Experimentelle Endokarditis Modell von Methicillin-resistenten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein experimentelles Modell der infektiösen Endokarditis bei Ratten zu etablieren. Dies wird erreicht, indem zunächst aureus kultiviert und Operationskatheter zur Infektion vorbereitet werden. Anschließend wird der Operationsbereich präpariert und das Tier anästhesiert.

Nachdem das Tier anästhesiert wurde, wird ein Katheter über die rechte Arteria carotis in Richtung Herz vorgeschoben. Im letzten Schritt erfolgt die Infektion der Tiere mittels Injektion von aureus in die Schwanzvene. Abschließend werden die Zielgewebe disseziert und zur quantitativen Kultur vorbereitet.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise einem schnellen Endokarditis-Modell, liegt darin, dass das rote Endokarditis-Modell mit dem In-vivo-Bildgebungssystem Ivus verwendet werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der oralen Pathogenese zu beantworten, beispielsweise bezüglich der Virulenz und der Wirksamkeit antimikrobieller Wirkstoffe. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten haben, da der chirurgische Eingriff anspruchsvoll ist.

Inokulieren Sie zunächst mit einem Schleifer eine volle Menge der M SSA-Kultur aus einer gefrorenen Aufzucht auf eine Schafblut-Triptikase-Soja-Agarplatte. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius, nachdem Sie sichergestellt haben, dass keine Kontamination vorliegt. Wählen Sie eine Kolonie von der Platte aus und verwenden Sie diese, um fünf Milliliter Trypsoy-Bouillon in einem 15-Milliliter-Schraubkappenröhrchen zu beimpfen.

Inkubieren Sie das Inokulum über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem schüttelnden Inkubator. Stellen Sie 200 U/min ein, um zunächst die Katheter vorzubereiten. Schneiden Sie Polyethylenrohre in 10 cm lange Stücke und sterilisieren Sie die Katheter 30 Minuten lang in einer Cex-Desinfektionslösung.

Als Nächstes wird ein Ende eines sterilisierten Schlauchs erhitzt, indem die Spitze mit einer erhitzten, sterilen Pinzette zusammengedrückt wird, um einen Katheter zu formen, der vom rechten Arteria-carotis-Kanal in das linke Ventrikelinnere vordringt und beim Herzschlag das Endokard beschädigt. Anschließend wird die Ratte betäubt, indem sie in eine Kammer mit einem Gemisch aus Isofluran und Sauerstoff im Verhältnis 1:1 gebracht wird, bis die Narkose wirkt. Die Narkose wird bestätigt, indem überprüft wird, ob die Muskeln entspannt sind und keine Fußreflexe auslösbar sind.

Und halten Sie einen anästhetisierten Zustand während der Operation mittels einer Nasenkonne, die mit der Gasmischung verbunden ist, aufrecht. Reinigen Sie den Operationsbereich während der gesamten Operation unter sterilen Bedingungen mit Betadine und 70 %igem Ethanol. Legen Sie die Ratte in Rückenlage und führen Sie einen vertikalen Schnitt durch die Hautschicht des Halses oberhalb des Brustbeins mittels stumpfer Dissektion.

Lösen Sie die Faszie, um die rechte Arteria carotis zu freilegen. Die rechte Arteria carotis befindet sich knapp rechts der Mittellinie über den Schlüsselbeinen. Heben Sie die Arterie vorsichtig aus der Halsgegend heraus und legen Sie zwei 10 Zentimeter lange Seidenlitzen unter die Arterie, um ihr exponiertes zephalad gerichtetes Ende abzubinden.

Bringen Sie dann eine Klemme an der Arterie an, um Blutungen zu verhindern. Erzeugen Sie mit einer Kathetereinführhilfe unter Verwendung einer Pinzette ein kleines Loch an der Spitze der Arterie. Führen Sie das offene Ende des Katheters durch das Loch in der Arterie ein.

Entfernen Sie die Klammer und schieben Sie den Katheter in Richtung Herz. Bis ein Widerstand spürbar ist, sollte der Katheter korrekt eingeführt werden und vier bis fünf Zentimeter in die Arterie hineinragen, wobei er im Rhythmus des Herzschlags des Rattens pulsieren muss. Sobald der Katheter richtig sitzt, binden Sie eine lose Naht um das distale Ende der Arterie und fixieren Sie den Katheter an seiner Position.

Den überschüssigen Faden und die Katheterenden mit der Seidennaht abschneiden und anschließend die Enden unter der Haut des Halses verstauen. Die Haut mit Hautclips verschließen. Die Ratte in einen sauberen Käfig stellen und an einem warmen Ort belassen, bis sie sich von der Narkose erholt hat.

Stellen Sie Futter und Wasser bereit und kontrollieren Sie die Ratte sowohl während als auch nach der Erholungsphase regelmäßig. Die Infektion kann zwischen einem und sieben Tagen nach der Operation durchgeführt werden, wobei der Zeitpunkt innerhalb von Experimenten konsistent bleiben sollte. Reinigen Sie den Schwanz der Ratte mit 70 % Ethanol und injizieren Sie 0,5 Milliliter der MRSA-Kultur in die gewünschte Zelle.

In die Schwanzvene injizieren. Mit einer 27-Gauge-Halbzoll-Nadel Druck auf die Injektionsstelle ausüben, bis jede Blutung gestoppt ist, bevor die Ratte in ihren Käfig zurückgebracht wird. Nach der Tötung der Ratte die Brust mit 70 %igem Ethanol abwischen und dann einen V-förmigen Schnitt unterhalb des Brustbeins in die Brust vornehmen.

Schneiden Sie den Knorpel der Rippen auf jeder Seite des Brustbeins durch. Um das Herz freizulegen, heben Sie es vorsichtig an und durchtrennen Sie das Gewebe nahe der Aorta, indem Sie nach oben präparieren, um das Herz zu lösen. Legen Sie das Herz auf eine sterile Petrischale, die mit einem 10 cm × 10 cm großen Gazetuch ausgelegt ist, und schneiden Sie anschließend durch die innere Wand des linken Ventrikels, um die linke Herzkammer zu öffnen.

Überprüfen Sie die korrekte Katheterplatzierung und entfernen Sie diesen anschließend. Untersuchen und entfernen Sie Vegetationen von der Herzklappe mit Schere und Pinzette. Entfernen Sie außerdem die Nieren und die Milz, und nachdem Sie das Gewebe und die Vegetationen gewogen und homogenisiert haben, stellen Sie serielle Verdünnungen in PBS für die quantitative Kultur her.

Hier ist ein korrekt positionierter Katheter dargestellt, wie durch den linken Pfeil angezeigt. Er erstreckt sich über die Aortenklappe und in die linke Herzkammer hinein, und zahlreiche Vegetationen sind um die Aortenklappe herum sichtbar, wie durch die mittleren und rechten Pfeile angezeigt. Diese Tabelle liefert ein Beispiel für die Virulenz eines ssus-Stamms im Ratten-Endokarditis-Modell.

Alle Tiere, die mit einem Inokulum von 10 hoch 5 und 10 hoch 6 KBE herausgefordert wurden, entwickelten eine Endokarditis mit hohen Ssus-Dichten in den Herzvegetationen sowie in den Nieren und der Milz. Sobald der chirurgische Eingriff beherrscht ist, kann er innerhalb von 10 Minuten durchgeführt werden, wenn er ordnungsgemäß ausgeführt wird.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Tier während der Operation und danach in einem überwachten Zustand zu halten. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie IVUS angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise die Echtzeitüberwachung der Wirksamkeit antimikrobieller Wirkstoffe sowie die in-vivo-Genexpression nach deren Entwicklung. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet von *Staphylococcus aureus* und Infektionen den Weg, um dessen pathogene Virulenzfaktoren bei endovaskulären Infektionen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein experimentelles Endokarditis-Modell bei Ratten etabliert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit MRA äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Laborkittels und von Handschuhen zu beachten sind, während Sie dieses Verfahren durchführen.