Vergleich von drei verschiedenen Methoden zur Bestimmung Zellproliferation in Brustkrebs-Zelllinien

Das übergeordnete Ziel dieser Demonstration ist es, drei verschiedene Zellproliferationsassays zu vergleichen und die Vor- und Nachteile der einzelnen Methoden darzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Krebsforschung zu beantworten, wie z.B. die Anwendung der am besten geeigneten Zellproliferationsmethode. Die Vorbereitung dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte des Zellbildgebers schwer zu erlernen sind.

Sie erfordern, dass Sie sich auf die Zellen konzentrieren, bevor Sie die entsprechende Zellzählmaske anwenden. Um dieses Verfahren zu beginnen, züchten Sie zwei MCF-7-Zelllinien drei Tage lang auf 75 bis 80 % Konfluenz in den T75-Quadratzentimeter-Gewebekulturflaschen unter Verwendung von phenolrotfreiem DMEM. Nach drei Tagen werden die Zellen aus den Kolben genommen, indem das Medium in einen Abfallbehälter gegossen wird.

Waschen Sie dann sofort die Zellschicht mit zwei Millilitern vorgewärmtem zweifachem Trypsin. Aspirieren Sie das Trypsin und geben Sie weitere zwei Milliliter vorgewärmtes Trypsin in die Zellschicht, bevor Sie es in einen Inkubator geben. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, waschen Sie sie mit 10 Millilitern erwärmtem, frischem, ergänztem DMEM.

Dann geben Sie die Zellsuspension in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach fünf Minuten den Überstand vorsichtig ansaugen und entsorgen. Anschließend suspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern frisch ergänztem DMEM.

Um eine Zellzählung durchzuführen, verdünnen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in 900 Mikrolitern des Einmal-DPBS. Platzieren Sie dann einen neuen 60-Mikrometer-Sensor auf dem automatisierten Zellzähler. Halten Sie den Kolben gedrückt und tauchen Sie den Sensor in die verdünnte Zellsuspension.

Lassen Sie den Kolben auf dem Zellzähler langsam los. Entfernen Sie dann den Sensor aus dem Zellenzähler, wenn er fertig ist. Aussaat der Zellen in einem Endvolumen von 100 Mikrolitern in einer 96-Well-Platte bei etwa 20 % Konfluenz, um Platz für das Zellwachstum und die Messung der Proliferation über drei bis fünf Tage zu schaffen.

Um die Zellzahl mit einem Hämozytometer zu bestimmen, erwärmen Sie sowohl das Medium als auch das Trypsin in einem Zellkultur-Inkubator, Ofen oder Wasserbad auf 37 Grad Celsius. Anschließend saugen Sie das Medium aus den Zellen in einen Abfallbehälter ab. Waschen Sie sie dann einmal mit 30 Mikrolitern zweimaligem Trypsin und saugen Sie das Medium erneut in den Abfallbehälter an.

Waschen Sie die Zellen anschließend erneut mit 30 Mikrolitern zweifachem Trypsin und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Klopfen Sie vorsichtig auf den Plattenrand, um die Zellen zu lösen. Fügen Sie anschließend 50 Mikroliter supplementiertes DMEM hinzu und mischen Sie die Zellen durch Pipettieren, bis eine einzelne Zellsuspension gebildet wird.

Legen Sie den Glasdeckglas über die Zählkammern und kleben Sie es so lange an, bis die Newtonschen Brechungsringe zwischen den Deckglaskanten und dem Helozytometer zu sehen sind. Pipettieren Sie dann vorsichtig 20 Mikroliter der Zellsupension unter den Deckglas und lassen Sie die Zählkammer durch Kapillarbewegung füllen. Visualisieren Sie anschließend die Zählkammern im Rasterlayout unter 10-facher Vergrößerung.

Tauen Sie bei diesem Verfahren das Lumineszenzreagenz in einem 22 Grad Celsius warmen Wasserbad 30 Minuten lang auf. Drehen Sie die Flasche vorsichtig um, um eine homogene Mischung zu erhalten. Dann äquilibrieren Sie eine Platte mit ausgesäten Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Geben Sie anschließend 100 Mikroliter Lumineszenzreagenz in jede Vertiefung. Mischen Sie den Inhalt zwei Minuten lang auf einem Orbitalschüttler. Lassen Sie die Platte dann 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Um ein Lumineszenzexperiment mit der Multimode-Plattenlesersoftware einzurichten, schalten Sie den Multimodus-Plattenleser ein und öffnen Sie die Software. Wählen Sie im Task-Manager Experimente und Neu erstellen aus. Wählen Sie dann in der seitlichen Symbolleiste Datei aus, und wählen Sie auf der Registerkarte Protokoll die Option Prozedur aus.

Wählen Sie als Nächstes Greiner 96 flacher Boden als Plattentyp aus und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Deckel verwenden. Wählen Sie die Aktion Lesen unter dem Feld Methode lesen aus. Wählen Sie dann Lumineszenz als Nachweismethode aus und klicken Sie OK.In das Feld Leseschritt, wählen Sie auf der Registerkarte Vollständige Platte die zu scannenden Vertiefungen aus und wählen Sie die Vertiefungen aus, die als leere Vertiefungen fungieren sollen.

Legen Sie den Filtersatz auf Leerer Filter fest. Stellen Sie die Verstärkung auf 135 ein, mit einer Integrationszeit von 5 Sekunden pro Well und einer Lesehöhe von 6,5 Millimetern. Klicken Sie auf OK, um die Einstellungen für die Lumineszenzmessung zu speichern.

Um eine Lumineszenzmessung durchzuführen, werfen Sie den Plattenhalter aus, indem Sie die Registerkarte "Instrumentensteuerung" auswählen und auf "Platte aus" klicken. Setzen Sie die 96-Well-Platte auf den Plattenhalter und stellen Sie sicher, dass der Deckel aufgesetzt ist. Schließen Sie den Plattenhalter, indem Sie auf der Registerkarte Instrumentensteuerung auf Plate In klicken.

Klicken Sie dann in der Symbolleiste auf Jetzt lesen, um einen Lumineszenz-Lesevorgang durchzuführen. Exportieren Sie danach die RLU-Messungen für jede Vertiefung zur weiteren Analyse in eine Tabelle. Um ein Zellbildgebungsexperiment einzurichten, schalten Sie den Multimodus-Zellbildgeber ein und öffnen Sie die Software.

Wählen Sie im Task-Manager die Registerkarte Experimente und dann Neu erstellen aus. Klicken Sie in der Symbolleiste Datei auf die Registerkarte Protokoll und dann auf die Registerkarte Verfahren. Wählen Sie die Aktion Temperatur einstellen aus.

Stellen Sie den Inkubator auf Ein und die Temperatur auf 37 Grad Celsius. Aktivieren Sie Vorheizen und klicken Sie dann auf OK, um die Einstellungen zu speichern. Wählen Sie als Nächstes die Aktion Lesen aus.

Klicken Sie auf Bild als Erkennungsmethode. Wählen Sie dann den Lesetyp Endpunkt/Kinetic und den Optiktyp Filter aus und klicken Sie auf OK. Klicken Sie anschließend auf die Registerkarte Vollständige Platte, und wählen Sie die Vertiefungen auf der Platte aus, die abgebildet werden sollen. Klicken Sie auf OK, um die Einstellungen zu speichern.

Wählen Sie nun das Ziel "2,5-fach" aus der Dropdown-Option "Ziele" aus. Wählen Sie auf der Registerkarte Kanäle die Option GFP 469.525 und Hellfeld aus. Aktivieren Sie die Option "Automatische Belichtung" für beide Kanäle und wählen Sie das Feld für die automatische Belichtung aus.

Um die Autofokuseinstellungen festzulegen, klicken Sie auf Optionen. Wählen Sie für die Autofokus-Optionen die Methode Scan und dann Autofokus aus. Klicken Sie auf OK, um die Einstellungen zu speichern.

Stellen Sie danach den horizontalen und vertikalen Versatz von der Mitte der Vertiefung auf Null ein. Wählen Sie diese Option, um mehrere Bilder pro Vertiefung in einer Drei-mal-Zwei-Montage zu scannen. Klicken Sie dann auf OK, um die Verfahrenseinstellungen zu speichern.

Um das Experiment auf der ausgewählten Platte zu lesen, klicken Sie auf die Registerkarte Instrumentensteuerung und wählen Sie die Funktion Plate Out. Setzen Sie eine 96-Well-Platte auf den Plattenhalter und stellen Sie sicher, dass der Deckel aufgesetzt ist. Wählen Sie auf der Registerkarte Instrumentensteuerung die Funktion Plate In aus.

Wählen Sie als Nächstes auf der Registerkarte "Platte" die Option "Jetzt lesen" aus und wiederholen Sie den Lesevorgang alle 24 Stunden, bis zu 96 Stunden nach der Aussaat. Um ein Bild zu analysieren, klicken Sie auf der abgebildeten Platte auf die Registerkarte Daten und wählen Sie Bild GFP 469, 525 plus Hellfeld. Doppelklicken Sie dann auf die abgebildete Vertiefung.

Klicken Sie nun auf ein geladenes Bild. Wählen Sie Analysieren aus, und wählen Sie dann das einzelne Bild der Montage aus, das analysiert werden soll. Klicken Sie anschließend auf OK. Überprüfen Sie anschließend nur den GFP-Kanal und stellen Sie die Parameter wie in Tabelle 3 beschrieben ein.

Klicken Sie danach auf Start, um die Parameter auf die abgebildeten Zellen anzuwenden. Beobachten Sie die Zellzählmaske, die über den abgebildeten Zellen platziert ist und zur Bestimmung der Zellzahl pro Bild verwendet wird. Klicken Sie auf Änderungen übernehmen, und behalten Sie diese Einstellungen für jede Platte bei, die während des Experiments abgebildet wird.

In dieser Abbildung wurde eine lineare Regressionsanalyse durchgeführt, um die korrelativen Beziehungen zwischen den verschiedenen untersuchten Methoden zur Messung der Zellproliferation in MCF-7-LeGO-Zellen und MCF-7-delta 40p53-Zellen zu vergleichen. Es wurde ein Pearson-Korrelationskoeffizient berechnet und die Signifikanz zwischen den verschiedenen Methoden zur Messung der Zellproliferation bestimmt. Die stärkste Korrelation wurde zwischen dem Vergleich des Lumineszenz-basierten Assays und des Zell-Imagers beobachtet.

Hier sehen Sie die repräsentativen Bilder von GFP-positiven MCF-7-LeGO- und MCF-7-delta 40p53-Brustkrebszellen, die mit dem Zellbildgeber alle 24 Stunden erfasst wurden, bis die Zellen eine Konfluenz von nahezu 100 % erreichen. Diese Methode liefert nützliche zelluläre Informationen, einschließlich der Möglichkeit, das Zellwachstum über mehrere Tage hinweg visuell zu überwachen und die Zellgröße und Zellmorphologie zwischen verschiedenen Zelllinien zu vergleichen. Hier finden Sie eine Zusammenfassung der Vor- und Nachteile der einzelnen getesteten Methoden, die die Vielseitigkeit der einzelnen Methoden aufzeigt und den Lesern bei der Auswahl der am besten geeigneten Methode hilft.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis von drei verschiedenen Zellproliferations-Assays haben und in der Lage sein, zu bestimmen, welcher am besten zu Ihrem eigenen Versuchsdesign passt.