, indem fünf Millivolt durch die Spitzenamplitude des evozierten Stroms dividiert werden. Verwenden Sie für die Analyse nur Zellen mit einem Serienwiderstand kleiner als 20 Megaohm.