Name: Vergleich von drei verschiedenen Methoden zur Bestimmung Zellproliferation in Brustkrebs-Zelllinien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Lernen Sie drei Methoden zur Zellproliferationsanalyse in Brustkrebszelllinien kennen: konventionelles Zellzählen, Lumineszenz-Assay und Zell-Imager. Dieses Protokoll hilft Forschern, die beste Methode für ihre Studie auszuwählen.

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Wir danken Dr. Hamish Campbell und Prof. Antony Braithwaite für ihre Hilfe bei der Entwicklung der transduzierten MCF-7-LeGO-Zelllinien. Wir möchten uns bei unserer finanziellen Unterstützung durch die Bloomfield Group Foundation über das Hunter Medical Research Institute bedanken. B.C.M. wird durch ein APA-Stipendium der University of Newcastle und das MM Sawyer-Stipendium durch das Hunter Medical Research Institute unterstützt.

1. Vorbereiten Zellen für Proliferationsassays Hinweis: Vorbereiten der zwei Zelllinien in der gleichen Weise und Saatgut in demselben Format für jede Methode analysiert werden. <ol><li> Wachsen MCF-7-lego und MCF-7-Δ40p53 7 - Zellen zu 75-80% Konfluenz in T 75 cm 2 Gewebekulturflaschen mit Phenolrot-freiem Dulbecco modifiziertem Eagle - Medium (DMEM) , ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) , 200 mM L-Glutamin, 2 &amp; mgr; g / ml Insulin und 1 &amp; mgr; g / ml Puromycin bei 37 ° C mit 5% CO 2. Behandeln Sie Zellen in einem sterilen Biosicherheitsschrank Klasse II. Anmerkung: Die Menge der Zeit es braucht, um die Zellen zu Konfluenz wachsen variiert je nach der Aussaat Verdünnung. In Vorbereitung für die Plattierung der Zellen für die Proliferationsassays, Samen, die Zellen in einer 1: 3-Verdünnung in DMEM, ergänzt und in normalen Wachstumsbedingungen für 3 Tage, bis 75-80% Konfluenz erhalten. </li><li> Um die Zellen aus dem Kolben zu entfernen, abgießen, die Medien ineinen Abfallbehälter. Ab sofort waschen Sie die Zellschicht mit 2 ml vorgewärmten 2x Trypsin. Absaugen Trypsin. Fügen eine weitere 2 ml vorgewärmtes Trypsin zu der Zellschicht und in einen Inkubator für 5 min bei 37 ° C mit 5% CO 2. <ol><li> Sobald die Zellen lösen, waschen Sie die Zellen mit 10 ml erwärmter frisches DMEM ergänzt. Übertragen die Zellsuspension in ein steriles 15 ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 491 g für 5 min bei RT. vorsichtig absaugen und entsorgen Überstand. </li></ol></li><li> Zellpellet in 5 ml frischem ergänzten DMEM. Durchführen einer Zellzahl die richtige Dichte zu bestimmen, die Zellen in 96-Well-Platten auf Saatgut. <ol><li> Verdünnte 100 ul der Zellsuspension in 900 ul 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS). Legen Sie eine neue 60 &amp; mgr; m-Sensor auf der automatisierten Zellzähler. Halten Sie den Kolben nach unten und tauchen Sie den Sensor in der verdünnten Zellsuspension. Geben Sie langsam den Kolben auf der Zellzähler. Entfernen Sie den Sensor aus der Zelle counter wenn sie abgeschlossen sind. Anmerkung: Die Zellzahl wird auf der Zellzähler in Zellen / ml angezeigt. </li></ol></li><li> Samenzellen in einem Endvolumen von 100 &amp; mgr; l (in DMEM) in einer 96-Well - Platte bei ~ 20% Konfluenz zu ermöglichen Raum für das Zellwachstum und die Messung der Proliferation über 3-5 Tage (siehe Tabelle 1). Samen alle Zelllinien in dreifacher Ausfertigung. Hinweis: Bei diesem Experiment wurden drei verschiedene Zelldichten beurteilt die optimale Zelldichte zu bestimmen. Die erforderlichen Zellzahlen sind in Tabelle 1. Seed - Zellen mit einer geringeren Dichte , wenn die Messung von mehr langfristiges Wachstum zusammengefasst erforderlich. <ol><li> Für die Hämozytometer und Lumineszenz-basierten Assays, bereiten eine Platte pro Zeitpunkt (dh 4 Platten pro Test). Für die Zell Imager Assay vorbereitet nur eine Platte für die Dauer des Experiments. </li></ol></li><li> Pflegen Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 24 Std. </li></ol> 2. Festlegung der Zellzahl Using einem Hämocytometer <ol><li> Vorwärmen sowohl mittlere als auch Trypsin bis 37 ° C in einer Zellkultur-Inkubator, Ofen oder Wasserbad. Aspirat Medien von Zellen in einen Abfallbehälter, wäscht einmal mit 30 ul 2x Trypsin und Trypsin die anzusaugen. </li><li> Wash-Zellen wieder mit 30 ul 2x Trypsin und Inkubation für 5 Minuten bei 37 ° C. Klopfen Sie leicht Rand der Platte Zellen von der Platte zu entfernen. Zugabe von 50 &amp; mgr; l DMEM, ergänzt und mischen Zellen durch Pipettieren, bis die Zellen eine Einzelzellsuspension zu bilden. </li><li> Bereiten Sie Hemocytometer durch Oberfläche und Glasabdeckung mit 70% Ethanol reinigen. </li><li> Legen Sie die Glasdeckglas über Zählkammern und bringen bis &quot;Newtons Refraktion Ringe&quot; werden kann zwischen den Deckglaskanten und der Hemocytometer gesehen. Hinweis: Diese zeigen an, dass das Deckglas richtig an den Hemocytometer eingehalten hat. </li><li> Pipette vorsichtig 20 &amp; mgr; l der Zellsuspension unter dem Deckglas, durch kapillare Bewegung der Zählkammer füllt.Legen Sie Hämozytometer unter 10-facher Vergrößerung eines Mikroskops und visualisieren die Zählkammern im Grid-Layout. </li><li> Zählen von Zellen in den vier äußeren Plätzen der Grid-Layout. Zur Verbesserung der Genauigkeit, die Anzahl der Wiederholungen von zusätzlichen äußeren Quadrate , falls erforderlich, oder bis der Zählwert hat 70 erreicht - 100 Zellen 14,15. <ol><li> Berechnen Zellkonzentration pro ml wie folgt: Durchschnittliche Zellzahl pro x Verdünnungsfaktor Quadrat (falls verwendet) x 10 4 </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,1-2,8 alle 24 Stunden für 96 Stunden nach der Aussaat. </li></ol> 3. Bestimmung der Zellproliferation eine Lumineszenz-basierten Assay unter Verwendung von Anmerkung: Dies ist eine Endpunktmessung. Sobald das Reagens zu den Zellen gegeben wird, kann die Platte nur einmal quantifiziert werden. <ol><li> Auftau Lumineszenzreagenz in einem 22 ° C Wasserbad für 30 min. </li><li> Vorsichtig mischen Reagenz durch die Flasche Umkehren um eine homogene Mischung zu erhalten. </li><li> Äquilibrieren einer Platte gesäten Zellen (aus Schritt1.5) bei RT für 30 min. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l Lumineszenzreagenz zu jeder Vertiefung. Mischungs Inhalt auf einem Orbitalschüttler für 2 min. Lassen Sie Platte für 10 min bei RT inkubiert. </li><li> ein Lumineszenz-Experiment unter Verwendung der Multi-Mode-Plattenleser Software einrichten. <ol><li> Schalten Sie Multi-Mode-Plattenlesegerät und öffnen Sie die Software. In der &quot;Task-Manager&quot;, wählen Sie &quot;Experimente&quot; und Datei &quot;von Seite Symbolleiste, und unter&quot; Protokoll &quot;Registerkarte, wählen Sie &#39;Verfahren&#39; &#39;new&#39;.Select schaffen&#39;. </li><li> Wählen Sie &#39;Grenier 96 Flachboden&#39; Plattentyp, und überprüfen Sie die &quot;Verwendung Deckel&quot; Box. Wählen Sie &quot;lesen&quot; Aktion unter &quot;Leseverfahren&quot; ein. Wählen Sie &#39;Lumineszenz&#39; Nachweisverfahren. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Im Schritt Feld zu lesen, wählen Sie die Vertiefungen unter der &quot;vollen Teller &#39;Tab gescannt werden, und wählen Sie Brunnen als leere Brunnen zu handeln. </li><li> Stellen Sie den Filter auf leeren Filter (zB Stecker, Em: Loch, Spiegel: keine). Stellen Sie die Verstärkung135, mit einer Integrationszeit von 0,5 sec pro Vertiefung und eine Lese Höhe von 6,5 mm. Klicken Sie auf &quot;OK&quot; Einstellungen für die Lumineszenz Lese zu speichern. </li></ol></li><li> Durchführen eines lumineszenten lesen <ol><li> Auswurfplattenhalter von &quot;Gerätesteuerung&quot; Auswahl der Registerkarte, und klicken Sie auf &#39;Teller out&#39;.Place 96-Well-Platte auf den Plattenhalter, den Deckel zu gewährleisten eingeschaltet ist. Schließen Sie den Plattenhalter durch einen Klick auf &quot;Platte in&quot; unter &quot;Gerätesteuerung&quot; Tab. Klicken Sie auf &quot;jetzt&quot; in der Symbolleiste Leuchtlese auszuführen. </li><li> Exportieren Sie die relativen Leuchteinheit (RLE) Messungen für jede Vertiefung in eine Tabelle für die weitere Analyse. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,6 Proliferation alle 24 Stunden bis zu 96 Stunden nach dem Aussäen Zellen aufzuzeichnen. </li></ol> 4. Bestimmung Zellzahl unter Verwendung eines Zell-Imager <ol><li> Einrichten eines Cell-Imaging-Experiment unter Verwendung der Multi-Mode-Zelle Imager Software <ol><li> Schalten Sie Multi-Mode-Zelle-Imager und offen the Software. </li><li> In der &quot;Task-Manager&quot;, wählen Sie &quot;Experimente&quot; Tab und &quot;erstellen new&#39;.On &#39;Datei&#39; Symbolleiste, klicken Sie auf&quot; Protokoll &quot;Registerkarte und offene&quot; Verfahren &quot;tab.Select&quot; Soll-Temperatur &quot;Aktion. Set Inkubator &#39;auf&#39; und setzen die Temperatur auf 37 ° C und prüfen &#39;vorwärmen&#39;, bevor mit dem nächsten Schritt &quot;Box weiter. Klicken Sie auf &quot;OK&quot; die Einstellungen zu speichern. </li><li> Wählen Sie &quot;lesen&quot; Aktion. Klicken Sie auf &quot;Bild&quot; Erkennungsmethode, wählen Sie &#39;Endpunkt / kinetische&#39; lesen Art und &#39;Filter&#39; Optik-Typ. Klicken Sie auf &quot;OK&#39;.Click auf&quot; Vollplatte &quot;Menü und wählen Sie Vertiefungen auf der Platte abgebildet werden. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;, um die Einstellungen zu speichern. </li><li> Wählen Sie das 2.5X Ziel aus dem Dropdown &quot;Ziele&quot; Optionen. Unter Registerkarte &quot;Kanäle&quot;, wählen Sie zwei Kanäle: GFP 469, 525 und dem Hellfeld. Überprüfen Sie &#39;auto&#39; Belichtung für beide Kanäle und wählen Sie die automatische Belichtung gut. </li><li> Um zu bestimmen, auto Fokuseinstellungen, wählen Sie &quot;Autofokus&quot; und klicken Sie auf &quot;Optionen&quot;. Für die Autofokus-Optionen, wählen Sie die &quot;Scan und dann Autofokus&quot; -Methode. Klicken Sie auf &quot;OK&quot; die Einstellungen zu speichern. </li><li> Stellen Sie die horizontalen und vertikalen Versatz von der Mitte des gut (um) bis 0.Select mehrere Bilder pro Vertiefung in einem 3 x 2 Montage, mit horizontalen Abstand (um) = 2881 und vertikalen Abstand (um) = 2127 zu scannen. Klicken Sie auf &quot;OK&quot; -Verfahren Einstellungen zu speichern. Hinweis: Siehe Tabelle 2 für den Leseparameter. </li></ol></li><li> Performing lesen Experiment zu ausgewählten Platte <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Gerätesteuerung&quot; Menü und wählen Sie die &quot;plate out&quot; function.Place 96-Well-Platte in Plattenhalter, den Deckel zu gewährleisten eingeschaltet ist. Unter der Registerkarte &quot;Gerätesteuerung&quot;, wählen Sie die &quot;Platte in&quot; Funktion. Wählen Sie &quot;jetzt&quot; von der Platte Registerkarte. Wiederholen Sie alle 24 Stunden bis zu 96 Stunden nach der Aussaat lesen. </li></ol></li><li> Die Analyse der Zellzahl unter Verwendung derHandy Imager Software. <ol><li> Um ein Bild zu analysieren, klicken Sie auf den &quot;Daten&quot; auf die Registerkarte bebilderte Platte, wählen Sie &#39;Bild [GFP 469, 525 + Hellfeld]&#39;. Klicken Sie doppelt auf ein gut abgebildet. </li><li> Klicken Sie auf ein geladenes Bild. Wählen Sie &quot;analysieren&quot; und wählen Sie ein einzelnes Bild der Montage analysiert werden. Klicken Sie auf &quot;OK&#39;.Check die&quot; GFP &quot;Kanal nur, und Parameter wie in Tabelle 3 dargestellt. Klicken Sie auf&quot; START &quot;Parameter auf die abgebildeten Zellen anzuwenden. </li><li> Beobachten der Zellzählung Maske über den abgebildeten Zellen gegeben, die verwendet wird, um die Zellzahl pro Bild zu bestimmen. Klicken Sie auf &quot;Änderungen übernehmen&quot; und halten Sie diese Einstellungen für jede Platte während des gesamten Experiments abgebildet. </li><li> Wieder zurück auf der bebilderte Platte, klicken Sie auf den Drop &#39;data&#39; down-Menü und wählen Sie &quot;Zellzahl&quot;. Dadurch wird die Gesamtzellzahl pro Vertiefung erzeugen. </li><li> Exportieren Sie alle Daten in eine Tabelle auf der &quot;Export&quot; Register für die weitere Analyse o durch einen Klickf die Zellzahl pro Vertiefung. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

In diesem Protokoll drei verschiedene Methoden der Zellproliferation in kultivierten Zellen Messung untersucht. Jede Methode der Lage war, reproduzierbare und genaue Messungen der Zellproliferation über 96 h, und die Ergebnisse waren vergleichbar zwischen jedem der Verfahren getestet (Abbildung 2 und 3). Sowohl die Lumineszenz basierenden Assays und Zellbildgebungsverfahren erzeugt die robusteste Ergebnisse, linearen Anstieg der Zellproliferation nach 96 h zeigt , (2b, c).</stro...

Der Tumor - Suppressor - Gen, p53, ist ein wesentlicher Regulator von einer Anzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Zellzyklusarrest, Apoptose und Seneszenz 1. Es ist verantwortlich für genomische Stabilität beibehalten wird, und ist daher von entscheidender Bedeutung, das Gleichgewicht von Zelltod und Zellwachstum aufrechtzuerhalten. Mutationen in p53 sind häufig in Krebs und sind die Hauptursache der p53 - Inaktivierung zu unkontrollierter Zellproliferation Krebs führenden 2. Interessanterweise p53 - Mutationen in machen nur etwa 25% der Brustkrebse 3, was vermuten lässt , dass andere Mechanismen für den Verlust der p53 - Funktion verantwortlich sind. Die kürzlich entdeckten p53 - Isoformen wurden in einer Reihe von menschlichen Krebsarten überexprimiert gezeigt zu werden, und kann p53 - Funktion 4,5 modulieren. Wir haben gezeigt, dass die zuvor p53 Isoform, Δ40p53, ist die stark exprimiert Isoform bei Brustkrebs und deutlich in Brustkrebszellen hochreguliert wird, wenn in den normalen benachbarten tiss verglichenue 6. Im Anschluss daran transduzierten wir stabil den menschlichen Brustkrebszelllinie MCF-7 Δ40p53 mit dem lego-iG2-puro + Vektor (GFP +) 7 überexprimiert. Diese Zellen wurden verwendet, um zu untersuchen, ob hohe Δ40p53 Ausdruck erhöht die Zellproliferationsraten in Brustkrebszellen. Es gibt viele direkte und indirekte Methoden der Zellproliferation von kultivierten Zellen in vitro 8,9 gemessen wird . Diese können entweder als kontinuierliche Messungen über die Zeit durchgeführt werden, oder als Endpunkt - Assays 10. Herkömmliche Verfahren sind immer noch nützlich, wie beispielsweise Zellzählung unter Verwendung eines Hämozytometers. Dieser Assay ist eine kostengünstige und direktes Maß für die Zellzahl, es gibt aber verlassen sich auf große Zellzahlen und hoch qualifizierten Trainingsfehler und großen Standardabweichungen von den Zählungen zu minimieren. Die Notwendigkeit, die Messungen durchführen kompatibel mit Hochdurchsatz-Format hat zur Entwicklung von Multi-Well-Platte-Assays führte. Diese Lumineszenz-basierten Assays Measure Zellzahlen auf einem Leuchtsignal basiert, die auf die Stoffwechselaktivität der Zelle 11,12 proportional ist. In jüngerer Zeit hat die Einführung von hohen Gehalt Bildgebungsplattformen für neue Werkzeuge erlaubt , die Zellproliferation zu überwachen , während quantitative und qualitative phänotypischen Datenerfassung, und enthält eine Vielzahl von Systemen 13. Alle diese Verfahren bieten Wege Zellwachstum entweder durch kontinuierliche Messung oder Endpunktassays und besitzen jeweils eine Reihe von Vor- und Nachteile in Bezug auf Empfindlichkeit, den Durchsatz von Musternummern und Zelleninformation, welche alle entsprechend abgewogen werden je kann zu messen auf die Forschungsfrage. Dieses Protokoll beschreibt drei verschiedene Methoden zur Messung der Zellproliferation in vitro, wobei jedes Verfahren verschiedene Bereiche der Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Multi-Well - Plattenformate verwendet. Dieses Protokoll zum Ziel, die Verwendung eines Hämocytometer Zählen cha zu vergleichenmber eine Lumineszenz basierenden Zelllebensfähigkeitstest und Zell Imager, in der Messung der Zellproliferation über einen Zeitverlauf 96 Stunden. Dazu wurde das Wachstum von Vektor-transduzierten Zellen (MCF-7-LeGo) im Vergleich zu Zellen transduziert zu überexprimieren Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), drei unterschiedliche Zelldichten verwenden. Zellproliferation wurde alle 24 Stunden gemessen, bis zu 96 Stunden. Jede Methode wurde gefunden, seine eigenen Vorteile und Nachteile haben, und je nach dem Ziel des Experiments jeweils noch eine wertvolle Methode für Informationen über die Proliferationsrate bereitstellt.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium, ohne Phenolrot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063-045</td><td>Ergänzt mit 10% FBS, 200 mM L-Glutamin, 2 & Mikro; g/ml Insulin und 1 & Mikro; g/ml</td>Puromycin-L-Glutamin-Lösung</tr><tr><td>(100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Insulinlösung human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin-Dihydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>0,5%ige Trypsin-EDTA-Lösung (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>Verdünnung auf 2x in DPBS</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturflasche, 75 cm2 Wachstumsfläche</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175 Scepter</td><td></td></tr><tr><td>2.0 Zellzähler</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>Automatisierter Zellzähler</td></tr><tr><td>96 Well Multiwell-Platte, Nunc</td><td></td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>verbessertes Neubauer Hämozytometer</td><td>BOECO Deutschland</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX51 inverses Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 2.0 Assay</td><td>Promega</td><td>G9242</td><td>Lumineszenz-basierter Assay</td></tr><tr><td>Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>Plate Reader für Lumineszenz, Fluoreszenz und Hellfeld-Zellbildgebung</td></tr><tr><td>Gen5 Datenanalysesoftware</td><td>BioTek</td><td>GEN5</td><td></td></tr></tbody></table>

vergleich von drei verschiedenen methoden zur bestimmung zellproliferation in brustkrebs-zelllinien

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Die Messung der Zellproliferation kann mit einer Reihe verschiedener Methoden durchgeführt werden, jede mit unterschiedlicher Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Kompatibilität mit Hochdurchsatzformatierung. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von drei verschiedenen Methoden zur Messung der Zellproliferation in vitro, einschließlich der konventionellen Hämozytometer-Zählkammer, eines Lumineszenz-basierten Assays, der die Änderung der Stoffwechselaktivität lebensfähiger Zellen als Maß für die relative Anzahl von Zellen verwendet, und eines Multi-Mode-Zell-Imagers, der die Zellzahl mithilfe eines Zählalgorithmus misst. Jede Methode hat ihre eigenen Vor- und Nachteile für die Messung der Zellproliferation, einschließlich Zeit, Kosten und Hochdurchsatzkompatibilität. Dieses Protokoll zeigt, dass jede Methode die Zellproliferation im Laufe der Zeit genau messen kann und empfindlich ist, um das Wachstum bei unterschiedlichen Zelldichten zu erkennen. Darüber hinaus konnte die Messung der Zellproliferation mit einem Zellbildgeber weitere Informationen wie Morphologie, Konfluenz liefern und ermöglichte eine kontinuierliche Überwachung der Zellproliferation über die Zeit. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass jede Methode in der Lage ist, die Zellproliferation zu messen, aber die gewählte Methode ist benutzerabhängig.

Zur Untersuchung der verschiedenen Methoden, die Proliferation von kultivierten Zellen zu messen, die Zellproliferation von MCF-7-Zellen transduziert Δ40p53 wurde im Vergleich zu den nicht-transduzierten MCF-7-LeGo Brustkrebszelllinie. Die drei Verfahren , die verglichen wurden , - das herkömmliche Verfahren Hämozytometer, die Lebensfähigkeit der Zellen Lumineszenz - Assay und Zellabbildungs ​​Auswertung- in der schematischen Darstellung (Abbildung 1) beschrieben werden....

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von drei verschiedenen Methoden zur Analyse der Zellproliferation in Brustkrebszelllinien. Dazu gehören die Verwendung der konventionellen Zellzählung, die lumineszenzbasierte Zellviabilität und die Zellzählung durch den Einsatz eines Zellimagers. Beides bietet Vorteile für die reproduzierbare Messung der Zellproliferation.

Vergleich von drei verschiedenen Methoden zur Bestimmung Zellproliferation in Brustkrebs-Zelllinien

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Das übergeordnete Ziel dieser Demonstration besteht darin, drei verschiedene Zellproliferations-Assays zu vergleichen und die Vor- und Nachteile jeder Methode darzustellen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsforschung zu beantworten, beispielsweise welche Zellproliferationsmethode am besten geeignet ist. Die Vorbereitung dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte mit dem Zellanalysesystem schwer zu erlernen sind.Sie erfordern, dass Sie sich auf die Zellen konzentrieren, bevor Sie die geeignete Zellzählmaske anwenden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie zwei MCF-7-Zelllinien drei Tage lang bis zu einer Konfluenz von 75 bis 80 % in T75-Kulturflaschen mit einem Flächeninhalt von 75 Quadratzentimetern in phenolrotfreiem DMEM kultivieren. Entfernen Sie nach drei Tagen die Zellen aus den Flaschen, indem Sie das Medium in einen Abfallbehälter abgießen.Danach die Zellschicht sofort mit zwei Milliliter vorgewärmtem zweifachem Trypsin waschen. Das Trypsin abpipettieren und weitere zwei Milliliter vorgewärmtes Trypsin auf die Zellschicht geben, bevor sie in einen Inkubator gestellt wird. Sobald sich die Zellen gelöst haben, werden sie mit 10 Milliliter erwärmtem frischem ergänztem DMEM gewaschen.Anschließend die Zellsuspension in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen überführen und fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Nach fünf Minuten vorsichtig den Überstand abpipettieren und entsorgen. Danach das Zellpellet in fünf Milliliter frischem supplementiertem DMEM erneut suspendieren.Um eine Zellzählung durchzuführen, verdünnen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in 900 Mikrolitern einmaligem DPBS. Bringen Sie anschließend einen neuen 60-Mikrometer-Sensor am automatischen Zellzähler an. Halten Sie den Kolben gedrückt und tauchen Sie den Sensor in die verdünnte Zellsuspension ein.Lassen Sie den Kolben des Zellzählgeräts langsam los. Entfernen Sie anschließend den Sensor aus dem Zellzählgerät. Säen Sie die Zellen in einem Endvolumen von 100 µL in einer 96-Well-Platte bei etwa 20 % Konfluenz aus, um Platz für das Zellwachstum und die Messung der Proliferation über drei bis fünf Tage zu schaffen.Um die Zellanzahl mithilfe eines Hämozytometers zu bestimmen, erwärmen Sie das Medium und das Trypsin vorab auf 37 Grad Celsius in einem Zellkulturschrank, Ofen oder Wasserbad. Saugen Sie anschließend das Medium von den Zellen in einen Abfallbehälter ab. Waschen Sie die Zellen dann einmal mit 30 Mikrolitern zweifach konzentriertem Trypsin und saugen Sie das Medium erneut in den Abfallbehälter ab.Anschließend die Zellen erneut mit 30 Mikrolitern zweifach verdünntem Trypsin waschen und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Vorsichtig an den Plattenrand klopfen, um die Zellen zu lösen. Danach 50 Mikroliter supplementiertes DMEM hinzufügen und die Zellen durch Pipettieren so lange mischen, bis eine Einzelzell-Suspension entstanden ist.Legen Sie den Glasdeckel über die Zählkammern und befestigen Sie ihn, bis Newtonschen Brechungsringe zwischen den Kanten des Deckels und dem Hämatocytometer sichtbar sind. Pipettieren Sie anschließend vorsichtig 20 Mikroliter der Zellsuspension unter den Deckel und lassen Sie die Zählkammer durch Kapillarwirkung füllen. Danach betrachten Sie die Zählkammern im Gitterlayout bei 10-facher Vergrößerung.Tauen Sie das Lumineszenzreagenz in einem Wasserbad mit 22 Grad Celsius 30 Minuten lang auf. Drehen Sie die Flasche vorsichtig um, um eine homogene Mischung zu erhalten. Anschließend lassen Sie eine Platte mit ausgesäten Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibrieren.Im Anschluss 100 Mikroliter Lumineszenzreagenz zu jedem Well hinzufügen. Den Inhalt zwei Minuten lang auf einem Rotationsrührer mischen. Danach die Platte 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen.Um ein Lumineszenzexperiment mit der Software des Multimode-Plattenreaders einzurichten, schalten Sie den Multimode-Plattenreader ein und öffnen Sie die Software. Wählen Sie im Task-Manager Experimente und Neu erstellen. Klicken Sie dann im Seitenleistenmenü auf Datei und unter dem Reiter Protokoll auf Verfahren.Wählen Sie anschließend Greiner 96 flach als Plattenformat aus und aktivieren Sie das Kontrollkästchen „Use Lid“. Wählen Sie unter dem Feld „Read method“ die Aktion „Read“ aus. Danach wählen Sie Lumineszenz als Nachweismethode und klicken Sie auf „OK“. Im Feld „Read Step“ wählen Sie unter dem Reiter „Full Plate“ die zu scannenden Wells aus und legen Sie die als Blank-Wells dienenden Wells fest.Stellen Sie den Filter auf „Leerer Filter“ ein. Stellen Sie den Verstärkungsfaktor auf 135 ein, mit einer Integrationszeit von 5 Sekunden pro Vertiefung und einer Lesehöhe von 6,5 Millimetern. Klicken Sie auf „OK“, um die Einstellungen für die Lumineszenzablesung zu speichern.Um eine Lumineszenzablesung durchzuführen, entnehmen Sie den Plattenhalter, indem Sie im Reiter „Instrumentensteuerung“ die Option „Platte aus“ auswählen. Setzen Sie die 96-Loch-Platte auf den Plattenhalter, wobei sich der Deckel darauf befinden muss. Schließen Sie den Plattenhalter, indem Sie im Reiter „Instrumentensteuerung“ auf „Platte ein“ klicken.Klicken Sie anschließend in der Symbolleiste auf „Jetzt lesen“, um eine lumineszente Messung durchzuführen. Danach exportieren Sie die RLU-Messwerte für jede Vertiefung in eine Tabellenkalkulation zur weiteren Analyse. Um ein Zellbildgebungs-Experiment einzurichten, schalten Sie den Multimodus-Zellbildanalysator ein und öffnen die Software.Wählen Sie im Task-Manager die Registerkarte Experimente und „Neu erstellen“. Klicken Sie auf der Datei-Symbolleiste auf die Registerkarte Protokoll und anschließend auf die Registerkarte Vorgehen. Wählen Sie die Aktion Temperatur einstellen aus.Schalten Sie den Inkubator ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Aktivieren Sie die Voraufheizung und klicken Sie dann auf OK, um die Einstellungen zu speichern. Wählen Sie anschließend die Aktion „Lesen“ aus.Klicken Sie auf „Bild“ als Nachweismethode. Wählen Sie anschließend den Messmodus Endpunkt/Kinetik und den optischen Filtertyp aus, und klicken Sie auf „OK“. Danach wechseln Sie zum Reiter „Gesamte Platte“, und wählen Sie die Vertiefungen der Platte aus, die abgebildet werden sollen. Klicken Sie auf „OK“, um die Einstellungen zu speichern.Wählen Sie nun das 2,5-fache Objektiv aus der Dropdown-Liste Objektive aus. Wählen Sie unter der Registerkarte Kanäle GFP 469,525 und Hellfeld aus. Aktivieren Sie die automatische Belichtung für beide Kanäle und wählen Sie die Probe für die automatische Belichtung aus.Um die automatischen Fokuseinstellungen festzulegen, klicken Sie auf Optionen. Wählen Sie bei den Optionen für die automatische Fokussierung die Methode „Scan“ und anschließend „automatischer Fokus“. Klicken Sie auf „OK“, um die Einstellungen zu speichern.Danach setzen Sie den horizontalen und vertikalen Versatz vom Zentrum der Vertiefung auf null. Wählen Sie aus, mehrere Bilder pro Vertiefung in einer dreispaltigen durch zweizeilige Montage zu scannen. Klicken Sie dann auf „OK“, um die Verfahrenseinstellungen zu speichern.Um das Experiment auf der ausgewählten Platte auszulesen, klicken Sie auf den Reiter Instrumentensteuerung und wählen Sie die Funktion Platte aus. Legen Sie eine 96-Loch-Platte auf den Plattenhalter und stellen Sie sicher, dass der Deckel aufgesetzt ist. Wählen Sie unter dem Reiter Instrumentensteuerung die Funktion Platte ein. Wählen Sie anschließend im Reiter „Plate“ die Option „Read Now“ aus und wiederholen Sie den Messvorgang alle 24 Stunden bis zu 96 Stunden nach der Aussaat. Um ein Bild zu analysieren, klicken Sie auf den Reiter „Data“ der abgebildeten Platte und wählen Sie „Picture GFP 469, 525 plus Bright Field“. Doppelklicken Sie dann auf die abgebildete Vertiefung.Klicken Sie nun auf ein geladenes Bild. Wählen Sie „Analysieren“ und anschließend das einzelne Bild der Montage aus, das analysiert werden soll. Klicken Sie danach auf „OK“. Überprüfen Sie anschließend nur den GFP-Kanal und stellen Sie die Parameter gemäß Tabelle 3 ein.Klicken Sie danach auf „Start“, um die Parameter auf die abgebildeten Zellen anzuwenden. Beobachten Sie die über die abgebildeten Zellen gelegte Zählmaske, die zur Bestimmung der Zellanzahl pro Bild verwendet wird. Klicken Sie auf „Änderungen übernehmen“ und behalten Sie diese Einstellungen für jede im Laufe des Experiments abgebildete Platte bei.In dieser Abbildung wurde eine lineare Regressionsanalyse durchgeführt, um die korrelativen Beziehungen zwischen den verschiedenen untersuchten Methoden zur Messung der Zellproliferation in MCF-7-LeGO-Zellen und MCF-7-delta 40p53-Zellen zu vergleichen. Ein Pearson-Korrelationskoeffizient wurde berechnet, und die Signifikanz zwischen den verschiedenen Methoden zur Messung der Zellproliferation wurde bestimmt. Die stärkste Korrelation wurde beim Vergleich des lumineszenzbasierten Assays mit dem Zellimager beobachtet.Abgebildet sind repräsentative Bilder von GFP-positiven MCF-7-LeGO- und MCF-7-delta-40p53-Brustkrebszellen, die mithilfe des Zellimagers alle 24 Stunden aufgenommen wurden, bis die Zellen nahezu 100 % Konfluenz erreichten. Diese Methode liefert nützliche zelluläre Informationen, darunter die Möglichkeit, das Zellwachstum über mehrere Tage visuell zu überwachen sowie Zellgröße und Zellmorphologie zwischen verschiedenen Zelllinien zu vergleichen. Eine Zusammenfassung der Vor- und Nachteile der jeweils getesteten Methoden ist hier dargestellt, welche die Vielseitigkeit jeder Methode verdeutlicht und Lesern hilft, die am besten geeignete Methode auszuwählen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für drei verschiedene Zellproliferationsassays haben und in der Lage sein, zu bestimmen, welcher am besten für Ihren eigenen Versuchsansatz geeignet ist.

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Forschung

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Biology

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Vergleich von drei verschiedenen Methoden zur Bestimmung Zellproliferation in Brustkrebs-Zelllinien

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