Name: Selektive Markierung von Zelloberflächen-Proteinen unter Verwendung von CyDye DIGE Fluor Minimal Farbstoffe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Erfahren Sie eine einfache Methode zur fluoreszierenden Markierung von Zelloberflächenproteinen mit CyDye DIGE-Technologie. Dieses Protokoll ermöglicht die Anreicherung niedrig abundanter Proteine ohne Fraktionierung für die Proteomanalyse.

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Wir danken Professor Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer und Sigurd Krieger am Institut für Klinische Pathologie, Universität Wien, Österreich für ihre Mitarbeit.

Zellkultur <ol><li> Wachsen Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-K1) mit Standard-Zellkultur Verfahren in F-12 Ham Medium mit Glutamax I mit 10% fötalem Kälberserum, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin-Sulfat (Invitrogen). </li><li> Austausch des Kulturmediums auf serum-freien Medien. Beschriften Sie die Zelloberfläche Proteine ​​wurden zu verschiedenen Zeitpunkten mit CyDye DIGE Fluor Cy3 oder Cy5 minimal Farbstoffe (siehe Abschnitt Cell Surface Labeling, unten). </li><li> Pool gleiche Anzahl von Zellen, die aus jedem Zeitpunkt und Etikett mit CyDye DIGE Fluor Cy2. Verwenden Sie diese als interner Standard für die einzelnen 2-D-Gel. </li><li> Die Mehrzahl der Experimente lassen sich mit CHO-K1-Zellen durchgeführt werden, sondern Maus-Embryo-Fibroblasten (3T3 L1) und Maus-Aszites-Lymphom Lymphoblasten (EL4) können ebenfalls verwendet werden (Daten nicht gezeigt). </li><li> Wachsen die beiden letzteren Zelltypen in DMEM-Medium mit Glutamax II, aber sonst identische Bedingungen für die CHO-K1-Zellen verwendet. </li></ol> Zelloberfläche Kennzeichnung <ol><li> Vorsichtig lösen adhärente Zellen nicht-enzymatisch, Zählung und Einteilung in Aliquots von 5-10 x106 Zellen. Für in Suspension wachsenden Zellen, lassen die Ablösung Schritt. </li><li> Centrifuge die Zellsuspensionen bei etwa 800 xg für 5 Minuten. Entfernen Sie die Überstände mit dem Medium. </li><li> Waschen Sie die Pellets durch resuspendion in Balanced Salt 1 ml eiskalter Hanks Solution (HBSS) pH 8,5. Zentrifugiert bei 800 xg bei 4 ° C für 2 Minuten. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 200 ul eiskaltem Kennzeichnung Puffer (HBSS pH 8,5, 1 M Harnstoff). </li><li> Beschriften Sie die intakten Zellen mit 600 pmol CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoffe für 20 Minuten auf Eis im Dunkeln. </li><li> Die Reaktion wird durch Zugabe von 20 ul 10 mM Lysin. Inkubieren für 10 Minuten. </li><li> Waschen Sie die Oberfläche-markierten Zellen zweimal durch Resuspension in 500 ul HBSS pH 7,4, durch Zentrifugation bei 800 xg bei 4 ° C für 2 Minuten. </li></ol> Zelllyse und Fraktionierung <ol><li> Lyse der Oberfläche-markierten Zellen in 150 ul kaltem Lysepuffer (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM Magnesium-Acetat pH 8,5). Lassen Sie auf dem Eis für mindestens 1 h mit gelegentlichen Vortexen. </li><li> Centrifuge die Lysate bei 10 000 xg bei 4 ° C für 5 Minuten. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. Dieses Beispiel ist die nicht-fraktionierten Probe mit allen zellulären Proteinen. </li><li> In parallel, waschen Zellpellets, wie oben, dann fraktionieren (unter Verwendung einer Membran-Fraktionierung Kit, Pierce) in Membran-und zytosolischen Fraktionen vor 2-D-Gelelektrophorese. Die Membranfraktion enthält interne und Zelloberfläche Membranproteinen. </li><li> Zum Vergleich, folgen Sie den Standard-Ettan DIGE Verfahren 3 und lysieren, label, und schließlich Fraktionierung der Zellen. Bestimmen Sie die Protein-Konzentration in den Proben mit den 2 - D Quant Kit (GE Healthcare). </li></ol> 2-D Elektrophorese <ol><li> Rehydrieren Immobiline DryStrip Gele, pH 3-11NL (24 cm) mit Immobiline DryStrip Reswelling Tablett, 24 cm in 450 ul Strichen Rehydration-Lösung (0,5% IPG-Puffer) über Nacht. </li><li> Übernehmen Sie die CyDye-markierten Proben (entsprechend 50 ug Gesamt-Protein), um DryStrip Gele durch anodische cup loading in die vielfältigen Immobiline und führen isoelektrische Fokussierung (IEF) mit Ettan IPGphor II IEF-System gemäß den Anweisungen. </li><li> Nach IEF, bringen die Streifen in zwei Schritten und Platz auf der großen (26 x 20 cm) 12,5% igen Polyacrylamidgelen (SDS-PAGE). Overlay mit 0,5% Agarose (in Laufpuffer mit Bromphenolblau). Run 2-D Elektrophorese mit Ettan DALTtwelve Large Vertical-System mit 5 W / Gel für 30 min und dann bei 15 W / Gel bis der Farbstoff vor Erreichen der Unterseite des Gels. </li></ol> Imaging und Datenanalyse <ol><li> Nach Abschluss 2-D-Elektrophorese, scannen Sie die Gele für Cy2, Cy3 oder Cy5 mit einem Typhoon 9410 Variable Modus Imager. </li><li> Vergleichen Sie vor Ort Karten von Membranfraktionen, cytosolischen Fraktionen, und nicht-fraktionierten Proben mit DeCyder 2-D Differential Analysis Software 4. </li></ol> Post-Färbung <ol><li> Nach der Bebilderung Silberfärbung der Gele nach Standardverfahren 5. </li></ol> Protein Identifikation <ol><li> Anbauen, ernten, waschen und zu lysieren präparativen Mengen (etwa 1 mg Gesamt-Protein von 10 x106 CHO-Zellen) von Zellen, wie oben für eine nicht-fraktionierten Probe beschrieben. Verwenden Sie ein Cy5 Zelloberfläche markierten Probe (siehe oben) als Spitze und gelten zusammen mit dem unmarkierten präparative Mengen an Protein. </li><li> Führen Sie 2-D-Elektrophorese, wie oben beschrieben, aber dieses Mal, aplly 600 ug unmarkierte Zellen zusammen Lysat mit 50 ug Zelloberfläche gekennzeichnet Spike durch anodische cup Anwendung. Verwenden Sie Referenzmarken zu richtigen Stelle Kommissionierung zu ermöglichen, und legen Sie werdenzwischen den Glasplatten vor Gelgießen nach Empfehlungen 3. </li><li> Scannen Sie das Gel in Cy5 Kanal zum Cy5 Zelloberfläche Spotkarten von insgesamt Proteinanfärbung mit Deep purple Gesamtprotein Fleck 3, gefolgt erhalten. </li><li> Spiel zusammen die beiden vor Ort Karten mit dem DeCyder 2-D-Software und erstellen Sie eine Auswahlliste für alle Flecken entsprechend der Cy 5 beschriftet Zelloberflächenproteine. Wählen Zelloberflächenproteine ​​mit dem Ettan Ort Handling-Station, aus dem Gel-Stecker herausziehen und abtrypsinieren mit dem Ettan digester. Identifizieren mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie. </li></ol> Tabelle 1. Ein Ettan DIGE Experiment wurde durchgeführt unter Verwendung von Proben aus dem Serum verbraucht Zellen markiert nach der Zelloberfläche Proteinmarkierung Protokoll in Abb. 1 dargestellt. <table style="width: 517px; height: 139px;" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Probe </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Die Zeit des Serum-Depletion </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Labelled mit CyDye </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Gel-Nummer </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 1 </td><td style="text-align:center;"> - </td><td style="text-align:center;"> Cy 3, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 1 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 2 </td><td style="text-align:center;"> 30 Minuten </td><td style="text-align:center;"> Cy 5, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 1 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 3 </td><td style="text-align:center;"> 2 Stunden </td><td style="text-align:center;"> Cy 3, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 2 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 4 </td><td style="text-align:center;"> 4 Stunden </td><td style="text-align:center;"> Cy 5, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 2 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 5 </td><td style="text-align:center;"> 16 Stunden </td><td style="text-align:center;"> Cy 5, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 3 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Jang, J. H., Hanash, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+the+cell+surface+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Profiling of the cell surface proteome.</a> Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).</li>
<li>Shin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+the+cell+surface+proteome+of+cancer+cells+uncovers+an+abundance+of+proteins+with+chaperone+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function.</a> J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ettan+DIGE+System+User+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+user+manual+18-1164-40%22%5BJournal%5D)">Ettan DIGE System User Manual.</a> GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeCyder+2-D+Differential+Analysis+Software+v+6.0.+GE+Healthcare+data+file+11-0011-98+Edition+AA%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA.</a> , (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-D+Electrophoresis+using+immobilized+pH+gradients%2C+principles+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+handbook+80-6429-60+Edition+AB%22%5BJournal%5D)">2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods.</a> GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyDye+DIGE+fluors+and+labeling+kits.+GE+Healthcare+data+file+18-1164-84+Edition+AB%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB.</a> , (2003).</li>
<li>Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIGE+compatible+labeling+of+surface+proteins+on+vital+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo.</a> Proteomics. 2, 579-5785 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+labeling+of+cell-surface+proteins+using+CyDye+DIGE+Fluor+minimal+dyes.+GE+Healthcare+Application+Note+11-0033-92+Edition+AB%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB.</a> , (2005).</li>
</ol>

Protein-Konzentration Eine Übersicht über die beiden Kennzeichnung Workflows ist in Abbildung 1 dargestellt. Da die Zellen noch intakt sind, wenn sie gemäß der Zelloberfläche Proteinmarkierung Protokoll bezeichnet, werden nur die Zelloberflächenproteine, um den Farbstoff ausgesetzt. In der Standard-Ettan DIGE-Protokoll werden die Zellen lysiert vor der Etikettierung und Proteinen sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zelle gekennzeichnet sind (Abb. 1). Die relative Menge des Farbstoffs an Pr...

<table><tbody><tr><td>CyDye DIGE Kit, 2 nmol</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9345-30</td><td></td></tr><tr><td>2-D Quant Kit</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>IPG-Puffer pH 3-11NL</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6004-40</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6003-77</td><td></td></tr><tr><td>IPGbox</td><td>Werkzeug</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9334-65</td><td></td></tr><tr><td>IPGbox-Kit</td><td>Werkzeug</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9334-92</td><td></td></tr><tr><td>DeStreak-Rehydrierungslösung</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6003-19</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip-Abdeckflüssigkeit</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1335-01</td><td></td></tr><tr><td>Ettan IPGphor 3 IEF-Einheit</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0033-64</td><td></td></tr><tr><td>Ettan IPGphor-Manifold</td><td>Instrumentenkomponente</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6498-38</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTtwelve-Gelgussform</td><td>Werkzeug</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6467-22</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTtwelve-Trenneinheit und Netzteil/Steuerungseinheit</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6466-46</td><td>230-V-Gerät: 80-6466-27</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-81</td><td></td></tr><tr><td>Ettan Spot Picker</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1145-28</td><td></td></tr><tr><td>Ettan Digester</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-68</td><td></td></tr><tr><td>Ettan Spotter</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-67</td><td></td></tr><tr><td>Ettan MALDI-TOF</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-33</td><td></td></tr><tr><td>DeCyder 2-D Differenzialanalyse-Software</td><td>Sonstiges</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4012-01</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant Analyse-Software</td><td>Sonstiges</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9236-62</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1319-01</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1314-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne Dithiothreitol (DTT)</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1318-01</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1313-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne Glycerin 87 %</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1325-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne ReadySol IEF 40 % T, 3 % C</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1310-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne TEMED</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1312-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne Ammoniumpersulfat</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1311-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne Glycin</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1323-01</td><td></td></tr><tr><td>2-D-Probenpräparation für Membranproteine</td><td>Reagenz</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89864</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycinsulfat</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

selektive markierung von zelloberflächen-proteinen unter verwendung von cydye dige fluor minimal farbstoffe

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Oberflächen-Proteine ​​sind von zentraler Bedeutung für die Fähigkeit der Zelle auf ihre Umwelt reagieren und mit den benachbarten Zellen zu interagieren. Sie sind dafür bekannt, Induktoren von fast allen intrazelluläre Signalwege werden. Darüber hinaus spielen sie eine wichtige Rolle im Umweltschutz Anpassung und medikamentöse Behandlung, und sind oft in der Krankheitsentstehung und die Pathologie (1) beteiligt. Protein-Protein-Wechselwirkungen sind untrennbar mit Signalwegen, und einen tieferen Einblick in diese komplexe biologische Prozesse zu gewinnen, sind empfindlicher und zuverlässiger Methoden zur Untersuchung von Zelloberflächen-Proteine ​​benötigt werden. Zweidimensionale (2-D)-Elektrophorese wird weitgehend für den Nachweis von Biomarkern und anderen Zielen in komplexen Protein-Proben, um differentielle Änderungen Studie verwendet. Zelloberflächenproteine, teils wegen ihrer geringen Menge (1 2% der zellulären Proteine) sind schwierig, in einem 2-D Gel ohne Fraktionierung oder eine andere Art der Bereicherung zu erkennen. Sie sind auch oft schlecht in 2-D Gelen aufgrund ihrer hydrophoben Natur und mit hohem Molekulargewicht (2) vertreten. In dieser Studie präsentieren wir ein neues Protokoll für intakte Zellen mit CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoffe zur spezifischen Markierung und Erkennung von dieser wichtigen Gruppe von Proteinen. Die Ergebnisse zeigten, spezifische Markierung von einer großen Anzahl von Zelloberflächen-Proteine ​​mit minimalen Kennzeichnung von intrazellulären Proteinen. Dieses Protokoll ist eine schnelle, einfach zu bedienen, und alle drei CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoffen (Cy 2, Cy 3 und Cy 5) kann verwendet werden, um Zelloberflächen-Proteine ​​zu markieren. Diese Funktionen ermöglichen zum Multiplexen mit der 2-D-Fluoreszenz Difference Gel-Elektrophorese (2-D DIGE) mit Ettan DIGE Technologie und Analyse der Proteinexpression Änderungen mit DeCyder 2-D Differential Analysis Software. Die Höhe der Zelloberfläche Proteine ​​wurde während Serumentzug von CHO-Zellen für verschiedene Zeitspannen (siehe Tabelle 1). Kleine Veränderungen in Hülle und Fülle wurden mit hoher Genauigkeit erfasst und die Ergebnisse sind definiert durch statistische Methoden unterstützt.

Eine einfache und spezifische Methode wurde für Fluoreszenzmarkierung und verbesserte Erkennung von Zelloberflächen-Proteine ​​ohne Fraktionierung Schritt demonstriert. Differential Fülle in Zelloberflächenproteine ​​wurde mittels zweidimensionaler (2-D)-Elektrophorese und Ettan ™ DIGE Technologie.

Selektive Markierung von Zelloberflächen-Proteinen unter Verwendung von CyDye DIGE Fluor Minimal Farbstoffe

Oberflächenproteine sind entscheidend für die Fähigkeit der Zelle, auf ihre Umgebung zu reagieren und mit benachbarten Zellen zu interagieren. Es ist bekannt, dass sie Induktoren von ... sind.

Mein Name ist Maria und ich arbeite bei Y Healthcare in NOS in Schweden. Zelloberflächenproteine sind häufig an der Kommunikation zwischen Zellen und ihrer Umgebung beteiligt und deshalb von besonderem Interesse in der Forschung, um tiefere Einblicke in Krankheiten sowie andere biologische Variationen zu erhalten, die durch Veränderungen in der Zellumgebung hervorgerufen werden. In diesem Video werde ich Ihnen ein einfaches Side-Eye-Dodge-Protokoll zur Markierung von Zelloberflächenproteinen zeigen, mit dem Sie diese selten vorkommenden Proteine visuell anreichern können, ohne sie physikalisch zu verstärken, und die Unterschiede dieser Zelloberflächenproteine mithilfe der Technologie untersuchen können.Wenn Sie diese Technologie interessant finden, können Sie weitere Informationen im 2D-Handbuch finden. Außerdem verfügen wir über ein Anwendungsnotiz zu diesem speziellen Thema, die Sie von job herunterladen können. In dem oben gezeigten Protokoll zur Zelloberflächenmarkierung markieren Sie die Zellen, während diese noch intakt sind. Während des Markierungsprozesses hat der Farbstoff nur Zugang zu den Zelloberflächenproteinen.Nach dem Markierungsschritt werden die Zellen analysiert,

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

CFSE kovalent Etiketten langlebig intrazellulären Molekülen mit dem Fluoreszenzfarbstoff, Carboxyfluorescein. Als solche, als eine CFSE-markierten Zelle teilt, haben seine Nachkommen, die Hälfte der Menge der Fluoreszenz, die damit verwendet werden, um die Zellteilung zu beurteilen. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren, die üblicherweise zur Kennzeichnung Maus-Lymphozyten mit CFSE verwendet.

Die Verwendung von Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFSE) auf Lymphozyten-Proliferation-Monitor

Erfolgreicher Einsatz von Zell-Tracking Farbstoffe Immunzellfunktion und Proliferation zu überwachen umfasst mehrere wichtige Schritte. Wir beschreiben Methoden zur: 1) Erhalten hell, einheitliche, reproduzierbare Label-ten mit Membran Farbstoffe; 2) Auswählen Fluorochrome und Datenerfassung Bedingungen, und 3) der Auswahl eines Modells, die Zellproliferation auf Farbstoffdilution zu quantifizieren.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Wir beschreiben ein Verfahren, um Protein auf der Oberfläche von lebenden Neuronen mit einem spezifischen polyklonalen Antikörper, der an die extrazelluläre Epitope zu beschriften. Protein, das von dem Antikörper auf der Zelloberfläche gebunden und anschließend über Endozytose aus Protein verbleibende unterschieden werden können, oder an der Oberfläche während der Inkubation gehandelt.

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung von kleinen Molekül-bindenden Proteinen mittels Photoaffinitätsmarkierung. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass die Bindung und kovalente Markierung der Zielproteine in der lebenden zellulären Umgebung erfolgt, wodurch das Risiko einer Störung der nativen Proteinstruktur und der Bindungsbedingungen bei der Zelllyse ausgeschlossen wird.

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Lymphozyten sind die Hauptakteure bei adaptiven Immunantworten. Hier stellen wir ein Lymphozytenreinigungsprotokoll vor, um die physiologischen Funktionen der gewünschten Moleküle bei der Lymphozytenaktivierung in vitro und in vivo zu bestimmen. Die beschriebenen experimentellen Verfahren eignen sich zum Vergleich der Funktionsfähigkeit von Kontroll- und genetisch veränderten Lymphozyten.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

Die Live-Zell-Bildgebung der markierten Blutzellen im Augenkreis kann Informationen über Entzündungen und Ischämie bei diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration liefern. Ein Protokoll zur Etikettierung von Blutzellen und Bild der markierten Zellen in der Netzhautzirkulation ist beschrieben.

Fluoreszenzfarbstoff-Markierung von Erythrozyten und Leukozyten zum Studieren der Flußdynamik bei der Maus-Retinal-Zirkulation

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die multi-Color Lokalisierung der einzelnen Membranproteine in Organellen der lebenden Zellen. Um Fluorophore zu befestigen, sind selbst Kennzeichnung Proteine verwendet. Proteine, befindet sich in verschiedenen Membranen Kompartimenten des die gleichen Organellen lokalisiert werden können, mit einer Genauigkeit von ~ 18 nm.

Multi-Color-Lokalisierung Mikroskopie des einzigen Membranproteine in Organellen der lebenden Säugetier-Zellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Kennzeichnung Homogenität für jede Art von Protein in einer komplexen Protein-Probe auf der Einzelmolekül-Ebene zu bewerten.

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Das Protokoll beschreibt die spezifische Kennzeichnung von mitochondrialen Nukleoiden mit einem handelsüblichen DNA-Gelfleck, die Erfassung von Zeitrafferserien von Live-beschrifteten Zellen durch superauflösungsstrukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SR-SIM) und die automatische Verfolgung von Nukleoidbewegungen.

Spezifische Kennzeichnung von mitochondrialen Nukleoiden für die Zeitraffer-Struktur-Beleuchtungsmikroskopie

Vitale Fluoreszenzfarbstoffe sind wesentliche Werkzeuge für livezellbildende Analysen in der modernen Pilzzellbiologie. Dieses Papier beschreibt die Anwendung etablierter und weniger bekannter Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfolgung der Plasmamembrandynamik, Endo-/Exozytose und Zellwandmorphogenese in fadenförmigen Pilzen.

Anwendung von Membran- und Zellwandselektiven Fluoreszenzfarbstoffen für die Live-Zell-Bildgebung von filamentösen Pilzen

Wir präsentieren ein experimentelles Protokoll und einen Datenanalyse-Workflow zur Durchführung der zweifarbigen Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) in Kombination mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET), um die Membranrezeptordynamik in lebenden Zellen mit modernen Fluoreszenzmarkierungstechniken zu untersuchen.

Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen

Erfahren Sie eine einfache Methode zur fluoreszierenden Markierung von Zelloberflächenproteinen mit CyDye DIGE-Technologie. Dieses Protokoll ermöglicht die Anreicherung niedrig abundanter Proteine ohne Fraktionierung für die Proteomanalyse.

Selektive Markierung von Zelloberflächen-Proteinen unter Verwendung von CyDye DIGE Fluor Minimal Farbstoffe

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