Selektive Markierung von Zelloberflächen-Proteinen unter Verwendung von CyDye DIGE Fluor Minimal Farbstoffe

Mein Name ist Maria und ich arbeite bei Y Healthcare in NOS in Schweden. Zelloberflächenproteine sind oft an der Kommunikation zwischen Zellen und ihrer Umgebung beteiligt und daher von besonderem Interesse in der Forschung, um mehr Einblicke in Krankheiten sowie andere biologische Variationen zu gewinnen, die durch Veränderungen in der Zellumgebung hervorgerufen werden. In diesem Video zeige ich Ihnen ein einfaches Protokoll zur Ausweich-Zelloberflächenmarkierung mit dem Seitenauge, und Sie werden in der Lage sein, diese Proteine mit geringen Häufigkeiten ohne physische Verbesserung visuell anzureichern und die Unterschiede dieser Zelloberflächenproteine mit der Technologie zu untersuchen.

Wenn Sie diese Technologie interessant finden, finden Sie weitere Informationen im 2D-Handbuch. Darüber hinaus haben wir eine Application Note zu diesem speziellen Thema, die Sie unter Job In dem oben gezeigten Zelloberflächenmarkierungsprotokoll markieren Sie die Zellen, während sie noch intakt sind. Während des Markierungsprozesses hat der Farbstoff nur Zugang zu den Proteinen der Zelloberfläche.

Nach dem Markierungsschritt werden die Zellen analysiert, um die spezifische Markierung der Zelloberfläche zu überprüfen. Die markierte Probe wurde in Membran- und zytosolische Proteine fraktioniert. Parallel dazu wurde eine nicht fraktionierte Probe hergestellt.

Zum Vergleich ist diese Fraktionierungsanalyse nicht notwendig, sondern wurde hier nur durchgeführt, um zu zeigen, dass das Zelloberflächenprotokoll spezifisch für Profi-Tipps für die Zelloberfläche ist. Wir haben auch das Standardprotokoll für die ETH-Nicht-Diät-Markierung durchgeführt, das unter den Zellen zu sehen ist, die vor der Markierung liegen, und auf diese Weise sind alle zellulären Proteine für die Markierung zugänglich. Nach dem Markierungsschritt werden die Proben einer 2D-Elektrophorese unterzogen.

Eine adhärente zelle wird mit einem nicht-enzymatischen Verfahren abgelöst, um die Verdauung der anvisierten Zelloberflächenproteine zu vermeiden. In diesem Protokoll verwenden wir den Gummipolizisten, aber die Verwendung von Enzym-Drei-Zell-Dissoziationsmedien ist auch eine Option, um die Zellsuspensionen in Quas von fünf bis 10 Millionen Zellen pro Röhrchen zu unterteilen. Die Zellen werden dann pelletiert und in H-P-S-S-P-H 7.4 gewaschen, um Spuren von Zellkulturen zu entfernen.

Eine Medienkontamination durch Serumproteine und fluoreszierende Komponenten kann die Markierung und Detektion beeinträchtigen. Zellen, die in Suspension wachsen, werden direkt pelletiert und vor dem Markierungsschritt nach dem Waschen gewaschen. Die Zellpalette wird in 200 Mikrolitern eiskaltem Markierungspuffer resuspendiert, der HPSS pH 8,5 und eine molare Urie enthält.

Für optimale Markierungsbedingungen von Proteinen auf der Zelloberfläche überprüfen Sie immer den pH-Wert. Vor der Beschriftung haben wir 600 pic Mold Side-Eye für 10 Millionen CHO-Zellen verwendet. Das optimale Verhältnis von Seitenauge zu Zellzahl variiert je nach Zelltyp.

Da wir die genauen Proteinkonzentrationen auf der Zelloberfläche nicht kennen. Wie die optimalen Bedingungen für die Side-Eye-Markierung von Proteinen bestimmt werden können, ist im Handbuch zu den Prinzipien und Methoden der 2D-Elektrophorese beschrieben. Die Zellen werden mit seitlichem Auge D-Boden inkubiert, minimal gewürfelt für 20 Minuten auf Eis im Dunkeln.

Nach der Markierungsreaktion wird der nicht reaktive Farbstoff durch Zugabe von 20 Mikrolitern 10 millimolares Lysin abgeschreckt. Die markierten Zellen werden nun zweimal in kaltem HPSS pH 7,4-Puffer gewaschen, um das überschüssige Seitenauge zu entfernen. Im nächsten Schritt, der Zelllyse, bleibt also kein freier Farbstoff mehr für unerwünschte intrazelluläre Markierungen oder Proteine.

Die Proteine auf der Zelloberfläche werden nun markiert und die Zellen sind gewaschen und bereit für die Likation. Das Pellet aus dem verlorenen Waschschritt wird in 150 Mikroliter kaltem Lysepuffer resuspendiert, der sieben molare Uren, zwei molare Thiurien, 4 % Chaps, 30 Millimolare Bäume, fünf Millimolare Magnesiumacetat mit einem pH-Wert von 8,5 enthält, und mindestens eine Stunde lang auf Eis belassen, wobei gelegentliches Vortexen anstrengend ist. Die Proben sind nun bereit für die 2D-Trennung.

Der erste Schritt in der Elektrolyse besteht darin, IPD-Streifen für die Rehydrierung vorzubereiten. Bereiten Sie die Distrikt-Rehydrationslösung vor, indem Sie IPG-Puffer hinzufügen, der dem pH-Intervall der verwendeten Streifen entspricht, und geben Sie die Lösung in die Linse der Rehydrationsschale. Entfernen Sie die Schutzfolie des IPG-Streifens und legen Sie die Streifen vorsichtig mit einem getrockneten Gel nach unten in die Rehydrationsschale, in der sich die Rehydrationslösung befindet.

Schließen Sie den Deckel der IPG-Box und rehydrieren Sie die Streifen über Nacht. In der ersten Dimension, der isoelektrischen Fokussierung, werden die Proteine nach ihrem pi getrennt. Dies geschieht mit dem IPG four three.

Die rehydrierten Streifen werden in den Verteiler eingelegt und die Elektrode darauf montiert. 50 Mikrogramm von jeder Probe wurden mit Hilfe von Probenapplikationskappen appliziert. Wir haben entweder direkt fraktionierte Proben ohne vorherige Fraktionierung aufgebracht oder die Proben vor der Anwendung in Membran- und zytosolische Fraktionen fraktioniert.

Das Kabel ist geschlossen, um die fluoreszierenden Proben vor Licht zu schützen. Das Gerät wurde nach Empfehlung programmiert und über Nacht laufen lassen. Große 12% Lamby-Gele wurden mit 12-Gel für Erwachsene berechnet.

Coster-Verdrängungslösung wurde zugegeben, um polymerisierte Acry-Gele in den Schläuchen zu vermeiden. Die Gele wurden vor der Verwendung über Nacht bei Raumtemperatur polymerisieren gelassen. Nach der isoelektrischen Fokussierung werden die Streifen entfernt und in SDS-haltigem Puffer in zwei Schritten unter Verwendung von DTT äquilibriert, um die Disulfidbindungen von Cysteinresten zu reduzieren, gefolgt von einer Alkylierung mit Ihrem Acetamid, um eine Modifikation durch Acrylamid zu vermeiden.

Die IPG-Streifen werden in Laufpuffer getaucht und vorsichtig auf die beiden großen Diggels gelegt. Vermeiden Sie den Lufteinschluss zwischen den Streifen und dem versiegelten Gel, indem Sie geschmolzene 2%ige Agrolösung mit Bromanolblau hinzufügen. Die Gele sind nun bereit für die zweite Dimension SDB-Seitentrennung In der zweiten Dimension SDB-Seite.

Die Proteine werden nach Molekulargewicht getrennt und dies geschieht mit dem tonalen Sechsersystem. Füllen Sie die Elektrophoresekammer mit anodischem Laufpuffer, legen Sie die Gele ein und füllen Sie das obere Fach mit dem kathodischen Laufpufferprogramm. Die Stromversorgung erfolgt gemäß den Empfehlungen und lässt die zweite Dimension vor Licht geschützt für etwa vier bis fünf Stunden laufen oder bis die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht.

Nach der Elektrophorese der zweiten Dimension werden die Gelkassetten mit Hilfe der Greifer im Taifun-Fluoreszenz-Imager platziert. Es können zwei Gele und drei Kanäle gleichzeitig gescannt werden. Das Ergebnis dieser beiden DL zeigt eine hohe Auflösung der Membranproteine in der Probe, auch wenn es einige bekannte Einschränkungen für hydrophobe Proteine gibt, die in A zwei DL nachgewiesen werden können. Die Ergebnisse zeigen viele neue Markierungspunkte auf der Zelloberfläche, die hier in rot dargestellt sind und mit dem hier in grün gezeigten Standardmarkierungsprotokoll nicht nachgewiesen werden.

Diese Ergebnisse zeigen, dass das Protokoll zur Markierung von Zelloberflächenproteinen hochspezifisch für die Markierung von Zelloberflächenproteinen ist. Da Zelloberflächenproteine ausschließlich markiert werden, können sie leichter sichtbar gemacht werden und eine Abschwächung durch reichlich vorhandene zytosolische Proteine wird vermieden. Oben ist das Fluoreszenzbild von Gelen mit nicht fraktionierter Membranfraktion oder zytosolischer Fraktion dargestellt.

Unten sehen Sie ein Bild von demselben Gel nach dem Färben mit Silber. Die Ergebnisse zeigen keine Fluoreszenzmarkierung von zytosolischen Proteinen, aber die Silberfärbung zeigt, dass sich Proteine in den Gelen befinden. Die Ergebnisse zeigen auch ähnliche Spot-Map-Muster von nicht fraktionierten und Membranfraktionen, was zeigt, dass vor der 2D-Elektrophorese keine Fraktionierung erforderlich ist, was dieses Protokoll sowohl einfach als auch bequem macht.

SI zwei, SI drei und SCI fünf zeigen ähnliche Markierungsmuster und sind alle mit dem Zelloberflächenprotokoll kompatibel. Es wurde ein Diätexperiment durchgeführt, bei dem alle drei seitlichen Augen-DI-Boden-Minimal-dy verwendet wurden, um die differentielle Expression von Zelloberflächenproteinen in CHO-Zellen des Serummangels über einen unterschiedlichen Zeitraum zu untersuchen. CY wurden zwei Zelloberflächenproben von allen Proben im Experiment gepoolt und als interner Standard verwendet.

Die unterschiedlichen Veränderungen verschiedener Zelloberflächenproteine konnten während der Hungerperiode verfolgt werden. Über 18 neuartige Membranproteine wurden mit dem Zelloberflächenprotokoll nachgewiesen, die mit dem Standardprotokoll zur Feststellung der Identität der Proteine im präparativen Gel nicht nachgewiesen wurden. Es war notwendig, mit der Zelloberflächenprobe zu spiken, um den Abgleich mit den Flecken auf dem analytischen Datensatz zu erleichtern.

Es gibt Ergebnisse. Die Ergebnisse zeigen eine hohe Auflösung einer großen Anzahl von Zelloberflächenproteinen. Dieses Protokoll ist sehr spezifisch für Zelloberflächenproteine und es wurde keine Markierung von intrazellulären Proteinen beobachtet.

Mit dieser Methode sind Sie in der Lage, im Vergleich zu einem Standardprotokoll mehr Zelloberflächenprotein nachzuweisen, und wie Sie bereits gesehen haben, ist es ein sehr einfach durchzuführendes Protokoll. Sie markieren einfach Ihre Zelloberflächenproteine, solange sie noch intakt sind, und lassen sie direkt auf der 2D-Elektrophorese ohne Membranfraktionierung laufen. Dies ist also ein sehr gutes Protokoll, um Zelloberflächenproteine und die Unterschiede zwischen denen mit der D-Technologie zu untersuchen.