Name: Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: Lernen Sie die Quantifizierung von Immunzellteilungen mit Zell-Tracking-Farbstoffen und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht direkte Proliferationsmessungen in komplexen Zellpopulationen.

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Die Autoren möchte besonders den folgenden Personen für ihre technischen und intellektuellen Beiträge zur Entwicklung dieser Methoden im Laufe der Jahre danken: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science und PTI Research) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), und Mary Waugh (Dartmouth Medical School). Sie würden auch gerne die Bowdoin Klasse von 2006 aus den jährlichen Kurse in Forschung Methoden und Anwendungen der Durchflusszytometrie, die die Daten in Abbildung 2 dargestellt generiert danken. Durchflusszytometrie wurde am Roswell Park Cancer Institute Durchflusszytometrie Laboratory, die zum Teil durch Geräte Zuschüsse aus dem NIH Gemeinsame Instrument Programm wurde durchgeführt, und erhält Unterstützung von der Core-Stipendium (5 P30 CA016056-29) von der NationalCancer Institute der Roswell Park Cancer Institute und an der Abramson Cancer Center Durchflusszytometrie und Zellsortierung Ressource Laboratory der University of Pennsylvania, die zum Teil von Geräten Zuschüsse aus dem NIH Gemeinsame Instrument Program wurde gegründet und erhält Unterstützung von NIH # 2P30 CA016520 vom National Cancer Institute. Die Arbeit in den Abbildungen 3 und 5 gezeigt wurde teilweise auch durch SBIR Zuschuss EB00228 unterstützt von den National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) verliehen PTI Research, Inc.

Ein. Allgemeine Membrane Markierung mit PKH26 Handy-Tracking Dye (Ref. 25; Abbildung 1) <ol><li> Verwenden Sie sterile Technik für Schritte von 1,1 bis 1,9. Planen ~ 10 7 humanen peripheren mononukleären Blutzellen oder Lymphozyten (hPBMC, HPBL) unter Verwendung des Labors Standardmethode unter Zusatz eines endgültigen 300 xg Spin die Thrombozytenfunktion Kontamination zu minimieren. Resuspendieren Zellen bei 10 7 / ml in HBSS +1% BSA und auf Eis stellen, Reservierung eines 500 ul Aliquot (5x10 6 Zellen) für den Einsatz in Schritt 2. </li><li> Ort 5x10 6 Zellen (500 ul) in einem 12 x 75 mm konische Polypropylen-Röhrchen. Waschen Sie einmal mit 3,5 ml HBSS. Vorsichtig den Überstand aspirieren, so dass nicht mehr als 15-25 ul von Restflüssigkeit, aber dabei nicht um Zellen zu entfernen. Dieses Röhrchen eine 2x Zellsuspension in Schritt 1,4 vorzubereiten. </li><li> Während der Zelle Waschen in Schritt 1.2, 0,5 ml Verdünnungspuffer C Kennzeichnung Fahrzeugs (von der PKH26GL kit) zu einem 12 x 75 mm konischen Polypropylen-Röhrchen. Dieses Röhrchen zu prepsind ein 2x PKH26 Lösung in Schritt 1.5. </li><li> 0,5 ml Verdünnungspuffer C Kennzeichnung Fahrzeugs zu der gewaschenen Zellpellet aus Schritt 1.2 und aspirieren und abzugeben 3-4 mal, um eine einzelne Zellsuspension (2x Zellen) erhalten. Vermeiden Sie Blasenbildung und übermäßige Vermischung, die die Lebensfähigkeit der Zellen und Recovery reduzieren kann. </li><li> Unmittelbar nach der Herstellung der 2x Zellsuspension in Schritt 1,4, bereiten Sie einen 2x (4 uM) Farbstofflösung durch Zugabe von 2,0 ul von 1,0 mM PKH26 Farbstoff Lager in Ethanol (aus dem PKH26GL Kit) zur Diluent C Rohr in Schritt 1,3 und Vortex vorbereitet verteilen gleichmäßig. </li><li> Unmittelbar nach der Herstellung der 2x Farbstofflösung in Schritt 1,5, schnell pipettieren 2x Zellsuspension aus Schritt 1.4 in den 2x Farbstofflösung und gleichzeitig absaugen und verzichten 3-4 mal vollständig zerstreuen Zellen in Farbstoff nicht tun sollten:. Hinzuzufügen 1,0 mM Farbstoff direkt an Zellen; gießen 2x Zellen in 2x Farbstoff; oder fügen 2x Zellen Farbstoff 2x unter Vortexen. Da Färbung ist fast augenblicklich, wie Methoden weniger Ertrageinheitliche Intensitäten als die empfohlene Methode (Abbildung 2). </li><li> Nach 1 min, 1,0 ml hitzeinaktiviertes Serum oder HBSS + 5% BSA an Farbstoffaufnahme in die Zellmembranen zu stoppen. Andernfalls ausreichend Protein zu verwenden riskiert die Bildung von Farbstoff-Aggregaten, die mit Zellen können Pellet während der Waschschritte und unbeabsichtigte Kennzeichnung von anderen Zellen in einem Experiment. Wenn Medium mit 10% hitzeinaktiviertem Serum (CM) oder HBSS 1% BSA ist als Stop-Reagenz verwendet werden, durchzuführen Anfärben in einem 15 ml konischen Polypropylen-Röhrchen hinzu und mindestens 5,0 ml Stoppreagenz zur Adsorption aller versichern unincorporated Farbstoff. </li><li> Zentrifugieren Sie die markierten Zellen für 5 min @ ~ 400 x g. Vorsichtig den Überstand aspirieren, ohne Zellen. Waschen des Pellets zweimal mit 4 ml HBSS CM oder 1% BSA, Dispergieren des Pellet gut vor erneuter Zentrifugation. Zur Übertragung von Farbstoff auf Rohrwänden adsorbiert minimieren und Reinigungswirkung, übertragen die Zellen in ein frisches Polypropylenröhrchen nach dem first Resuspension. Hinweis: ausreichend gefärbten Zellen wird eine deutliche rosa Schimmer im Pellet aufweisen. </li><li> Resuspendieren der gewaschenen Zellpellet in 1,0 ml HBSS +1% BSA. Zählen Sie die Zellen, zu bestimmen Erholung der Zellen, und die Lautstärke um eine Endkonzentration von 10 7 / ml geben. Bei sorgfältiger Aspiration, sollte die Erholung der Zellen ≥ 85% betragen. Wenn die Erholung der Zellen &lt;70%, die Ursache ermitteln, bevor Sie fortfahren. Ziehen Sie eine 150 ul Aliquot (1.5x10 6 Zellen) und auf Eis für den Einsatz in Schritt 2. </li></ol> 2. Vorbereitung der Instrumente und Assay-Setup Controls (Tabelle 1) <ol><li> Aliquot 50 ul (5x10 5) ungefärbter Zellen aus der Zellsuspension im Schritt 1.1 in jedem von fünf 1,8 ml Eppendorf-Röhrchen gespeichert: 1, 3, 4, 5 und 7. Aliquot 50 ul (5x10 5) des PKH26 pos Zellen aus Schritt 1.9 in jede der drei Röhren: 2, 6 und 8. </li><li> Fügen Sie 10 ul IgG-Block (100 ug / Rohr IgG; siehe Tabelle der Reagenzien), um Tubes 1-8und 10 min bei Raumtemperatur (20-25 ° C) inkubiert. </li><li> Hinzufügen eines sättigenden Menge des Antikörpers (e) in Tabelle 1 bis Rohre 4, 5, 7 gezeigt, und 8 und inkubieren alle Proben (Tubes 1-8) 30 min lang bei Umgebungstemperatur und vor Licht geschützt. </li><li> 1,5 ml HBSS 1% BSA auf allen Proben, Pellet die Zellen durch Zentrifugation (5 Min. bei 400 × g) und wäscht einmal mit 1,5 ml HBSS 1% BSA, bei sorgfältiger Aspiration zu vermeiden Zellverlust. </li><li> Resuspendieren jede Probe in 500 ul HBSS +1% BSA. Wenn für Proben auf Ihrem Durchflusszytometer analysiert werden benötigt, um ein 12 x 75 mm Rundbodengefäß übertragen. Fügen Sie 10 ul von 100 ug / ml 7-AAD täglichen Arbeitszeit Lager (siehe Tabelle der Reagenzien), um Rohre 3, 6, 7 und 8, wie in Tabelle 1 angegeben. Inkubieren auf Eis für 30 min vor der im Durchflußzytometer setup und Färbung Überprüfung (Schritt 3) zu verwenden. </li></ol> 3. Durchflusszytometer Setup und Färbung Verification <ol><li> Stellen Sie sicher, dass der Fluss cytometer einwandfrei funktioniert, mit der Labor etablierten Verfahren für die tägliche Qualitätskontrolle. Überprüfen, dass Signale, kann ohne weiteres in jedem spektralen Fenster verwendet werden detektiert werden, und daß Detektorreaktionen linear proportional zur Intensität in dem Fenster für die Proliferation Überwachung 14 verwendet werden signalisieren. </li><li> Erwerben FSC vs SSC Daten für Rohr 1 mittels linearer Anzeige Waage. Passen eines jeden Detektors, so dass die Amplifikation Lymphozytenpopulation in dem unteren linken Quadranten des Dot-Plot fällt, ist nicht außerhalb des Messbereichs in beiden Parameter, und wird nicht unterbrochen durch Schwellenwertbildung. Sammle ungated FSC vs SSC Daten für alle Proben in den Schritten von 3,3 bis 3,7. </li><li> Erfassung von Daten für Rohr 1 mit keine Farbe Entschädigung und logarithmische Darstellung Skalen für alle 4 Fluoreszenzdetektoren. Stellen Sie die einzelnen Detektors Hochspannung (HV), um die Autofluoreszenz von ungefärbten Lymphozyten auf der Skala stellen mit wenigen / keine Zellen, der sich in den ersten Kanal. Stellen Sie eine Analyse Grenze für jedes Histogrammentsprechend dem hellsten 2% ungefärbter Zellen. </li><li> Mit keine Farbe Entschädigungen und der HV-Einstellungen in den Schritten 3,2 und 3,3 festgelegt, erwerben Daten für Tube 2, Sammeln FSC, SSC und Signale in allen 4 Fluoreszenz-Detektoren. Für den Detektor verwendet, um PKH26 Fluoreszenz zu überwachen, ob alle PKH26 pos Zellen auf der Skala erscheinen als einem einzigen symmetrischen Peak in der 3 rd -4 th Jahrzehnt mit wenigen / ohne Zellen in der letzten Kanal. Wenn es mehrere Gipfel sind oder Peakform schief ist, wiederholen Sie Schritt 1 mit besonderer Aufmerksamkeit zur Minimierung und Mischtechnik (Abbildung 2) salzen. Falls erforderlich, Farbstoffkonzentration. </li><li> Mit Einstellungen in Step 3,3 etablierten erwerben Daten für Tube 3, Sammeln FSC, SSC und Signale in allen 4 Fluoreszenz-Detektoren. Für den Detektor verwendet, um 7-AAD-Fluoreszenz zu überwachen, zu überprüfen, ob 7-AAD pos Zellen oberhalb der 2%-Grenze in Schritt 3,3 festgelegt (dh die nicht-lebensfähigen Zellen gut gelöst werden fallenvon lebensfähigen 7-AAD neg Zellen). </li><li> Mit Einstellungen in Step 3,3 etablierten erwerben Daten für Rohr 4, das Sammeln FSC, SSC und Signale in allen 4 Fluoreszenz-Detektoren. Überprüfen Sie, dass CD8 pos Zellen gut aus ungefärbten Zellen (dh, fall über der 2%-Grenze in Schritt 3,3 für die FITC-Detektor aufgebaut) gelöst. Wiederholen Sie mit Tube 5 und sicherstellen, dass CD8 pos Zellen gut aus ungefärbten Zellen (dh Herbst über der 2%-Grenze in Schritt 3,3 für die APC-Detektor aufgebaut) gelöst. </li><li> Mit Einstellungen in Step 3,3 etablierten erwerben Daten für Rohre 6, 7 und 8, Sammeln FSC, SSC und Signale in allen 4 Fluoreszenz-Detektoren. </li><li> Verwenden Sie die List-Modus Dateien für Tubes 1-5 und Ihre Farbkompensation Software, um eine Farbe zu etablieren überschneiden Matrix für jedes Fluorochrom in den Detektoren eingesetzt, um die drei anderen Fluorochromen Überwachung gesammelt. Wenden Sie diese Matrix List-Mode-Datei für die Probe 6 und sicherstellen, dass die Anwesenheit von PKH26 labeling verändert nicht die Fähigkeit, 7-AAD pos Zellen nachzuweisen. </li><li> Übernehmen die Farbe überlagern Matrix aus Schritt 3,8 bis List-Mode-Datei für die Probe 7 und sicherstellen, dass: a) 3 gut gelöst Subpopulationen (CD3 neg CD4 neg, CD3 pos CD4 neg und CD3 pos CD4 pos) auf einem FITC vs identifiziert werden können APC Dot-Plot, und b) die Anwesenheit von anti-CD3-FITC und anti-CD4-APC verändert nicht die Fähigkeit, 7-AAD pos Zellen nachzuweisen. Wenn das Vorhandensein von Anti-CD3-FITC verändert die oberen 2%-Grenze für Daten auf dem PKH26 Detektor erfasst, stellen die Grenze nach Bedarf. </li><li> Übernehmen Sie die Farbüberlappung Matrix aus Schritt 3,8 bis List-Mode-Datei für Probe 8. Wenn das Vorhandensein von PKH26 Kennzeichnung ändert sich die 2%-Grenze für das FITC, 7-AAD oder APC Detektoren von den Set mit der Autofluoreszenz-Steuerung in Schritt 3,3, stellen die Grenze (n) nach Bedarf mit Rohr 7 der Tabelle 1 und sicherzustellen, dass es ist dennoch möglich, distinguish CD3 pos CD4 pos, CD3 pos CD4 neg und CD3 neg CD4 neg Zellen unter Verwendung des eingestellten Grenze (n). </li></ol> 4. Proliferation Modellauswahl für die Zellteilung Überwachung von Dye Dilution <ol><li> Bestimmen Sie den Abstand zwischen den Generationen, die abhängig von der Anzahl der Kanäle und logarithmische Jahrzehnten auf Ihrem Zytometer ist. Für digitale Instrumente, wird dieser Wert, typischerweise 4 oder 5 Jahrzehnten durch die Anzahl der Behälter in dem digitalen Signalprozessor bestimmt. Bei analogen Instrumenten, wo die Zahl der Jahrzehnte selten ist eine ganze Zahl, erfordert eine genaue Modellierung die genaue Anzahl der Jahrzehnte experimentell bestimmt werden. Um dies zu tun, werden die Daten aus einer Mischung von kalibrierten fluoreszierenden Kügelchen in die herstellerspezifische zugeordneten relativen Intensitäten bei denselben Detektor Hochspannungs-Einstellungen in dem Experiment verwendet erworben. Die Position der Peaks Wulst direkt für die Kalibrierung der logarithmischen Skala in Bezug auf intichte Bereich pro log Jahrzehnt. Konkret wird dies durch Auftragen der Kanalnummer für jedes Kügelchen Typs gegen den log des herstellerspezifischen zugewiesenen Wert durchgeführt. Die Steigung einer Best-Fit-Geraden für den Wulst Datenwerte gibt die Anzahl der relativen Intensität pro Kanal. Multipliziert mit der Anzahl der Kanäle, wird dieser Wert dann die Anzahl von Log Jahrzehnten für die volle Skala, von dem die Anzahl von Kanälen, die einem Zwei-fache Abnahme der Intensität (dh Tochtergeneration Abstand) 14 berechnet werden kann. </li><li> Entscheiden für einen festen Abstand zwischen den Generationen verwenden, bzw. dass der Abstand zu schweben. A Standard (fest) Einstellung verwenden, den Generationswechsel Abstandswert in Schritt 4,5 ermittelt, um die Position einer jeden Generation zuzuordnen und wird normalerweise verwendet, wenn das Histogramm fehlt deutliche Spitzen. Ein Float Einstellung erlaubt es jedem Generationswechsel Spitzenposition durch das Histogramm Form bestimmt werden und wird normalerweise verwendet, wenn distinguishable Generationswechsel Gipfel sind evident. </li><li> Entscheiden Sie, ob eine feste Peakbreite für alle Generationen oder einer schwimmenden Breite zu verwenden. Ein fester Breite verwendet die SD berechnet für den unstimulierten Kontrollprobe alle Generationen modellieren und wird in der Regel dann gewählt, wenn die Probe fehlt unterscheidbare Generationswechsel Gipfel. Eine schwimmende Breite erlaubt das Programm unabhängig voneinander variieren die SD für jede Generation und wird am besten mit unterscheidbaren Generationswechsel Peaks verwendet. </li><li> Führen Sie ein Programm mit einer Verbreitung Analyse-Modul (hier ModFit LT Version 3.3). Legen Sie die stimulierte PKH26 pos-Datei aus den Daten zu analysierenden (zB ein stimuliert 96 Stunden-Kultur PKH26 pos Zellen gegengefärbt für Rohr 8 in Tabelle 1). </li><li> Wählen Sie die Parameter für die Analyse, in diesem Fall PKH26 (585/42) gated auf lebensfähigen (7-AAD neg) CD3 pos Lymphozyten und FSC vs SSC kleine Schutt und großen Aggregaten (Abbildung 3) auszuschließen. Bei der Festlegungdiese Regionen vorsichtig sein, um den hohen Vorwärtsstreuung Gebiet, wo Blasten typischerweise gefunden werden, gehören und beachten Sie, dass CD3 Expression kann down-moduliert stimulierten Kulturen. </li><li> Erstellen Sie eine neue Verbreitung Modell mit der Proliferation Wizard. Mit dem Open Data File (Registerkarte Start), laden Sie die unstimulierten PKH26 pos Control-Datei und den Speicherort der Spitze Kanal in der elterlichen Verteilung entsprechend ungeteilten Zellen. </li><li> Analysieren Sie die Datei für den unstimulierten PKH26 pos Kontrolle, unter Hinweis auf die Werte für die elterliche Spitzenposition und Breite (Standardabweichung). Wenn eine feste Peakbreite (SD) gewünscht wird, überprüfen Sie sperren SD. </li><li> Legen Sie die PKH26 neg Kontrolle (z. B. eine 96 Stunden-Kultur PKH26 neg Zellen gegengefärbt für Rohr 7 in Tabelle 1). Anpassen der Anzahl der Generationen, indem die Peak-Kanal für den dunkelsten Generation über dem PKH26 neg. Kontrolle. Dies bestimmt die number der Tochter Generationen das Modell exakt passen und ist typischerweise 6-9 Generationen. </li><li> Öffnen Sie die Datei für die stimulierte Probe (zB eine stimulierte 96 Stunden-Kultur PKH26 pos Zellen gegengefärbt für Rohr 8 in Tabelle 1) und bestätigen, dass die Regionen für die elterliche Spitzenposition und des SD, wie in Schritt 4,7 festgelegt sind, unverändert bleiben. Wenn feste Generationen Abstand gewünscht wird, wählen Sie Standard-Modell Option, ansonsten wählen Sie die Option Frei. </li><li> Analysieren Sie jede experimentelle Datei im Datensatz, mit dem gleichen Modell in Schritt 4,9 definiert. Kleinere Anpassungen der elterlichen Spitzenposition kann, um die besten fit notwendigen definiert sowohl visuell als auch durch die reduzierte Chi-Quadrat (RCS)-Wert. </li><li> Notieren Sie die gewünschte Verbreitung Metriken aus dem Best-Fit für jeden experimentellen Datei im Datensatz. Für eine umfassende Beschreibung der möglichen Kennzahlen siehe Ref. 22. </li></ol>

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</ol>

K. Humphrey, JD Tario, Jr. und PK Wallace haben vorkommerziellen Zelle Tracking Reagenzien für die Auswertung von Life Technologies, Inc. und BD Biosciences erhalten. AD Bantly und JS Moore haben vorkommerziellen Zelle Tracking Reagenzien zur Auswertung erhalten von Life Technologies, Inc. und die Finanzierung von PTI Research, Inc. für die vorkommerzielle Charakterisierung verschiedener CellVue Zelle Tracking Farbstoffe. K. Muirhead wird durch SciGro, Inc., das beratende Dienstleistungen für Phanos Technologies, Inc. (Inhaber des PKH und CellVue Farbstoffe) und bietet Backup technischen Support für Sigma-Aldrich und Molekulares Targeting Technologies, Inc. (beschäftigt Distributoren davon Farbstoffe). Produktion und den freien Zugang zu diesem Artikel wird von Sigma-Aldrich gesponsert.

Die hier beschriebenen Methoden sind diejenigen in unserer gemeinsamen Labors gefunden, die meisten sicher geben, optimale Ergebnisse für hPBMC Kennzeichnung mit Membran Farbstoffe 13,16,18 und Lymphozyten Untergruppe Phänotypisierung und Proliferation Tracking entweder mit Membran-oder Protein-Farbstoffe 2,11,13,16, 18. Wie in den 1 und 2 dargestellt ist, ist hell einheitliche Kennzeichnung am leichtesten durch Begrenzung des Gehalts physiologische Salze und unter Verwendung eines Misch-Technik erreicht, dass zusätzlich eine schnelle, homogene Belichtung aller Zellen auf die gleiche Konzentration an Farbstoff. Weil Färbung mit Farbstoffen erfolgt Membran durch Partitionieren in die Lipid-Doppelschicht, können andere Variablen, die frei verändern Farbstoffkonzentration auch Auswirkungen Markierungseffizienz. Zum Beispiel die Kennzeichnung mit rundem Boden Polystyrolröhrchen Ergebnisse in weniger effizient Auswaschung von Salzen vor Resuspension in Diluent C und auch in reduzierten freien Farbstoffkonzentration durch Adsorption an Rohrwänden färben, insbesonderebei niedrigeren Farbstoffkonzentrationen. Beide Faktoren tendenziell breitere Färbung Distributionen, als wenn die Kennzeichnung erfolgt mit konischen Boden Polypropylenröhrchen (Abbildungen 3, 4 und geben unveröffentlichte Ergebnisse). Probe Alter und Art kann auch Auswirkungen Peakbreite selbst wenn optimierten Färbeverfahren verwendet werden. Zum Beispiel Lebensläufe PKH26 pos Lymphozyten aus frisch entnommenem Blut reichen von 14-20% (Abbildung 3, Nr. 13 und unveröffentlichte Ergebnisse), während Lebensläufe Lymphozyten von 24 Stunden alten Blutproben oder TRIMA Pherese Filter-Bereich isoliert 25 bis 30 % (Abbildung 4 und Nr. 18). Färbung Einheitlichkeit und das Ausmaß, in dem sie nicht lebensfähige Zellen von der Analyse ausgeschlossen werden kann sowohl Einfluss darauf, ob unterscheidbare Tochter Gipfel zeigt sich in der Farbstoffdilution Profil, was sich wiederum auf Wahl eines Verbreitung Modell, um die beobachteten Daten (Abbildungen 5 und 6 passen </strong&gt;). Obwohl ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) wird hier als ein Beispiel verwendet werden, um Software-Metriken wie Proliferationsindex und Zwischenprodukt Frequenz (Figuren 3, 5 und 6; Tabelle 3) zu erzeugen verwendet, andere Software-Module Pakete enthalten, zu analysieren Proliferation Daten. Dazu gehören FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) und FlowJo (Baum Star, Inc., Ashland, OR). Alle diese Programme verwenden eine nicht-lineare Analyse der kleinsten Quadrate, iterativ zu finden die beste Anpassung an den Rohdaten durch Veränderung der Position, Höhe und SD (oder Breite) der Gauß-Peaks, welche sequentielle Tochter Generationen. Proliferativen Index (PI) und Precursor Frequency (PF) sind die am häufigsten verwendeten Maßnahmen Ausmaß der Proliferation. PI, wie durch ModFit definiert ist, ist ein Maß für die Zunahme der Zellzahl im Verlauf des Assays, analog zu den &quot;Stimulationsindex &#39;eines Thymidinaufnahme Assay. PF gibt den Anteil der Zellen in der anfänglichen populatIonen, die auf den Stimulus von proliferierenden reagiert. Vorsicht ist geboten, aber beim Lesen der Literatur seit Terminologie variiert etwas zwischen den Software-Paketen (zB FlowJo und ModFit verwenden unterschiedliche Definitionen und Berechnungen für das, was durch die &quot;Proliferation Index&quot; gemeint) 22. Die kritischen Fragen hier für die Kennzeichnung und die Proliferation Analyse mit Membran Farbstoffe diskutiert werden auch auftreten, wenn unter Verwendung von Protein-Farbstoffe. Zum Beispiel muss sorgfältig auf Mischtechnik auch beobachtet, zusammen mit Ausschluss tot / sterbenden Zellen werden, um eine gleichmäßige Verteilung und unterscheidbar Tochter Peaks erhalten bei Verwendung CFSE (Abbildung 6) 2-4,13,18,24. Geeignete Wahl der Fluorochrome zur Phänotypisierung und Rentabilitätsprüfung ist auch wichtig zu übermäßigen spektrale Überlappung und die Unfähigkeit, Antikörper positiv Zellen erkennen zu vermeiden, insbesondere mit sichtbarem emittierenden Protein Farbstoffe wie CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;. Verminderung der Konzentration von Tracking Farbstoff vermindert die Kompensation Probleme in benachbarten spektralen Kanälen, sondern begrenzt auch die Anzahl der Zellteilungen, die überwacht werden können, bevor Tochterzelle Intensitäten mit Autofluoreszenz überschneiden beginnen. Alternativ können Sie auch neuere Zellen Tracking Farbstoffe wie weit rot emittierenden CellVue Claret (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) oder violett emittierenden CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) kann die Entschädigung Probleme (Abbildung 6) zu reduzieren. Schließlich, obwohl Farbstoffe Membran allgemein geringere Toxizität aufweisen 11,26 neigen, ist es möglich, über-Label-Zellen mit entweder Klasse von Farbstoff. Daher ist es immer notwendig, zu überprüfen, dass die Konzentration von Tracking verwendete Farbstoff wurde nicht die Funktionalität der Zellen verfolgt werden (Abbildung 6) 3,13,16,18 verändert.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz oder Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Im Handel erworben </td></tr><tr><td> 7-D Aminoactinomycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks balanced salt solution (HBSS) </td><td> Life Technologies </td><td> 14175-079 </td><td> Calcium und Magnesium frei, ohne Phenolrot </td></tr><tr><td> Human IgG Cohn-Fraktion II und III Globuline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> Maus-Anti-Human-CD3-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> Sättigungskonzentration von Labor-Titration </td></tr><tr><td> Maus-anti-human-CD4-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> Sättigungskonzentration von Labor-Titration </td></tr><tr><td> Maus-anti-human-CD4-PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> Sättigungskonzentration von Labor-Titration </td></tr><tr><td> Maus-anti-humanen CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> Sättigungskonzentration von Labor-Titration </td></tr><tr><td> Maus-anti-humanen CD8-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD0805 </td><td> Sättigungskonzentration von Labor-Titration </td></tr><tr><td> Maus-Anti-Human-CD19-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD1905 </td><td&gt; Sättigungskonzentration von Labor-Titration </td></tr><tr><td> Maus-Anti-Human-CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> Sättigungskonzentration von Labor-Titration </td></tr><tr><td> Maus-Anti-Human-CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> Sättigungskonzentration von Labor-Titration </td></tr><tr><td> Maus-anti-humanem CD3 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1,0 mg / ml; Azid freien </td></tr><tr><td> Maus anti-human CD28 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1,0 mg / ml; Azid freien </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 rot fluoreszierende Zellen Linker Kit mit 10-3M PKH26 in EtOH und Diluent C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PKH26GL-1KT oder MINI26-1KT </td><td> Verfahren in Schritt 1 gelten auchKits enthalten PKH67 oder andere CellVue Farbstoffe </td></tr><tr><td> CellVue Claret weit rot fluoreszierende Zellen Linker Kit mit 10-3M CellVue Claret in EtOH und Diluent C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MINCLARET-1KT oder MIDCLARET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (und-6)-Carboxyfluoresceindiacetat, Succinimidylester (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> C34554 </td><td> Nicht-fluoreszierenden; gespalten durch die Membran Esterasen zu bilden fluoreszierende aminoreaktiven Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD Fixierbarer Violet </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile 12 x 75 mm konische Polypropylenröhrchen &amp; Mützen </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> Eine bessere Membran Farbstoff Färbung Wirkungsgrad (reduzierte Farbstoffadsorption, weniger Zellverlust während Überstand Aspiration) </td></tr><tr><td> 12 x 75 mm round unten Polystyrolröhrchen </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> Durchflusszytometer </td><td> BD Bioscience </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> Jede Zytometer kann FITC, PKH26 und 7-AAD (ex. 488 nm.; Em 520 nm, 567 nm und 655 nm) zu erkennen und APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) </td></tr><tr><td> Durchflusszytometer </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII CyAn </td><td> Jede Zytometer kann FITC, PKH26 und 7-AAD (ex. 488 nm.; Em 520 nm, 567 nm und 655 nm) zu erkennen und APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Labor hergestellt </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, konzentrierten Lager </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 mg / ml in PBS. Frieren in Aliquots und bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, worKönig Stock </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 ug / ml in PBS; Vorbereitung von 1 mg / ml gefrorenen Vorrat täglich. </td></tr><tr><td> IgG-Block </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / ml Human IgG Cohn-Fraktion II und III Globuline + 10 mg / ml BSA. </td></tr></tbody></table>

optimiert färbung und proliferation modeling-methoden für die zellteilung Überwachung mit cell-tracking dyes

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluoreszierende Zelle Tracking Farbstoffe in Kombination mit Durchfluss-und Bildzytometrie, sind leistungsfähige Werkzeuge, mit denen die Interaktionen und Schicksale verschiedener Zelltypen in vitro und in vivo zu studieren. 1-5 Obwohl es buchstäblich Tausende von Publikationen mit solchen Farbstoffen, einige die am häufigsten auftretenden Zell-Tracking-Anwendungen sind die Überwachung von: <ol><li> Stamm-und Progenitorzellen Ruhe, Proliferation und / oder Differenzierung 6-8 </li><li> Antigen-angetriebenen Membrantransfer 9 und / oder Vorläufer Zellproliferation 3,4,10-18 und </li><li> immunregulatorische und Effektor-Zell-Funktion 1,18-21. </li></ol> Kommerziell erhältliche Zelle Tracking Farbstoffe weisen in Bezug Chemien und Fluoreszenzeigenschaften aber die große Mehrheit fallen in eine von zwei Klassen auf ihren Mechanismus Zellmarkierung basiert. &quot;Membrane Farbstoffe&quot;, verkörpert durch PKH26 sind stark lipophile Farbstoffe tHut Partition stabil, aber nicht kovalent in Zellmembranen 1,2,11. &quot;Protein-Farbstoffe&quot;, verkörpert durch CFSE, sind Amino-Reaktivfarbstoffen, die stabile kovalente Bindungen mit Zellproteinen 4,16,18. Jede Klasse hat ihre eigenen Vor-und Nachteile. Der Schlüssel zu ihrem erfolgreichen Einsatz, vor allem in multicolor Studien, in denen mehrere Farbstoffe verwendet werden, um verschiedene Zelltypen zu verfolgen, ist es daher, die kritischen Fragen, die optimale Nutzung der einzelnen Klassen 2-4,16,18,24 verstehen. Die Protokolle, die hier hervorzuheben drei häufigsten Ursachen für schlechte oder variable Ergebnisse bei der Verwendung von Zell-Tracking Farbstoffe. Diese sind: <ol><li> Nichtbeachtung helle, gleichmäßige, reproduzierbare Kennzeichnung zu erreichen. Dies ist ein notwendiger Ausgangspunkt für jede Zelle Tracking Studie, sondern erfordert Aufmerksamkeit auf verschiedene Variablen bei der Verwendung von Membran-Farbstoffe als bei Verwendung von Protein-Farbstoffe oder Gleichgewicht Bindungsreagenzien wie Antikörper. </li><li> Suboptimal Fluorochrom Kombinationen and / oder Nichtbeachtung enthalten kritische Entschädigung Kontrollen. Tracking Farbstofffluoreszenz ist in der Regel 10. Februar - 10. März Mal heller als Antikörper-Fluoreszenz. Es ist daher unerlässlich, um sicherzustellen, dass die Anwesenheit von Markierungsfarbstoff beeinträchtigt nicht die Fähigkeit, andere Sonden verwendet erkennen. </li><li> Failure, um eine gute Passform mit Peak-Modellierungs-Software zu erhalten. Solche Software ermöglicht quantitative Vergleich der proliferativen Reaktionen auf verschiedene Populationen oder Reize auf Vorstufe Frequenz oder anderen Metriken. Zur Erzielung eines guten Passform, erfordert jedoch Ausschluss von toten / sterbenden Zellen, die Farbstoffdilution Profile verzerren können und Abstimmung der dem Modell zugrundeliegenden Annahmen mit den Eigenschaften des beobachteten Farbstoffdilution Profil. </li></ol> Hier genannten Beispiele veranschaulichen, wie diese Größen beeinflussen Ergebnisse bei Verwendung Membran und / oder Protein-Farbstoffe, die Zellproliferation zu überwachen.

Erfolgreicher Einsatz von Zell-Tracking Farbstoffe Immunzellfunktion und Proliferation zu überwachen umfasst mehrere wichtige Schritte. Wir beschreiben Methoden zur: 1) Erhalten hell, einheitliche, reproduzierbare Label-ten mit Membran Farbstoffe; 2) Auswählen Fluorochrome und Datenerfassung Bedingungen, und 3) der Auswahl eines Modells, die Zellproliferation auf Farbstoffdilution zu quantifizieren.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluoreszierende Zellverfolgungsfarbstoffe sind in Kombination mit Durchfluss- und Bildzytometrie leistungsstarke Werkzeuge, um die Interaktionen und Schicksale von ... zu untersuchen.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, mithilfe von Zellmarkierungsfarbstoffen die Ausprägung der Zellteilung für verschiedene Immunzellsubpopulationen innerhalb komplexer Zellpopulationen direkt zu quantifizieren. Dazu wird zunächst die Ausgangszellpopulation mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, der eine stabile Bindung an zelluläre Proteine eingeht oder sich nicht-kovalent in zelluläre Membranen einlagert. Anschließend werden die markierten Zellen nach Stimulation gezählt, mit fluoreszierenden Antikörpern gefärbt und mittels mehrparametrischer Durchflusszytometrie analysiert, wodurch differenzielle Reaktionen zwischen den interessierenden Immunzelltypen nachgewiesen werden können. Als Kontrollen dienen jedoch unbehandelte Zellen ohne Markierungsfarbstoff, um die geringste Tochterzell-Fluoreszenzintensität festzulegen, die noch von der Eigenfluoreszenz abgegrenzt werden kann. Zudem werden mit Markierungsfarbstoff behandelte, aber nicht stimulierte Kontrollen verwendet, um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen, bei der ungeteilte Zellen detektiert werden. Die Stimulation führt typischerweise zu einem breiten Intensitätsspektrum, da sich proliferierende Zellen sukzessive verdunkeln, während Nicht-Responder unverändert bleiben.Schließlich ermöglicht die Verwendung von Software zur Peak-Modellierung zur Schätzung der relativen Häufigkeit von Zellen in verschiedenen Generationen einen quantitativen Vergleich der proliferativen Reaktionen zwischen unterschiedlichen Populationen oder Stimuli unter Verwendung von Kenngrößen wie Proliferationsindex oder Vorläuferfrequenz. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Markierung mit tritiiertem Thymidin oder der Expression von Ki-67 besteht darin, dass die CFSE-Verdünnung eine direkte Messung der Zellteilung liefert, die mit anderen durchflusszytometrischen Messungen wie der Immunphänotypisierung und der Zytokinproduktion kombiniert werden kann. Eine visuelle Demonstration der Methode zur Membranfarbstoff-Färbung ist hilfreich, da die Aufnahme des Farbstoffs durch die Zellen äußerst schnell erfolgt.Daher ist eine gute Technik entscheidend, um eine helle, homogene Färbung zu erzielen. Nach der Isolierung menschlicher peripherer mononuklearer Blutzellen diese fünf Minuten bei 300 × g und Raumtemperatur zentrifugieren, um eine Kontamination mit Thrombozyten zu minimieren. Anschließend das Zellpellet in HBSS mit 1 % BSA auf eine Konzentration von 10⁷ Zellen pro Milliliter resuspendieren und auf Eis stellen.Entfernen und reservieren Sie 500 Mikroliter Eloqua, überführen Sie dann eine weitere 500-Mikroliter-Aliquot von Zellen in ein 12 mal 75 Millimeter großes konisches Polypropylenröhrchen. Geben Sie 3,5 Milliliter HBSS hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 400 × g und Raumtemperatur. Während der Wäsche geben Sie 0,5 Milliliter Verdünnungsmittel C, das Markierungsmedium aus dem PKH-26-GL-Kit, in ein weiteres 12 mal 75 Milliliter großes konisches Polypropylenröhrchen. Aspirieren Sie vorsichtig den Überstand, wobei nicht mehr als 15 bis 25 Mikroliter Restflüssigkeit verbleiben dürfen, und achten Sie darauf, keine Zellen zu entfernen. Geben Sie anschließend 0,5 Milliliter Verdünnungsmittel C zum Zellpellet hinzu und aspirieren sowie dispensieren Sie die Lösung mehrmals, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.Bereiten Sie nun den zweifachen XD-Stammlösung vor, indem Sie zwei Mikroliter PKH 26 in das Röhrchen mit Verdünnungsmittel C geben. Erst danach pipettieren Sie unverzüglich die Zellsuspension in die frisch hergestellte zweifache PKH-26-Farbstofflösung und saugen die Mischung mehrmals gleichzeitig auf und geben sie wieder ab, um die Zellen gleichmäßig im Farbstoff zu verteilen. Nach einer Minute geben Sie ein Milliliter hitzeinaktiviertes Serum hinzu, um die Aufnahme des Farbstoffs in die Zellmembranen zu stoppen. Nach dem Zentrifugieren der Zellen saugen Sie vorsichtig den Überstand ab, ohne das Pellet zu entfernen.Verteilen Sie dann das Pellet in vier Milliliter komplettem Medium, das 10 % hitzeinaktiviertes Serum enthält, und überführen Sie die Zellsuspension in ein frisches Polypropylenröhrchen. Waschen Sie die Zellen zweimal ausreichend in HBSS mit 1 % BSA; ausreichend gefärbte Zellen zeigen eine deutliche rosa Färbung im Pellet. Nachdem Sie das Zellpellet in einem Milliliter HBSS mit 1 % BSA resuspendiert haben, zählen Sie die Zellen und stellen Sie anschließend das Volumen so ein, dass eine Endkonzentration von 10⁷ Zellen pro Milliliter erreicht wird. Verwenden Sie nach der Färbung der Zellen gemäß dem im Tabelle dargelegten Durchflusszytometrie-Protokoll die ersten fünf Röhrchen, um die Parameter für Forward Scatter und Side Scatter sowie die Signale in allen vier Fluoreszenzdetektoren einzustellen.Insbesondere für den Detektor, der verwendet wird, um die PKH-26-Fluoreszenz in Röhrchen zwei zu überwachen. Überprüfen Sie, ob alle mit PKH 26 gefärbten Zellen auf der Skala als einzelner, symmetrischer Peak im dritten bis vierten Dekadenbereich erscheinen, wobei nur wenige bis keine Zellen im letzten Kanal vorhanden sein sollten. Verwenden Sie anschließend die Farbkompensationssoftware und die im Listmodus für die Röhrchen eins bis fünf gesammelten Dateien, um eine Überlappungsmatrix für jede Farbstoffemission in den Detektoren zu erstellen, die zur Überwachung der drei anderen Fluorochrome eingesetzt werden.Wenden Sie dann diese Matrix auf die List-Modus-Datei für Probe sechs an, um zu überprüfen, ob das Vorhandensein der PKH26-Markierung die Fähigkeit zur Detektion von seven A a D positiven Zellen beeinträchtigt. Wenden Sie nun diese neu erstellte Farbüberlappungsmatrix auf die List-Modus-Datei für Rohr sieben an.Identifizieren Sie die CD3-positive, CD4-negative und CD3-positive, CD4-positive Populationen in einem FE- vs. PC-Diagramm. Bestätigen Sie, dass das Vorhandensein von anti-CD3, FE und anti-CD4, PC die Fähigkeit zum Nachweis von 7AAD-positiven Zellen nicht beeinträchtigt. Wenden Sie abschließend die Farbüberlappungsmatrix für Röhrchen sieben auf die List-Mode-Datei für Röhrchen acht an.Öffnen Sie nun ein Programm mit einem Proliferationsanalyse-Modul. Laden Sie die stimulierungsbedingte PKH26-gefärbte Datei aus dem zu analysierenden Datensatz. Wählen Sie anschließend die Parameter für die Analyse aus, in diesem Fall PKH26, gezielt auf vital-positive, 7-AAD-negative, CD3-positive Lymphozyten, sowie Vorwärtsstreuung gegen Seitwärtsstreuung zur Ausschließung kleiner Trümmer und großer Aggregate.Bei der Definition dieser Bereiche darauf achten, den Bereich mit hoher Vorwärtsstreuung einzuschließen, in dem sich typischerweise Blasten befinden. Öffnen Sie anschließend den Proliferationsassistenten. Klicken Sie auf die Registerkarte „Start“, um die Datendatei zu öffnen, und laden Sie dann die unbehandelte PKH-26-positiven Kontrolle.Definieren Sie die Position des Eltern-Peaks, der den ungeteilten Zellen entspricht. Analysieren Sie die Datei und notieren Sie die Werte für die Position und Breite des Eltern-Peaks. Falls eine feste Peakbreite gewünscht ist, aktivieren Sie die Option „lock SD“, laden Sie die PKH 26-negative Kontrolle und passen Sie die Anzahl der Generationen an, indem Sie den Peak-Kanal für die dimme Tochtergeneration über den PKH 26-negativen Zellen einstellen.Dies legt die Anzahl der Tochtergenerationen fest. Das Modell kann genau anpassen, wenn es abgeschlossen ist. Laden Sie die stimulierte PKH 26-positive Datei erneut.Wenn unterscheidbare generationsbedingte Peaks erkennbar sind, wählen Sie die Einstellung „floating“ unter der Modell-Option. Wenn die logarithmischen Dekaden nicht exakt 4,0 betragen, passen Sie den Abstand zwischen den Generationen wie im Artikel beschrieben an. Analysieren Sie nun die stimulierte Probe und bestätigen Sie, dass der Bereich für die Position des Eltern-Peaks unverändert bleibt.Wählen Sie abschließend für jede experimentelle Datei im Datensatz die Analyse aus, um das soeben erstellte Modell anzuwenden, und notieren Sie die gewünschten Proliferationsmetriken, die sich aus der besten Anpassung für jede experimentelle Datei im Datensatz ergeben. Diese erste Datenserie veranschaulicht den Einfluss der Mischtechnik auf die PKH-26-Fluoreszenzverteilungen.Beim Kultivieren wurden U 9 37-myeloide Zellen mit dem Zellmarkierungsfarbstoff unter Verwendung der gerade beschriebenen Methode gefärbt; dieses erste Histogramm zeigt die Daten der ungefärbten Kontrolle. Die Einstellungen des Durchflusszytometers wurden so angepasst, dass die Autofluoreszenz dieser Zellen im ersten Dekadenbereich lag, wobei keine oder nur sehr wenige Zellen im ersten Kanal angesammelt wurden. Dieses zweite Histogramm veranschaulicht eine gute PKH 26-Färbung.Das schnelle Mischen von zwei x Zellen mit zwei x Farbstoff ergab eine Fluoreszenzverteilung, die hell, homogen und symmetrisch war, jedoch bei den für das vorherige Histogramm verwendeten Instrumenteneinstellungen keine übersteuernden Zellen aufwies. Wurden zwei x Zellen zwei x Farbstoff ohne unmittelbares Mischen hinzugefügt, erhielt man eine heterogenere Fluoreszenzverteilung. Diese kleine Teilpopulation schwach markierter Zellen würde fälschlicherweise als Tochterzellen interpretiert, wenn sie zu einem späteren Zeitpunkt im endgültigen Histogramm dieses Experiments vorhanden wäre. Schlechtes Mischen trat ebenfalls auf, als versehentlich drei Mikroliter konzentrierter Ethanol-Farbstoff-Lösung direkt zu 0,5 Millilitern zweier x Zellsuspension gegeben wurden, was eine äußerst schwache und nach rechts schiefe Fluoreszenzintensitätsverteilung ergab.Hier sind typische Ergebnisse eines Proliferationsexperiments, bei dem PKH-26-gefärbte humane periphere mononukleäre Blutzellen mit oder ohne stimulierende Anti-CD3- und IL-2-Reagenzien kultiviert wurden. Nach 96 Stunden Kultivierung wurden die Zellen gesammelt und mit Anti-CD3, FE, Anti-CD19, APC und 7-AAD nachgefärbt.Es wurden zwei verschiedene Gating-Strategien verglichen. Bei der ersten Gating-Strategie wurde ein Dotplot von CD drei gegen sieben A A D verwendet, um lebende sieben A A D-negative, CD-drei-positive T-Zellen auszuwählen. Anschließend wurde ein Vorwärts- und Seitenstreu-Bereich genutzt, um große Aggregate auszuschließen, während weiterhin blastische Lymphozyten eingeschlossen wurden.Die R1 plus R2-gategegebenen Ereignisse für die unbehandelte Kontrolle werden durch das graue Histogramm dargestellt, und die PKH26-gefärbten, aber nicht stimulierten Zellen sind in Blau dargestellt. Beachten Sie die helle, symmetrische, homogene Färbung für lebensfähige, aber nicht geteilte T-Zellen in der unbehandelten Kontrolle. Diese Daten wurden auf die gleiche Weise wie in der vorherigen Abbildung gategegeben, allerdings wurden in diesem Fall die Zellen mit anti-CD3 und IL-2 stimuliert. Das PKH26-Histogramm für die R1 plus R2-gategegebenen Ereignisse enthält nun hauptsächlich geteilte Zellen mit reduzierter Intensität, dargestellt durch farbige Peaks für jede Tochtergeneration.Obwohl einige helle, ungeteilte Zellen weiterhin im blauen elterlichen Peak verbleiben. Beachten Sie, dass die Intensität der stark geteilten Zellen noch nicht mit dem Bereich überlappt, in dem unmarkierte Zellen gemessen werden, was die Schätzung von Kenngrößen, die auf der Anzahl der Zellen in den Tochtergenerationen mit der niedrigsten Intensität basieren, verfälschen würde. Dieselben Daten wurden wie bei den beiden vorherigen Abbildungssätzen analysiert, jedoch wurden nur Lichtstreuung und CD drei zur Selektion lebensfähiger T-Zellen verwendet.Diese Gating-Strategie schließt viele, aber nicht alle toten Zellen aus, wie durch die kleine verbleibende Restpopulation von sieben A a D-positiven toten Zellen in den CD-drei-gegenüber-sieben-A-A-D-Dot-Plots gezeigt wird. Die Wahl der für die Immunphänotypisierung verwendeten Fluorochrome kann bei Verwendung von Zellmarkierungs-Farbstoffen schwierige Kompensationsprobleme verursachen, da die Färbungsintensität ungeteilter Zellen äußerst hell ist. In diesem Experiment wurden 24 Stunden alte periphere mononukleäre Blutzellen mit PKH 26 markiert und anschließend mit Antikörpern gegen CD drei und CD vier sowie einem Vitalitätsfarbstoff nachgefärbt.In dieser Datenreihe wurden die Zellen, die mit zwei Mikromolar PKH 26 markiert waren, zusätzlich mit anti-CD3-FZ7A und anti-CD4-APC angefärbt und anschließend mit derselben R1-plus-R2-Gating-Strategie wie zuvor analysiert. Da es kaum eine Überlappung von PKH 26 in den APC-Kanal gibt, konnten die CD4-positiven und negativen Ereignisse eindeutig getrennt werden, unabhängig davon, ob Kompensation angewendet wurde. Diese Daten zeigen, wie die lebensfähigen CD3-positiven, CD4-positiven T-Zellen auch dann gut aufgelöst blieben, wenn die endgültige PKH-26-Konzentration auf vier Mikromolar erhöht wurde. Die Verwendung von anti-CD4-PerCP in Kombination mit anti-CD3-FE, zwei Mikromolar PKH 26 und dem Vitalitätsfarbstoff Pro3 führte zu deutlich schlechteren Ergebnissen aufgrund einer erheblichen Spektralüberlappung von PKH 26 in den PerCP-Kanal.CD-vier-positive und negative Zellen konnten in uncompensierten Daten nicht voneinander getrennt werden und waren nur geringfügig auflösbar, wenn eine Kompensation angewendet wurde. Eine Erhöhung der endgültigen PKH-26-Konzentration auf vier Mikromolar führte zu einem vollständigen Verlust der Fähigkeit, CD-vier-positive von CD-vier-negativen Ereignissen zu unterscheiden, selbst nach Anwendung der Kompensation. Beachten Sie, wie die Proben mit oder ohne anti-CD-vier pro CP im Wesentlichen identisch waren.Wenn ein Farbstoffverdünnungsprofil mithilfe einer Software zur Peakmodellierung analysiert wird, um die Häufigkeit von Zellen in aufeinanderfolgenden Tochtergenerationen zu schätzen, können die Positionen und/oder Breiten aufeinanderfolgender Tochterpeaks festgelegt oder variabel sein, bezogen auf die Werte des elterlichen Peaks. Diese Werte werden aus der unbehandelten Kontrolle geschätzt.Beispielsweise stammt dieses PKH-26-Intensitätsprofil aus einer unbehandelten 96-Stunden-Kultur eines mittleren Reagierenden und wurde verwendet, um dem Mod-Fit-Proliferationsassistenten eine erste Schätzung der Position und Breite für den Peak der ungeteilten Elternzellen zu liefern. Die Verwendung einer festen Einstellung für die Peakposition setzt voraus, dass der Mittelwert jedes generationalen Peaks genau der Hälfte der Fluoreszenzintensität des vorherigen Peaks entspricht. Eine variable Einstellung für die Peakposition ermöglicht es, die endgültigen Positionen der generationalen Peaks von den erwarteten Intensitäten abweichend anzupassen, um die bestmögliche Anpassung zu erreichen.Ebenso erfordert eine feste Einstellung für die Peakbreite, dass die Breite jedes generationalen Peaks mit der des elterlichen oder unstimulierten Kontrollpeaks übereinstimmt. Eine flexible Einstellung für die Peakbreite ermöglicht es, die endgültigen Breiten unabhängig voneinander nach Bedarf zu variieren, um die beste Anpassung in dieser Tabelle zu erzielen. Die Ergebnisse der Analysen der vorherigen Abbildungen für zwei verschiedene Spender werden für diese Spender gezeigt, bei denen unterscheidbare generationale Peaks erkennbar waren.Die besten reduzierten Chi-Quadrat-Werte wurden erzielt, wenn sowohl die Peakposition als auch die Breite als frei variierend zugelassen wurden; bei Proliferationsprofilen, bei denen keine unterscheidbaren generationalen Peaks erkennbar sind, wird eine feste Einstellung der Peakposition empfohlen. Diese Daten veranschaulichen die Verwendung zweier Farbstoffe zur getrennten Überwachung der Proliferationsgeschichte verschiedener Immunzelltypen in einem durchflusszytometrischen Immunsuppressionsassay. Die in Grün dargestellten T-Effektorzellen wurden mit CFSE markiert, die in Blau dargestellten T-regulatorischen Zellen wurden mit Cell View markiert.Zellenpopulationen mit Claret-Färbung wurden in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt und in Gegenwart von anti-CD3, anti-CD28 und bestrahlten Zubehörzellen 96 Stunden lang kultiviert. Anschließend wurden die Zellen gewonnen und mit anti-CD4, PE-Cy7 und Live-Dead-Violett gefärbt. Hier sind repräsentative Daten für ein Treg-zu-T-Effektor-Verhältnis von 0,25 zu 1 dargestellt, nachdem die mit Live-Dead-Violett positiv gefärbten Zellen ausgeschlossen wurden.Ein Lichtstreu-Tor, das Lymphozyten und Blasten einschloss, aber Aggregate und Zelltrümmer ausschloss, wurde verwendet, gefolgt von einem Tor zur Erfassung von CD4-positiven Ereignissen. Die Färbung mit Cell View Claret ermöglichte eine klare Unterscheidung zwischen lebensfähigen Treg-Zellen und lebensfähigen T-Effektorzellen, die stark proliferiert waren, weshalb die CFSE-schwachen Proliferationsprofile für CFSE-positive T-Effektorzellen und Cell View Claret-positive Treg-Zellen mittels ModFit-Peak-Modellierungssoftware analysiert wurden. Insgesamt wurden etwa 25.000 Ereignisse ausgewertet.Davon waren 48 % vitale T-Effektorzellen, 6 % vitale Tregs, der Rest waren tote Zellen, Begleitzellen und Zelltrümmer. Der berechnete Proliferationsindex, der die Vervielfachung der Zellzahl während des Assayzeitraums widerspiegelt, betrug für T-Effektorzellen 3,85 und für Tregs 1,83. Hier wird der Einfluss der Treg-Zellkonzentration auf den Proliferationsindex der T-Effektorzellen, berechnet aus dem CFSE-Färbedilutionsprofil, dargestellt.Die Ergebnisse waren identisch, unabhängig davon, ob die Treg-Zellen mit Cell View Claret markiert wurden oder unbehandelt blieben, was darauf hindeutet, dass die Treg-Funktion durch die Färbung nicht verändert wurde. Wie erwartet nahm das Ausmaß der Proliferation der T-Effektorzellen zu, wenn die Konzentration der Treg-Zellen verringert wurde. Proliferationsindizes der Treg-Zellen wurden ebenfalls anhand der Verdünnungsprofile der Cell View Claret-Farbstoffe bei verschiedenen Verhältnissen von Treg- zu T-Effektorzellen berechnet.Wie erwartet zeigten die Tregs eine minimale Proliferation in Abwesenheit von T-Effektorzellen, während mit steigender Konzentration der T-Effektorzellen auch das Ausmaß der Proliferation der Treg-Zellen zunahm. Nach dem Anschauen des Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellmarkierungsfarbstoffe erfolgreich zur Überwachung der Zellproliferation einsetzt, wie man geeignete Fluorochrome und Farbkompensationskontrollen auswählt und wie man ein geeignetes Modell zur Quantifizierung der Zellteilung basierend auf der Farbstoffverdünnung auswählt.Zusammen mit diesem Verfahren können weitere Methoden durchgeführt werden, um experimentelle Fragestellungen zu beantworten, wie beispielsweise die Färbung antigenspezifischer T-Zellen oder die Durchflusszytometrie-Sortierung zur Gewinnung von stammzellähnlichen Zellen, die ruhend oder langsam teilend sind. Vielen Dank fürs Zuschauen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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