Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, mit Hilfe von Zellverfolgungsfarbstoffen das Ausmaß der Zellteilung für verschiedene Immunzelluntergruppen innerhalb komplexer Populationen direkt zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Mutterzellpopulation mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wird, von dem bekannt ist, dass er eine stabile Bindung an zelluläre Proteine bewirkt oder nicht-kovalent in zelluläre Membranen interkaliert, um Farbstoff-markierte Zellen zu verfolgen, die auf Stimulationszähler ansprechen, mit fluoreszierenden Antikörpern zu färben und die Analyse mittels Multiparameter-Durchflusszytometrie den Nachweis unterschiedlicher Reaktionen zwischen den zu stimulierenden Immunzelltypen ermöglicht, Es werden jedoch ungefärbte Kontrollen mit Tracking-Farbstoffen verwendet, um die niedrigste Fluoreszenzintensität der Tochterzelle zu bestimmen, die von autofluoreszierendem Tracking-Farbstoff unterschieden werden kann, aber unstimulierte Kontrollen werden dann verwendet, um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen, bei der die ungeteilten Zellen detektiert werden. Die Stimulation führt in der Regel zu einem breiten Spektrum von Intensitäten, da die Zellen, die sich als Reaktion vermehren, zunehmend dunkler werden, Nicht-Responder jedoch nicht.

Letztendlich kann die Verwendung von Peak-Modellierungssoftware zur Schätzung der relativen Häufigkeit der Zellen in verschiedenen Generationen einen quantitativen Vergleich der proliferativen Reaktionen über verschiedene Populationen oder Reize hinweg anhand von Metriken wie dem Proliferationsindex oder der Vorläuferfrequenz ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie tritiiert, thy Inkorporation oder KI 67-Expression besteht darin, dass die DI-Verdünnung ein direktes Maß für die Zellteilung liefert, das mit anderen durchflusszytometrischen ME-Messungen wie Immunphänotypisierung und Zytokinproduktion kombiniert werden kann. Die visuelle Demonstration der Methode der Membranfarbstofffärbung ist hilfreich, da die Farbstoffaufnahme durch die Zellen extrem schnell erfolgt.

Folglich ist eine gute Technik der Schlüssel zu einer hellen, homogenen Färbung. Nach der Isolierung mononukleärer Zellen des menschlichen peripheren Blutes zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 300-facher G- und Raumtemperatur, um die Thrombozytenkontamination zu minimieren. Dann resuspendieren Sie das Pellet bei 10 bis den siebten Zellen pro Milliliter HBSS plus 1%BSA und legen Sie sie auf Eis.

Entnehmen und reservieren Sie ein 500-Mikroliter-Eloqua und geben Sie dann weitere 500 Mikroliter Aliquot an Zellen in ein konisches Polypropylen-Röhrchen von 12 x 75 Millimetern. Fügen Sie 3,5 Milliliter HBSS hinzu und schleudern Sie die Zellen während des Waschvorgangs fünf Minuten lang bei 400-facher G-Temperatur und Raumtemperatur herunter. Geben Sie 0,5 Milliliter des Verdünnungsmittels C aus dem PKH 26 GL-Kit in ein weiteres konisches Polypropylen-Röhrchen von 12 x 75 Millilitern, saugen Sie das Super Natin vorsichtig an, lassen Sie nicht mehr als 15 bis 25 Mikroliter Restflüssigkeit übrig und achten Sie darauf, keine Zellen zu entfernen. Geben Sie anschließend 0,5 Milliliter Verdünnungsmittel C zum Zellpellet hinzu und aspirieren und dosieren Sie die Lösung mehrmals, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.

Bereiten Sie nun die beiden XD-Vorräte vor, indem Sie zwei Mikroliter PKH 26 in das Röhrchen mit dem Verdünnungsmittel C geben.Erst jetzt sofort pipettieren Sie die Zellsuspension in frisch hergestellte zwei XPKH 26 Farbstofflösung und aspirieren und dosieren Sie gleichzeitig die Beimischung mehrmals, um die Zellen gleichmäßig im Farbstoff zu verteilen. Fügen Sie nach einer Minute einen Milliliter hitzeinaktiviertes Serum hinzu, um die Aufnahme des Farbstoffs in die Zellmembranen zu stoppen. Nach dem Schleudern saugen die Zellen den Überstand vorsichtig an, ohne das Pellet zu entfernen.

Dispergieren Sie dann das Pellet in vier Millilitern vollständigem Medium mit 10 % hitzeinaktiviertem Serum und überführen Sie die Zellsuspension in ein frisches Polypropylenröhrchen. Waschen Sie die Zellen zweimal in HBSS plus 1 % BSA, ausreichend gefärbte Zellen weisen einen deutlichen Rosastich im Pellet auf. Nach der Wiederbelebung suspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter HBSS plus 1 % BSA, zählen Sie die Zellen und passen Sie dann das Volumen an, um eine Endkonzentration von 10 bis den siebten Zellen pro Milliliter zu erhalten. Nach der Färbung der Zellen gemäß dem in der Tabelle beschriebenen durchflusszytometrischen Protokoll verwenden Sie die ersten fünf Röhrchen, um die Parameter für die Vorwärts- und Seitenstreuung sowie die Signale in allen vier Fluoreszenzdetektoren einzustellen.

Insbesondere für den Detektor, der zur Überwachung der Fluoreszenz PKH 26 in Röhre zwei verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass alle PKH 26-gefärbten Zellen auf der Skala als ein einziger symmetrischer Peak im dritten bis vierten Jahrzehnt erscheinen, mit wenigen bis gar keinen Zellen im letzten Kanal. Verwenden Sie als Nächstes die Farbkompensationssoftware und die Listenmodus-Dateien, die für die Röhren eins bis fünf gesammelt wurden, um eine Farbüberlappungsmatrix für jedes Fluro in den Detektoren zu erstellen, die zur Überwachung der drei anderen Fluorochrome verwendet werden.

Wenden Sie diese Matrix dann auf die Listenmodusdatei für Beispiel sechs an. Es sollte sichergestellt werden, dass das Vorhandensein von PKH 26-Markierung die Fähigkeit zum Nachweis von sieben A- bis D-positiven Zellen nicht verändert. Wenden Sie nun diese gerade etablierte Farbüberlappungsmatrix auf die Listenmodus-Datei für Röhre sieben an.

Identifizieren Sie die CD drei positive CD vier negative und CD drei positive CD vier positive Populationen in einem FE- und einem PC-Plot. Vergewissern Sie sich, dass das Vorhandensein von Anti-CD 3-, FE- und Anti-CD 4 A PC die Fähigkeit zum Nachweis von sieben A- und D-positiven Zellen nicht verändert. Wenden Sie abschließend die Farbüberlappungsmatrix für Röhre sieben auf den Listenmodus Datei für Röhre acht an.

Öffnen Sie nun ein Programm, das ein Proliferationsanalysemodul enthält. Laden Sie die stimulierte PKH 26-gefärbte Datei aus dem zu analysierenden Datensatz. Als nächstes wählen Sie die Parameter für die Analyse in diesem Fall aus, PKH 26 auf lebensfähige sieben a a d negative cd, drei positive Lymphozyten und Vorwärtsstreuung versus Seitenstreuung zum Ausschluss von kleinen Trümmern und großen Aggregaten.

Achten Sie bei der Definition dieser Bereiche darauf, den Bereich mit hoher Vorwärtsstreuung einzubeziehen, in dem typischerweise Explosionen auftreten. Öffnen Sie als Nächstes den Proliferations-Assistenten. Klicken Sie auf die Registerkarte Start, um die Datendatei zu öffnen und dann die nicht stimulierte Positivkontrolle PKH 26 zu laden.

Definieren Sie die Position des übergeordneten Peaks, der den ungeteilten Zellen entspricht. Analysieren Sie die Datei, und notieren Sie sich die Werte für die Position und Breite der übergeordneten Spitze. Wenn eine feste Peakbreite gewünscht wird, aktivieren Sie die Sperre SD, laden Sie den Negativregler P KH 26 und stellen Sie die Anzahl der Generationen ein, indem Sie den Peakkanal für die Dimus-Tochtererzeugung über den negativen Zellen PKH 26 einstellen.

Dadurch wird die Anzahl der Tochtergenerationen festgelegt. Das Modell kann genau passen, wenn es fertig ist. Laden Sie die stimulierte Positivdatei PKH 26 neu.

Wenn unterscheidbare Generationsspitzen erkennbar sind, wählen Sie unter der Modelloption die Einstellung Gleitkomma. Wenn die Protokolldekaden nicht genau 4.0 sind, passen Sie den Generationsabstand an, wie im Artikel beschrieben. Analysieren Sie nun die stimulierte Probe und bestätigen Sie, dass die Region für die elterliche Peakposition unverändert bleibt.

Wählen Sie abschließend für jede experimentelle Datei im Dataset, die angewendet werden soll, die Option "Analysieren" aus. Das Modell hat gerade die gewünschten Proliferationsmetriken erstellt und aufgezeichnet, die sich aus der besten Anpassung für jede experimentelle Datei im Dataset ergeben. Diese erste Datenserie veranschaulicht den Einfluss der Mischtechnik auf die PKH 26-Fluoreszenzverteilungen.

Bei der Kultivierung wurden U 9 37 myeloische Zellen mit dem Zellverfolgungsfarbstoff nach der eben beschriebenen Methode gefärbt; dieses erste Histogramm zeigt die ungefärbten Kontrolldaten. Die Zytometereinstellungen wurden so angepasst, dass die Autofluoreszenz dieser Zellen im ersten Jahrzehnt lag, wobei sich keine oder nur sehr wenige Zellen im ersten Kanal ansammelten. Dieses zweite Histogramm zeigt eine gute PKH 26-Färbung.

Das schnelle Mischen von zwei x-Zellen mit zwei x-Farbstoffen ergab eine Fluoreszenzverteilung, die hell, homogen und symmetrisch war, aber bei den für das vorherige Histogramm verwendeten Geräteeinstellungen keine Zellen außerhalb der Skala aufwies. Wenn zwei x-Zellen zu zwei x-Farbstoffen ohne unmittelbares Mischen hinzugefügt wurden, wurde eine heterogenere Fluoreszenzverteilung erhalten. Diese kleine Subpopulation von schwach markierten Zellen würde fälschlicherweise als Tochterzellen interpretiert werden, wenn sie zu einem späteren Zeitpunkt im endgültigen Histogramm dieses Experiments vorhanden wären. Eine schlechte Durchmischung trat auch auf, als versehentlich drei Mikroliter konzentrierter Ethanol-Farbstoffe direkt zu 0,5 Millilitern von zwei x-Zell-Suspensionen hinzugefügt wurden, was zu einer extrem schwachen und rechtsverzerrten Fluoreszenzintensitätsverteilung führte.

Hier typische Ergebnisse aus einem Proliferationsexperiment, in dem PKH 20 gefärbte mononukleäre Zellen des peripheren Blutes mit oder ohne Stimulatorium kultiviert wurden. Anti CD drei und IL zwei Reagenzien sind dargestellt. Nach 96 Stunden Kultivierung wurden die Zellen geerntet und mit Anti-CD, drei FE, Anti-CD 19 A PC und sieben A a d gegengefärbt.

In der ersten Gating-Strategie, einem Punktdiagramm von CD drei und sieben, wurden zwei verschiedene Gating-Strategien verglichen. A A D wurde verwendet, um lebende sieben a a d negative CD und drei positive T-Zellen auszuwählen. Eine Vorwärts- und Seitenstreuregion wurde dann verwendet, um große Aggregate auszuschleusen, während immer noch blastende Lymphozyten enthalten waren.

Die Gated-Ereignisse R eins plus R zwei für die ungefärbte Kontrolle werden durch das graue Histogramm dargestellt und die gefärbten, aber nicht stimulierten Zellen PKH 26 sind in blauer Note, die helle symmetrische homogene Färbung für lebensfähige, aber ungeteilte T-Zellen in der unstimulierten Kontrolle. Diese Daten wurden auf die gleiche Weise wie in der vorherigen Abbildung getaktet, aber in diesem Fall wurden die Zellen mit Anti-CD 3 und IL zwei stimuliert. Das PKH 26-Histogramm für Gated Events R eins plus R zwei enthält nun größtenteils geteilte Zellen mit reduzierter Intensität, die durch farbige Peaks für jede Tochtergeneration dargestellt werden.

Obwohl einige helle, ungeteilte Zellen noch im blauen Elternpeak verbleiben. Beachten Sie, dass sich die Intensität der stark geteilten Zellen noch nicht mit dem Bereich überschneidet, in dem ungefärbte Zellen gemessen werden, was die Schätzung von Metriken auf der Grundlage der Anzahl der Zellen in den Töchtergenerationen mit der niedrigsten Intensität hier verwirren würde. Es wurden die gleichen Daten analysiert wie in den beiden vorherigen Abbildungssätzen, aber nur die Lichtstreuung und CD drei wurden zur Selektion lebensfähiger T-Zellen verwendet.

Diese Gating-Strategie schließt viele, aber nicht alle toten Zellen aus, wie die kleine Restpopulation von sieben A a D positiven toten Zellen zeigt, die in den CD drei gegenüber sieben A A D Punktdiagrammen verbleiben. Die Wahl der Fluorochrome, die für die Immunphänotypisierung verwendet werden, kann bei der Verwendung von Zellverfolgungswerkzeugen zu schwierigen Kompensationsproblemen führen, da die Färbeintensität ungeteilter Zellen extrem hell ist. In diesem Experiment wurden 24 Stunden alte mononukleäre Zellen des peripheren Blutes mit PKH 26 markiert und dann mit Antikörpern gegen CD 3 und CD vier sowie einem Lebensfähigkeitsfarbstoff gegengefärbt.

In dieser Datenreihe wurden die Zellen, die mit zwei mikromolaren PKH 26 markiert waren, mit Anti-CD drei FZ sieben A a D und Anti CD vier A PC gegengefärbt und dann unter Verwendung der gleichen Gating-Strategie R eins plus R zwei wie zuvor analysiert, da es nur eine geringe Überlappung von PKH 26 mit dem A PC-Kanal gibt. CD vier positive und negative Ereignisse wurden eindeutig aufgelöst, unabhängig davon, ob eine Kompensation angewandt wurde oder nicht. Diese Daten veranschaulichen, dass die lebensfähigen Zöliakie-, drei positiven Zöliakie-, vier positiven T-Zellen auch dann gut aufgelöst blieben, wenn die endgültige PKH-26-Konzentration auf vier Mikromolaren erhöht wurde. Die Verwendung von Anti-CD vier pro CP in Kombination mit Anti-CD drei FE zwei mikromolaren PKH 26 und dem Viability Die zu Pro Drei führte aufgrund der signifikanten Überlappung von PKH 26 in den Pro-CP-Kanal zu wesentlich schlechteren Ergebnissen.

CD vier positive und negative Zellen konnten in unkompensierten Daten nicht voneinander aufgelöst werden und waren nur marginal aufgelöst, wenn eine Kompensation angewendet wurde. Die Erhöhung der endgültigen PKH-26-Konzentration auf vier Mikromolare führte zu einem vollständigen Verlust der Fähigkeit, CD-4-positive von CD-4-negativen Ereignissen aufzulösen, selbst nachdem die Kompensation angewendet wurde. Es ist zu beachten, dass die Proben, die Anti-CD vier pro CP enthielten oder fehlten, im Wesentlichen identisch waren.

Wenn ein Farbstoffverdünnungsprofil mit Hilfe einer Peak-Modellierungssoftware analysiert wird, um die Häufigkeit von Zellen in aufeinanderfolgenden Tochtergenerationen zu schätzen, können die Positionen und/oder Breiten der aufeinanderfolgenden Tochterpeaks fest oder schwebend sein. In Bezug auf die Werte für den elterlichen Peak. Diese Werte wurden aus der nicht stimulierten Kontrolle geschätzt.

Zum Beispiel stammt dieses PKH 26-Intensitätsprofil aus einer unstimulierten 96-Stunden-Kultur von einem moderaten Responder und wurde verwendet, um dem Mod-Fit-Proliferationsassistenten die erste Schätzung der Position und Breite für den Peak zu liefern, der ungeteilte Elternzellen darstellt. Die Verwendung einer festen Einstellung für die Peakposition erfordert, dass der Mittelwert für jeden Generationenpeak genau die Hälfte der Fluoreszenzintensität des vorherigen Peaks beträgt. Eine Gleitkommaeinstellung für die Peakposition ermöglicht es, die endgültigen Positionen der Generationspeaks je nach Bedarf von den erwarteten Intensitäten zu variieren, um die beste Anpassung zu erzielen.

In ähnlicher Weise erfordert eine feste Einstellung für die Peakbreite, dass die Breite jedes Generationspeaks mit der des übergeordneten oder nicht stimulierten Kontrollpeaks identisch ist. Eine Gleitkommaeinstellung für die Spitzenbreite ermöglicht es, die endgültigen Breiten nach Bedarf unabhängig voneinander zu variieren, um die beste Anpassung in dieser Tabelle zu erhalten. Für diese Spender werden die Ergebnisse der Analysen der vorangegangenen Zahlen für zwei verschiedene Spender gezeigt, bei denen sich unterscheidbare Generationsspitzen zeigten.

Die besten reduzierten Chi-Quadrat-Werte wurden erzielt, wenn sowohl die Peakposition als auch die Breite für Proliferationsprofile, bei denen keine unterscheidbaren Generationenpeaks erkennbar sind, floaten gelassen wurden, eine feste Einstellung für die Peakposition empfohlen wurde. Diese Daten veranschaulichen die Verwendung von zwei Tracking-Farbstoffen zur separaten Überwachung der Proliferationsgeschichten verschiedener Immunzelltypen in einem durchflusszytometrischen Immunsuppressionsassay. Die in Grün gezeigten T-Effektorzellen wurden mit CFSE und die in Blau gezeigten T-regulatorischen Zellen mit der Zellansicht markiert.

Claret-markierte Zellpopulationen wurden in unterschiedlichen Verhältnissen beigemischt und in Gegenwart von Anti-CD 3, Anti-CD 28 und bestrahlten akzessorischen Zellen für 96 Stunden kultiviert. Danach wurden die Zellen geerntet und mit Anti-Zöliakie vier, PE Größe sieben und lebendem totem Violett gefärbt. Hier. Repräsentative Daten für ein Treg-zu-T-Effektorverhältnis von 0,25 zu eins werden nach dem Ausscheiden lebender toter violetter positiver Zellen gezeigt.

Es wurde ein Lichtstreu-Gate angewendet, das Lymphozyten und Blasten umfasste, aber Aggregate und Trümmer ausschloss, gefolgt von einem Gate, das positive Zöliakie-4-Ereignisse einschloss. Die Claret-Färbung in der Zellansicht ermöglichte eine einfache Unterscheidung zwischen lebensfähigen Treg-Zellen und lebensfähigen T-Effektorzellen, die stark proliferiert waren, und daher wurden die CFSE-DIM-Proliferationsprofile für CFSE-positive T-Effektorzellen und die Zellansicht der Claret-positiven Treg-Zellen mit Hilfe einer Mod-Fit-Peak-Modellierungssoftware analysiert. Analysiert wurden ca. 25.000 Ereignisse.

Von diesen waren 48 % lebensfähige T-Effektoren, 6 % lebensfähige T-Effektoren, der Rest waren tote Zellen, akzessorische Zellen und Trümmer. Der berechnete Proliferationsindex, der die faltbare Zunahme der Zellzahl während des Assay-Zeitraums widerspiegelt, betrug 3,85 für T-Effektoren und 1,83 für Tregs. Hier wird der Einfluss der Tregs-Zellkonzentration auf den Proliferationsindex von T-Effektorzellen gezeigt, der aus dem CFSE-Farbstoffverdünnungsprofil berechnet wurde.

Die Ergebnisse waren die gleichen, unabhängig davon, ob die Treg-Zellen mit Cell View Claret markiert oder ungefärbt blieben, was darauf hindeutet, dass die Treg-Funktion durch die Färbung nicht verändert wurde. Bei erwartungsgemäßer Verfolgung nahm das Ausmaß der Tektorproliferation zu, da die Konzentration der Tregzellen verringert wurde. Die Proliferationsindizes der Treg-Zellen wurden auch aus den Verdünnungsprofilen der Bordeaux-Farbstoffe aus der Zellansicht bei unterschiedlichen Treg- und T-Effektorverhältnissen berechnet.

Erwartungsgemäß erfuhren die Tregs in Abwesenheit von T-Effektorzellen eine minimale Proliferation, da die Konzentration der T-Effektorzellen zunahm. Allerdings nahm auch das Ausmaß der Tregzellproliferation zu. Nachdem Sie sich das Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Zellverfolgungsfarbstoffe erfolgreich zur Überwachung der Zellproliferation einsetzen, wie Sie geeignete Fluorochrome und Farbkompensationssteuerungen auswählen und wie Sie ein geeignetes Modell zur Quantifizierung der Zellteilung auf der Grundlage der Farbstoffverdünnung auswählen.

Neben diesem Verfahren können auch andere Methoden zur Beantwortung experimenteller Fragestellungen durchgeführt werden, wie z. B. die Färbung antigenspezifischer T-Zellen oder die Flusssortierung zur Rückgewinnung von stammähnlichen Zellen, die ruhen oder sich langsam teilen. Vielen Dank fürs Zuschauen.