Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, mithilfe von Zellmarkierungsfarbstoffen die Ausprägung der Zellteilung für verschiedene Immunzellsubpopulationen innerhalb komplexer Zellpopulationen direkt zu quantifizieren. Dazu wird zunächst die Ausgangszellpopulation mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, der eine stabile Bindung an zelluläre Proteine eingeht oder sich nicht-kovalent in zelluläre Membranen einlagert. Anschließend werden die markierten Zellen nach Stimulation gezählt, mit fluoreszierenden Antikörpern gefärbt und mittels mehrparametrischer Durchflusszytometrie analysiert, wodurch differenzielle Reaktionen zwischen den interessierenden Immunzelltypen nachgewiesen werden können. Als Kontrollen dienen jedoch unbehandelte Zellen ohne Markierungsfarbstoff, um die geringste Tochterzell-Fluoreszenzintensität festzulegen, die noch von der Eigenfluoreszenz abgegrenzt werden kann. Zudem werden mit Markierungsfarbstoff behandelte, aber nicht stimulierte Kontrollen verwendet, um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen, bei der ungeteilte Zellen detektiert werden. Die Stimulation führt typischerweise zu einem breiten Intensitätsspektrum, da sich proliferierende Zellen sukzessive verdunkeln, während Nicht-Responder unverändert bleiben.

Schließlich ermöglicht die Verwendung von Software zur Peak-Modellierung zur Schätzung der relativen Häufigkeit von Zellen in verschiedenen Generationen einen quantitativen Vergleich der proliferativen Reaktionen zwischen unterschiedlichen Populationen oder Stimuli unter Verwendung von Kenngrößen wie Proliferationsindex oder Vorläuferfrequenz. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Markierung mit tritiiertem Thymidin oder der Expression von Ki-67 besteht darin, dass die CFSE-Verdünnung eine direkte Messung der Zellteilung liefert, die mit anderen durchflusszytometrischen Messungen wie der Immunphänotypisierung und der Zytokinproduktion kombiniert werden kann. Eine visuelle Demonstration der Methode zur Membranfarbstoff-Färbung ist hilfreich, da die Aufnahme des Farbstoffs durch die Zellen äußerst schnell erfolgt.

Daher ist eine gute Technik entscheidend, um eine helle, homogene Färbung zu erzielen. Nach der Isolierung menschlicher peripherer mononuklearer Blutzellen diese fünf Minuten bei 300 × g und Raumtemperatur zentrifugieren, um eine Kontamination mit Thrombozyten zu minimieren. Anschließend das Zellpellet in HBSS mit 1 % BSA auf eine Konzentration von 10⁷ Zellen pro Milliliter resuspendieren und auf Eis stellen.

Entfernen und reservieren Sie 500 Mikroliter Eloqua, überführen Sie dann eine weitere 500-Mikroliter-Aliquot von Zellen in ein 12 mal 75 Millimeter großes konisches Polypropylenröhrchen. Geben Sie 3,5 Milliliter HBSS hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 400 × g und Raumtemperatur. Während der Wäsche geben Sie 0,5 Milliliter Verdünnungsmittel C, das Markierungsmedium aus dem PKH-26-GL-Kit, in ein weiteres 12 mal 75 Milliliter großes konisches Polypropylenröhrchen. Aspirieren Sie vorsichtig den Überstand, wobei nicht mehr als 15 bis 25 Mikroliter Restflüssigkeit verbleiben dürfen, und achten Sie darauf, keine Zellen zu entfernen. Geben Sie anschließend 0,5 Milliliter Verdünnungsmittel C zum Zellpellet hinzu und aspirieren sowie dispensieren Sie die Lösung mehrmals, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.

Bereiten Sie nun den zweifachen XD-Stammlösung vor, indem Sie zwei Mikroliter PKH 26 in das Röhrchen mit Verdünnungsmittel C geben. Erst danach pipettieren Sie unverzüglich die Zellsuspension in die frisch hergestellte zweifache PKH-26-Farbstofflösung und saugen die Mischung mehrmals gleichzeitig auf und geben sie wieder ab, um die Zellen gleichmäßig im Farbstoff zu verteilen. Nach einer Minute geben Sie ein Milliliter hitzeinaktiviertes Serum hinzu, um die Aufnahme des Farbstoffs in die Zellmembranen zu stoppen. Nach dem Zentrifugieren der Zellen saugen Sie vorsichtig den Überstand ab, ohne das Pellet zu entfernen.

Verteilen Sie dann das Pellet in vier Milliliter komplettem Medium, das 10 % hitzeinaktiviertes Serum enthält, und überführen Sie die Zellsuspension in ein frisches Polypropylenröhrchen. Waschen Sie die Zellen zweimal ausreichend in HBSS mit 1 % BSA; ausreichend gefärbte Zellen zeigen eine deutliche rosa Färbung im Pellet. Nachdem Sie das Zellpellet in einem Milliliter HBSS mit 1 % BSA resuspendiert haben, zählen Sie die Zellen und stellen Sie anschließend das Volumen so ein, dass eine Endkonzentration von 10⁷ Zellen pro Milliliter erreicht wird. Verwenden Sie nach der Färbung der Zellen gemäß dem im Tabelle dargelegten Durchflusszytometrie-Protokoll die ersten fünf Röhrchen, um die Parameter für Forward Scatter und Side Scatter sowie die Signale in allen vier Fluoreszenzdetektoren einzustellen.

Insbesondere für den Detektor, der verwendet wird, um die PKH-26-Fluoreszenz in Röhrchen zwei zu überwachen. Überprüfen Sie, ob alle mit PKH 26 gefärbten Zellen auf der Skala als einzelner, symmetrischer Peak im dritten bis vierten Dekadenbereich erscheinen, wobei nur wenige bis keine Zellen im letzten Kanal vorhanden sein sollten. Verwenden Sie anschließend die Farbkompensationssoftware und die im Listmodus für die Röhrchen eins bis fünf gesammelten Dateien, um eine Überlappungsmatrix für jede Farbstoffemission in den Detektoren zu erstellen, die zur Überwachung der drei anderen Fluorochrome eingesetzt werden.

Wenden Sie dann diese Matrix auf die List-Modus-Datei für Probe sechs an, um zu überprüfen, ob das Vorhandensein der PKH26-Markierung die Fähigkeit zur Detektion von seven A a D positiven Zellen beeinträchtigt. Wenden Sie nun diese neu erstellte Farbüberlappungsmatrix auf die List-Modus-Datei für Rohr sieben an.

Identifizieren Sie die CD3-positive, CD4-negative und CD3-positive, CD4-positive Populationen in einem FE- vs. PC-Diagramm. Bestätigen Sie, dass das Vorhandensein von anti-CD3, FE und anti-CD4, PC die Fähigkeit zum Nachweis von 7AAD-positiven Zellen nicht beeinträchtigt. Wenden Sie abschließend die Farbüberlappungsmatrix für Röhrchen sieben auf die List-Mode-Datei für Röhrchen acht an.

Öffnen Sie nun ein Programm mit einem Proliferationsanalyse-Modul. Laden Sie die stimulierungsbedingte PKH26-gefärbte Datei aus dem zu analysierenden Datensatz. Wählen Sie anschließend die Parameter für die Analyse aus, in diesem Fall PKH26, gezielt auf vital-positive, 7-AAD-negative, CD3-positive Lymphozyten, sowie Vorwärtsstreuung gegen Seitwärtsstreuung zur Ausschließung kleiner Trümmer und großer Aggregate.

Bei der Definition dieser Bereiche darauf achten, den Bereich mit hoher Vorwärtsstreuung einzuschließen, in dem sich typischerweise Blasten befinden. Öffnen Sie anschließend den Proliferationsassistenten. Klicken Sie auf die Registerkarte „Start“, um die Datendatei zu öffnen, und laden Sie dann die unbehandelte PKH-26-positiven Kontrolle.

Definieren Sie die Position des Eltern-Peaks, der den ungeteilten Zellen entspricht. Analysieren Sie die Datei und notieren Sie die Werte für die Position und Breite des Eltern-Peaks. Falls eine feste Peakbreite gewünscht ist, aktivieren Sie die Option „lock SD“, laden Sie die PKH 26-negative Kontrolle und passen Sie die Anzahl der Generationen an, indem Sie den Peak-Kanal für die dimme Tochtergeneration über den PKH 26-negativen Zellen einstellen.

Dies legt die Anzahl der Tochtergenerationen fest. Das Modell kann genau anpassen, wenn es abgeschlossen ist. Laden Sie die stimulierte PKH 26-positive Datei erneut.

Wenn unterscheidbare generationsbedingte Peaks erkennbar sind, wählen Sie die Einstellung „floating“ unter der Modell-Option. Wenn die logarithmischen Dekaden nicht exakt 4,0 betragen, passen Sie den Abstand zwischen den Generationen wie im Artikel beschrieben an. Analysieren Sie nun die stimulierte Probe und bestätigen Sie, dass der Bereich für die Position des Eltern-Peaks unverändert bleibt.

Wählen Sie abschließend für jede experimentelle Datei im Datensatz die Analyse aus, um das soeben erstellte Modell anzuwenden, und notieren Sie die gewünschten Proliferationsmetriken, die sich aus der besten Anpassung für jede experimentelle Datei im Datensatz ergeben. Diese erste Datenserie veranschaulicht den Einfluss der Mischtechnik auf die PKH-26-Fluoreszenzverteilungen.

Beim Kultivieren wurden U 9 37-myeloide Zellen mit dem Zellmarkierungsfarbstoff unter Verwendung der gerade beschriebenen Methode gefärbt; dieses erste Histogramm zeigt die Daten der ungefärbten Kontrolle. Die Einstellungen des Durchflusszytometers wurden so angepasst, dass die Autofluoreszenz dieser Zellen im ersten Dekadenbereich lag, wobei keine oder nur sehr wenige Zellen im ersten Kanal angesammelt wurden. Dieses zweite Histogramm veranschaulicht eine gute PKH 26-Färbung.

Das schnelle Mischen von zwei x Zellen mit zwei x Farbstoff ergab eine Fluoreszenzverteilung, die hell, homogen und symmetrisch war, jedoch bei den für das vorherige Histogramm verwendeten Instrumenteneinstellungen keine übersteuernden Zellen aufwies. Wurden zwei x Zellen zwei x Farbstoff ohne unmittelbares Mischen hinzugefügt, erhielt man eine heterogenere Fluoreszenzverteilung. Diese kleine Teilpopulation schwach markierter Zellen würde fälschlicherweise als Tochterzellen interpretiert, wenn sie zu einem späteren Zeitpunkt im endgültigen Histogramm dieses Experiments vorhanden wäre. Schlechtes Mischen trat ebenfalls auf, als versehentlich drei Mikroliter konzentrierter Ethanol-Farbstoff-Lösung direkt zu 0,5 Millilitern zweier x Zellsuspension gegeben wurden, was eine äußerst schwache und nach rechts schiefe Fluoreszenzintensitätsverteilung ergab.

Hier sind typische Ergebnisse eines Proliferationsexperiments, bei dem PKH-26-gefärbte humane periphere mononukleäre Blutzellen mit oder ohne stimulierende Anti-CD3- und IL-2-Reagenzien kultiviert wurden. Nach 96 Stunden Kultivierung wurden die Zellen gesammelt und mit Anti-CD3, FE, Anti-CD19, APC und 7-AAD nachgefärbt.

Es wurden zwei verschiedene Gating-Strategien verglichen. Bei der ersten Gating-Strategie wurde ein Dotplot von CD drei gegen sieben A A D verwendet, um lebende sieben A A D-negative, CD-drei-positive T-Zellen auszuwählen. Anschließend wurde ein Vorwärts- und Seitenstreu-Bereich genutzt, um große Aggregate auszuschließen, während weiterhin blastische Lymphozyten eingeschlossen wurden.

Die R1 plus R2-gategegebenen Ereignisse für die unbehandelte Kontrolle werden durch das graue Histogramm dargestellt, und die PKH26-gefärbten, aber nicht stimulierten Zellen sind in Blau dargestellt. Beachten Sie die helle, symmetrische, homogene Färbung für lebensfähige, aber nicht geteilte T-Zellen in der unbehandelten Kontrolle. Diese Daten wurden auf die gleiche Weise wie in der vorherigen Abbildung gategegeben, allerdings wurden in diesem Fall die Zellen mit anti-CD3 und IL-2 stimuliert. Das PKH26-Histogramm für die R1 plus R2-gategegebenen Ereignisse enthält nun hauptsächlich geteilte Zellen mit reduzierter Intensität, dargestellt durch farbige Peaks für jede Tochtergeneration.

Obwohl einige helle, ungeteilte Zellen weiterhin im blauen elterlichen Peak verbleiben. Beachten Sie, dass die Intensität der stark geteilten Zellen noch nicht mit dem Bereich überlappt, in dem unmarkierte Zellen gemessen werden, was die Schätzung von Kenngrößen, die auf der Anzahl der Zellen in den Tochtergenerationen mit der niedrigsten Intensität basieren, verfälschen würde. Dieselben Daten wurden wie bei den beiden vorherigen Abbildungssätzen analysiert, jedoch wurden nur Lichtstreuung und CD drei zur Selektion lebensfähiger T-Zellen verwendet.

Diese Gating-Strategie schließt viele, aber nicht alle toten Zellen aus, wie durch die kleine verbleibende Restpopulation von sieben A a D-positiven toten Zellen in den CD-drei-gegenüber-sieben-A-A-D-Dot-Plots gezeigt wird. Die Wahl der für die Immunphänotypisierung verwendeten Fluorochrome kann bei Verwendung von Zellmarkierungs-Farbstoffen schwierige Kompensationsprobleme verursachen, da die Färbungsintensität ungeteilter Zellen äußerst hell ist. In diesem Experiment wurden 24 Stunden alte periphere mononukleäre Blutzellen mit PKH 26 markiert und anschließend mit Antikörpern gegen CD drei und CD vier sowie einem Vitalitätsfarbstoff nachgefärbt.

In dieser Datenreihe wurden die Zellen, die mit zwei Mikromolar PKH 26 markiert waren, zusätzlich mit anti-CD3-FZ7A und anti-CD4-APC angefärbt und anschließend mit derselben R1-plus-R2-Gating-Strategie wie zuvor analysiert. Da es kaum eine Überlappung von PKH 26 in den APC-Kanal gibt, konnten die CD4-positiven und negativen Ereignisse eindeutig getrennt werden, unabhängig davon, ob Kompensation angewendet wurde. Diese Daten zeigen, wie die lebensfähigen CD3-positiven, CD4-positiven T-Zellen auch dann gut aufgelöst blieben, wenn die endgültige PKH-26-Konzentration auf vier Mikromolar erhöht wurde. Die Verwendung von anti-CD4-PerCP in Kombination mit anti-CD3-FE, zwei Mikromolar PKH 26 und dem Vitalitätsfarbstoff Pro3 führte zu deutlich schlechteren Ergebnissen aufgrund einer erheblichen Spektralüberlappung von PKH 26 in den PerCP-Kanal.

CD-vier-positive und negative Zellen konnten in uncompensierten Daten nicht voneinander getrennt werden und waren nur geringfügig auflösbar, wenn eine Kompensation angewendet wurde. Eine Erhöhung der endgültigen PKH-26-Konzentration auf vier Mikromolar führte zu einem vollständigen Verlust der Fähigkeit, CD-vier-positive von CD-vier-negativen Ereignissen zu unterscheiden, selbst nach Anwendung der Kompensation. Beachten Sie, wie die Proben mit oder ohne anti-CD-vier pro CP im Wesentlichen identisch waren.

Wenn ein Farbstoffverdünnungsprofil mithilfe einer Software zur Peakmodellierung analysiert wird, um die Häufigkeit von Zellen in aufeinanderfolgenden Tochtergenerationen zu schätzen, können die Positionen und/oder Breiten aufeinanderfolgender Tochterpeaks festgelegt oder variabel sein, bezogen auf die Werte des elterlichen Peaks. Diese Werte werden aus der unbehandelten Kontrolle geschätzt.

Beispielsweise stammt dieses PKH-26-Intensitätsprofil aus einer unbehandelten 96-Stunden-Kultur eines mittleren Reagierenden und wurde verwendet, um dem Mod-Fit-Proliferationsassistenten eine erste Schätzung der Position und Breite für den Peak der ungeteilten Elternzellen zu liefern. Die Verwendung einer festen Einstellung für die Peakposition setzt voraus, dass der Mittelwert jedes generationalen Peaks genau der Hälfte der Fluoreszenzintensität des vorherigen Peaks entspricht. Eine variable Einstellung für die Peakposition ermöglicht es, die endgültigen Positionen der generationalen Peaks von den erwarteten Intensitäten abweichend anzupassen, um die bestmögliche Anpassung zu erreichen.

Ebenso erfordert eine feste Einstellung für die Peakbreite, dass die Breite jedes generationalen Peaks mit der des elterlichen oder unstimulierten Kontrollpeaks übereinstimmt. Eine flexible Einstellung für die Peakbreite ermöglicht es, die endgültigen Breiten unabhängig voneinander nach Bedarf zu variieren, um die beste Anpassung in dieser Tabelle zu erzielen. Die Ergebnisse der Analysen der vorherigen Abbildungen für zwei verschiedene Spender werden für diese Spender gezeigt, bei denen unterscheidbare generationale Peaks erkennbar waren.

Die besten reduzierten Chi-Quadrat-Werte wurden erzielt, wenn sowohl die Peakposition als auch die Breite als frei variierend zugelassen wurden; bei Proliferationsprofilen, bei denen keine unterscheidbaren generationalen Peaks erkennbar sind, wird eine feste Einstellung der Peakposition empfohlen. Diese Daten veranschaulichen die Verwendung zweier Farbstoffe zur getrennten Überwachung der Proliferationsgeschichte verschiedener Immunzelltypen in einem durchflusszytometrischen Immunsuppressionsassay. Die in Grün dargestellten T-Effektorzellen wurden mit CFSE markiert, die in Blau dargestellten T-regulatorischen Zellen wurden mit Cell View markiert.

Zellenpopulationen mit Claret-Färbung wurden in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt und in Gegenwart von anti-CD3, anti-CD28 und bestrahlten Zubehörzellen 96 Stunden lang kultiviert. Anschließend wurden die Zellen gewonnen und mit anti-CD4, PE-Cy7 und Live-Dead-Violett gefärbt. Hier sind repräsentative Daten für ein Treg-zu-T-Effektor-Verhältnis von 0,25 zu 1 dargestellt, nachdem die mit Live-Dead-Violett positiv gefärbten Zellen ausgeschlossen wurden.

Ein Lichtstreu-Tor, das Lymphozyten und Blasten einschloss, aber Aggregate und Zelltrümmer ausschloss, wurde verwendet, gefolgt von einem Tor zur Erfassung von CD4-positiven Ereignissen. Die Färbung mit Cell View Claret ermöglichte eine klare Unterscheidung zwischen lebensfähigen Treg-Zellen und lebensfähigen T-Effektorzellen, die stark proliferiert waren, weshalb die CFSE-schwachen Proliferationsprofile für CFSE-positive T-Effektorzellen und Cell View Claret-positive Treg-Zellen mittels ModFit-Peak-Modellierungssoftware analysiert wurden. Insgesamt wurden etwa 25.000 Ereignisse ausgewertet.

Davon waren 48 % vitale T-Effektorzellen, 6 % vitale Tregs, der Rest waren tote Zellen, Begleitzellen und Zelltrümmer. Der berechnete Proliferationsindex, der die Vervielfachung der Zellzahl während des Assayzeitraums widerspiegelt, betrug für T-Effektorzellen 3,85 und für Tregs 1,83. Hier wird der Einfluss der Treg-Zellkonzentration auf den Proliferationsindex der T-Effektorzellen, berechnet aus dem CFSE-Färbedilutionsprofil, dargestellt.

Die Ergebnisse waren identisch, unabhängig davon, ob die Treg-Zellen mit Cell View Claret markiert wurden oder unbehandelt blieben, was darauf hindeutet, dass die Treg-Funktion durch die Färbung nicht verändert wurde. Wie erwartet nahm das Ausmaß der Proliferation der T-Effektorzellen zu, wenn die Konzentration der Treg-Zellen verringert wurde. Proliferationsindizes der Treg-Zellen wurden ebenfalls anhand der Verdünnungsprofile der Cell View Claret-Farbstoffe bei verschiedenen Verhältnissen von Treg- zu T-Effektorzellen berechnet.

Wie erwartet zeigten die Tregs eine minimale Proliferation in Abwesenheit von T-Effektorzellen, während mit steigender Konzentration der T-Effektorzellen auch das Ausmaß der Proliferation der Treg-Zellen zunahm. Nach dem Anschauen des Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellmarkierungsfarbstoffe erfolgreich zur Überwachung der Zellproliferation einsetzt, wie man geeignete Fluorochrome und Farbkompensationskontrollen auswählt und wie man ein geeignetes Modell zur Quantifizierung der Zellteilung basierend auf der Farbstoffverdünnung auswählt.

Zusammen mit diesem Verfahren können weitere Methoden durchgeführt werden, um experimentelle Fragestellungen zu beantworten, wie beispielsweise die Färbung antigenspezifischer T-Zellen oder die Durchflusszytometrie-Sortierung zur Gewinnung von stammzellähnlichen Zellen, die ruhend oder langsam teilend sind. Vielen Dank fürs Zuschauen.