Vergleich von drei verschiedenen Methoden zur Bestimmung Zellproliferation in Brustkrebs-Zelllinien

Das übergeordnete Ziel dieser Demonstration besteht darin, drei verschiedene Zellproliferations-Assays zu vergleichen und die Vor- und Nachteile jeder Methode darzustellen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsforschung zu beantworten, beispielsweise welche Zellproliferationsmethode am besten geeignet ist. Die Vorbereitung dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte mit dem Zellanalysesystem schwer zu erlernen sind.

Sie erfordern, dass Sie sich auf die Zellen konzentrieren, bevor Sie die geeignete Zellzählmaske anwenden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie zwei MCF-7-Zelllinien drei Tage lang bis zu einer Konfluenz von 75 bis 80 % in T75-Kulturflaschen mit einem Flächeninhalt von 75 Quadratzentimetern in phenolrotfreiem DMEM kultivieren. Entfernen Sie nach drei Tagen die Zellen aus den Flaschen, indem Sie das Medium in einen Abfallbehälter abgießen.

Danach die Zellschicht sofort mit zwei Milliliter vorgewärmtem zweifachem Trypsin waschen. Das Trypsin abpipettieren und weitere zwei Milliliter vorgewärmtes Trypsin auf die Zellschicht geben, bevor sie in einen Inkubator gestellt wird. Sobald sich die Zellen gelöst haben, werden sie mit 10 Milliliter erwärmtem frischem ergänztem DMEM gewaschen.

Anschließend die Zellsuspension in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen überführen und fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Nach fünf Minuten vorsichtig den Überstand abpipettieren und entsorgen. Danach das Zellpellet in fünf Milliliter frischem supplementiertem DMEM erneut suspendieren.

Um eine Zellzählung durchzuführen, verdünnen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in 900 Mikrolitern einmaligem DPBS. Bringen Sie anschließend einen neuen 60-Mikrometer-Sensor am automatischen Zellzähler an. Halten Sie den Kolben gedrückt und tauchen Sie den Sensor in die verdünnte Zellsuspension ein.

Lassen Sie den Kolben des Zellzählgeräts langsam los. Entfernen Sie anschließend den Sensor aus dem Zellzählgerät. Säen Sie die Zellen in einem Endvolumen von 100 µL in einer 96-Well-Platte bei etwa 20 % Konfluenz aus, um Platz für das Zellwachstum und die Messung der Proliferation über drei bis fünf Tage zu schaffen.

Um die Zellanzahl mithilfe eines Hämozytometers zu bestimmen, erwärmen Sie das Medium und das Trypsin vorab auf 37 Grad Celsius in einem Zellkulturschrank, Ofen oder Wasserbad. Saugen Sie anschließend das Medium von den Zellen in einen Abfallbehälter ab. Waschen Sie die Zellen dann einmal mit 30 Mikrolitern zweifach konzentriertem Trypsin und saugen Sie das Medium erneut in den Abfallbehälter ab.

Anschließend die Zellen erneut mit 30 Mikrolitern zweifach verdünntem Trypsin waschen und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Vorsichtig an den Plattenrand klopfen, um die Zellen zu lösen. Danach 50 Mikroliter supplementiertes DMEM hinzufügen und die Zellen durch Pipettieren so lange mischen, bis eine Einzelzell-Suspension entstanden ist.

Legen Sie den Glasdeckel über die Zählkammern und befestigen Sie ihn, bis Newtonschen Brechungsringe zwischen den Kanten des Deckels und dem Hämatocytometer sichtbar sind. Pipettieren Sie anschließend vorsichtig 20 Mikroliter der Zellsuspension unter den Deckel und lassen Sie die Zählkammer durch Kapillarwirkung füllen. Danach betrachten Sie die Zählkammern im Gitterlayout bei 10-facher Vergrößerung.

Tauen Sie das Lumineszenzreagenz in einem Wasserbad mit 22 Grad Celsius 30 Minuten lang auf. Drehen Sie die Flasche vorsichtig um, um eine homogene Mischung zu erhalten. Anschließend lassen Sie eine Platte mit ausgesäten Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibrieren.

Im Anschluss 100 Mikroliter Lumineszenzreagenz zu jedem Well hinzufügen. Den Inhalt zwei Minuten lang auf einem Rotationsrührer mischen. Danach die Platte 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen.

Um ein Lumineszenzexperiment mit der Software des Multimode-Plattenreaders einzurichten, schalten Sie den Multimode-Plattenreader ein und öffnen Sie die Software. Wählen Sie im Task-Manager Experimente und Neu erstellen. Klicken Sie dann im Seitenleistenmenü auf Datei und unter dem Reiter Protokoll auf Verfahren.

Wählen Sie anschließend Greiner 96 flach als Plattenformat aus und aktivieren Sie das Kontrollkästchen „Use Lid“. Wählen Sie unter dem Feld „Read method“ die Aktion „Read“ aus. Danach wählen Sie Lumineszenz als Nachweismethode und klicken Sie auf „OK“. Im Feld „Read Step“ wählen Sie unter dem Reiter „Full Plate“ die zu scannenden Wells aus und legen Sie die als Blank-Wells dienenden Wells fest.

Stellen Sie den Filter auf „Leerer Filter“ ein. Stellen Sie den Verstärkungsfaktor auf 135 ein, mit einer Integrationszeit von 5 Sekunden pro Vertiefung und einer Lesehöhe von 6,5 Millimetern. Klicken Sie auf „OK“, um die Einstellungen für die Lumineszenzablesung zu speichern.

Um eine Lumineszenzablesung durchzuführen, entnehmen Sie den Plattenhalter, indem Sie im Reiter „Instrumentensteuerung“ die Option „Platte aus“ auswählen. Setzen Sie die 96-Loch-Platte auf den Plattenhalter, wobei sich der Deckel darauf befinden muss. Schließen Sie den Plattenhalter, indem Sie im Reiter „Instrumentensteuerung“ auf „Platte ein“ klicken.

Klicken Sie anschließend in der Symbolleiste auf „Jetzt lesen“, um eine lumineszente Messung durchzuführen. Danach exportieren Sie die RLU-Messwerte für jede Vertiefung in eine Tabellenkalkulation zur weiteren Analyse. Um ein Zellbildgebungs-Experiment einzurichten, schalten Sie den Multimodus-Zellbildanalysator ein und öffnen die Software.

Wählen Sie im Task-Manager die Registerkarte Experimente und „Neu erstellen“. Klicken Sie auf der Datei-Symbolleiste auf die Registerkarte Protokoll und anschließend auf die Registerkarte Vorgehen. Wählen Sie die Aktion Temperatur einstellen aus.

Schalten Sie den Inkubator ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Aktivieren Sie die Voraufheizung und klicken Sie dann auf OK, um die Einstellungen zu speichern. Wählen Sie anschließend die Aktion „Lesen“ aus.

Klicken Sie auf „Bild“ als Nachweismethode. Wählen Sie anschließend den Messmodus Endpunkt/Kinetik und den optischen Filtertyp aus, und klicken Sie auf „OK“. Danach wechseln Sie zum Reiter „Gesamte Platte“, und wählen Sie die Vertiefungen der Platte aus, die abgebildet werden sollen. Klicken Sie auf „OK“, um die Einstellungen zu speichern.

Wählen Sie nun das 2,5-fache Objektiv aus der Dropdown-Liste Objektive aus. Wählen Sie unter der Registerkarte Kanäle GFP 469,525 und Hellfeld aus. Aktivieren Sie die automatische Belichtung für beide Kanäle und wählen Sie die Probe für die automatische Belichtung aus.

Um die automatischen Fokuseinstellungen festzulegen, klicken Sie auf Optionen. Wählen Sie bei den Optionen für die automatische Fokussierung die Methode „Scan“ und anschließend „automatischer Fokus“. Klicken Sie auf „OK“, um die Einstellungen zu speichern.

Danach setzen Sie den horizontalen und vertikalen Versatz vom Zentrum der Vertiefung auf null. Wählen Sie aus, mehrere Bilder pro Vertiefung in einer dreispaltigen durch zweizeilige Montage zu scannen. Klicken Sie dann auf „OK“, um die Verfahrenseinstellungen zu speichern.

Um das Experiment auf der ausgewählten Platte auszulesen, klicken Sie auf den Reiter Instrumentensteuerung und wählen Sie die Funktion Platte aus. Legen Sie eine 96-Loch-Platte auf den Plattenhalter und stellen Sie sicher, dass der Deckel aufgesetzt ist. Wählen Sie unter dem Reiter Instrumentensteuerung die Funktion Platte ein.

Wählen Sie anschließend im Reiter „Plate“ die Option „Read Now“ aus und wiederholen Sie den Messvorgang alle 24 Stunden bis zu 96 Stunden nach der Aussaat. Um ein Bild zu analysieren, klicken Sie auf den Reiter „Data“ der abgebildeten Platte und wählen Sie „Picture GFP 469, 525 plus Bright Field“. Doppelklicken Sie dann auf die abgebildete Vertiefung.

Klicken Sie nun auf ein geladenes Bild. Wählen Sie „Analysieren“ und anschließend das einzelne Bild der Montage aus, das analysiert werden soll. Klicken Sie danach auf „OK“. Überprüfen Sie anschließend nur den GFP-Kanal und stellen Sie die Parameter gemäß Tabelle 3 ein.

Klicken Sie danach auf „Start“, um die Parameter auf die abgebildeten Zellen anzuwenden. Beobachten Sie die über die abgebildeten Zellen gelegte Zählmaske, die zur Bestimmung der Zellanzahl pro Bild verwendet wird. Klicken Sie auf „Änderungen übernehmen“ und behalten Sie diese Einstellungen für jede im Laufe des Experiments abgebildete Platte bei.

In dieser Abbildung wurde eine lineare Regressionsanalyse durchgeführt, um die korrelativen Beziehungen zwischen den verschiedenen untersuchten Methoden zur Messung der Zellproliferation in MCF-7-LeGO-Zellen und MCF-7-delta 40p53-Zellen zu vergleichen. Ein Pearson-Korrelationskoeffizient wurde berechnet, und die Signifikanz zwischen den verschiedenen Methoden zur Messung der Zellproliferation wurde bestimmt. Die stärkste Korrelation wurde beim Vergleich des lumineszenzbasierten Assays mit dem Zellimager beobachtet.

Abgebildet sind repräsentative Bilder von GFP-positiven MCF-7-LeGO- und MCF-7-delta-40p53-Brustkrebszellen, die mithilfe des Zellimagers alle 24 Stunden aufgenommen wurden, bis die Zellen nahezu 100 % Konfluenz erreichten. Diese Methode liefert nützliche zelluläre Informationen, darunter die Möglichkeit, das Zellwachstum über mehrere Tage visuell zu überwachen sowie Zellgröße und Zellmorphologie zwischen verschiedenen Zelllinien zu vergleichen. Eine Zusammenfassung der Vor- und Nachteile der jeweils getesteten Methoden ist hier dargestellt, welche die Vielseitigkeit jeder Methode verdeutlicht und Lesern hilft, die am besten geeignete Methode auszuwählen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für drei verschiedene Zellproliferationsassays haben und in der Lage sein, zu bestimmen, welcher am besten für Ihren eigenen Versuchsansatz geeignet ist.