LWL-Implantation für chronische optogenetische Stimulation des Hirngewebes

Ziel des folgenden Experiments ist es, neuronale Schaltkreise bei wachen, sich verhaltenden Mäusen langfristig zu aktivieren und zu untersuchen. Diese Methode ist eine Adaption des Konzepts, das ursprünglich in Sparta etal beschrieben wurde. Dies wird erreicht, indem zunächst ein faseroptisches Verbindungskabel konfektioniert wird, das das optische Drehgelenk mit dem faseroptischen Implantat verbindet.

Als nächstes wird die Faseroptik über das interessierende Gehirngewebe implantiert, um einen Durchgang zu schaffen, durch den das Licht direkt zu den kanalisierenden Redin-exprimierenden Neuronen gelangen kann. Abschließend wird die Lichtquelle mit dem optischen Drehgelenk verbunden, um einen seriell verbundenen Weg von der Lichtquelle zum Hirngewebe zu schaffen. Letztendlich kann das lichtinduzierte Feuern von Neuronen, die Redsin exprimieren, auf der Grundlage von in vivo, Elektrophysiologie und Verhaltensstudien untersucht werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Führungskanülen besteht darin, dass sie die Schädigung des Hirngewebes durch wiederholtes Einführen und Entfernen einer optischen Faser minimiert. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Funktion neuronaler Schaltkreise geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, um die synapsen- und schaltkreisabhängigen Mechanismen, die bestimmten Arten von neurologischen Störungen zugrunde liegen, besser zu verstehen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung.

Da die Implantationsschritte schwer zu meistern sind, trägt jeder scheinbar kleine Schritt wesentlich zur Gesamtstabilität und Zuverlässigkeit der Methode bei. Beginnen Sie mit dem Schneiden von 35 Millimetern einer Glasfaser mit einem Durchmesser von 125 Mikrometern und einem Kern von 100 Mikrometern, indem Sie einen Hartmetallritzer mit Keilspitze senkrecht zur Glasfaser positionieren und die Faser in einer einzigen unidirektionalen Bewegung einritzen, gefolgt von einem geraden Herausziehen. Setzen Sie nun eine lc-Keramik mit einer konvexen Seite mit einem Durchmesser von 127 Mikron in einer Bohrung nach unten in einen Schraubstock ein und führen Sie dann das Glasfaserstück in die Feral ein.

Die Glasfaser sollte glatt eingleiten und geringfügig über das konvexe Ende des Ferals hinausragen. Tragen Sie als Nächstes einen Tropfen frisch zubereitetes, wärmehärtendes faseroptisches Epoxidharz auf das flache Ende des Ferals auf und tragen Sie dann eine Heißluftpistole auf das Epoxidharz auf. Das Epoxidharz sollte das Wildfleisch füllen, wenn es erhitzt wird, und aushärten, wenn es schwarz wird.

Reinigen Sie nach dem Aushärten jegliches Epoxidharz von den Seiten des Ferals und machen Sie dann mit einer LC-Glasfaser-Polierscheibe kreisförmige Rotationsmuster, um das konvexe Ende des Wilden auf Aluminiumoxid zu polieren Polierbleche auf einem Polierpad in vier abnehmenden Graden. Schneiden Sie dann die Glasfaser am flachen Ende auf die entsprechende Länge ab, um den interessierenden Bereich anzuvisieren. Um die polierte Faseroptik zu testen, führen Sie das polierte Ende des Implantats in die Hülse des Kupplers ein.

Bis der direkte Kontakt mit dem gegnerischen Wilden zu spüren ist, hat ein schlechtes Implantat einen schwachen Brennpunkt in der Nähe der Spitze der Faseroptik, während ein gutes Implantat einen glatten konzentrischen Lichtkreis ohne Ausgang überträgt. Leistungen von bis zu 10 Milliwatt bewahren die fertigen Implantate bis zum Einsatz in Schaumstoff auf. Beginnen Sie diesen Schritt, indem Sie eine Glasfaser mit einem Durchmesser von 220 Mikrometern und einem Kern von 200 Mikrometern messen und dann ritzen, damit sich eine Maus frei bewegen kann, die Maus jedoch nicht an der Faser kauen kann.

Führen Sie dann die Glasfaser in ein Stück Furationsschlauch ein, dessen Innendurchmesser etwas größer und eine Länge etwas kürzer ist als die der Glasfaser. Lösen Sie nun etwa 25 Millimeter von einem Ende der Glasfaser ab und stecken Sie sie in das Metallende einer Multimode-FC-MM-Feral-Baugruppe. Mit einer Bohrung von 230 Mikrometern in einer Bohrung bis zum Anschlag sollte die Glasfaser durch das wilde Ende ragen.

Sichern Sie als nächstes die Verbindung mit Cyanacrylat am Metallende und decken Sie die Verbindung mit einem Verbinder ab. Stiefelpolieren Sie das wilde Ende mit einer FC-Polierscheibe, wie gerade gezeigt. Nachdem Sie das andere Ende der Faseroptik entfernt haben, setzen Sie es in eine LC-Keramik ein, wobei nur das konvexe Ende distal istal. Tragen Sie dann einen Tropfen Epoxidharz auf das flache Ende auf und erhitzen Sie, bis es wie gerade gezeigt ausgehärtet ist.

Nachdem Sie das konvexe Ende des Ferals poliert haben, wie gerade gezeigt, schieben Sie eine lc Feral-Hülse über das konvexe Ende der Feral, bis die Feral den Mittelpunkt der Hülse erreicht. Legen Sie dann einen Schrumpfschlauch über den Schlauch und die Hülse und erhitzen Sie den Schrumpfschlauch, um die Verbindung zu sichern und zu schützen. Schließen Sie schließlich den Feral an die Laserquelle an und testen Sie ihn, indem Sie die Lichtleistung durch den Koppler mit einem Spektralphotometer messen, der Lichtverlust zwischen der Laserleistung und der gemessenen Kopplerleistung sollte 30 % nicht überschreiten, bevor Sie mit der Operation beginnen.

Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit Isop-Profilalkohol, gefolgt von Chlorhexidinlösung. Platzieren Sie als Nächstes die Maus in das stereotaktische Rig und sichern Sie den Kopf, so dass der Schädel waagerecht ist. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen des Tieres auf, um Trockenheit und postoperative Schmerzen zu vermeiden.

Machen Sie nun einen Schnitt durch die Mittellinie der Kopfhaut, um den Schädel von den Augenhöhlen bis zur Lambda-Naht freizulegen. Verwenden Sie Serafin-Klemmen, um die Haut zurückzuhalten und den Zugang zum Schädel zu erhalten. Verwende dann einen Zahnstocher, um ein kariertes Muster auf der Oberfläche des Schädels zu ätzen.

Waschen Sie die entstehenden Rückstände mit steriler Kochsalzlösung ab. Nach dem gründlichen Trocknen tragen Sie mit einem Wattestäbchen etwa zwei bis drei Sekunden lang 3%iges Wasserstoffperoxid auf den freiliegenden Schädel auf, um Mikroporen zu erzeugen. Waschen Sie dann den Schädel mehrmals mit sterilerer Kochsalzlösung und trocknen Sie ihn gründlich ab.

Nachdem Sie das Schachbrettmuster in den Schädel geätzt, gewaschen und getrocknet haben, setzen Sie das faseroptische Feral-Implantat wieder in den Sondenhalter ein und verbinden Sie es dann mit dem stereotaktischen Arm. Bestimmen Sie die Position des Bohrlochs mit einem stereotaktischen Atlas, der auf bgma und lambda kalibriert ist. Verwenden Sie dann einen rotierenden Zahnbohrer, um eine kleine Bohrlochkraniotomie mit einem Durchmesser von weniger als einem Millimeter über dem interessierenden Bereich durchzuführen, wobei Sie darauf achten sollten, die Dura nicht zu brechen oder Gewebe zu beschädigen.

Mit dem stereotaktischen Arm positionieren Sie das Implantat direkt über der interessierenden Region, das Wilde sollte auf dem umgebenden Schädelgewebe ruhen. Tragen Sie nun mit einem sterilen Zahnstocher eine dünne, gleichmäßige Schicht frisch zubereiteten Zahnzements über den Schädel und auf den unteren Teil des Implantats auf. Achten Sie darauf, nicht mit der Haut des Tieres in Berührung zu kommen, und die Basisschicht aus Zahnzement sollte so viel Oberfläche wie möglich auf dem Schädel bedecken.

Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist das Auftragen des Zahnzementes, ohne dass er die Massehaut berührt. Um den Erfolg zu gewährleisten, tragen Sie jeweils kleine Mengen Zement in dünnen Schichten auf und warten Sie, bis jede Schicht vollständig getrocknet ist, bevor Sie die nächste hinzufügen. Tragen Sie gleichmäßige Schichten des Zahnzementes auf, um einen kleinen Hügel auf dem Schädel und um das Implantat herum zu bilden.

Lassen Sie die drei bis fünf Millimeter des konvexen Endes des wilden Endes frei von Zement, um eine glatte, ungehinderte Verbindung zu ermöglichen. Dann nähen Sie die Kopfhaut über den Zahnzementhügel und um das Implantat herum kann Vet Bond Adhesive zur zusätzlichen Bindung nach dem Nähen verwendet werden. Tragen Sie abschließend topische Analgetika und Antibiotika auf die Nahthaut und um die Basis des Implantats auf und setzen Sie die Maus dann zur postoperativen Genesung in einen Käfig.

Die ordnungsgemäße Montage des faseroptischen Implantats und des Kopplers führt zu einem minimalen Photonenverlust zwischen der Lichtquelle und dem Ende der Faseroptik im interessierenden Bereich. Während polierte Faseroptiken Licht in einem gleichmäßigen konzentrischen Kreis ähnlich dem hier gezeigten Kreis durchlassen sollten, wie in diesem Bild durch sorgfältige Implantation und Naht zu sehen ist, verursacht das Implantat bei sorgfältiger Implantation und Naht keine sichtbare Reizung der Maus und kann für Langzeitstudien an Ort und Stelle bleiben, ohne dass sich die Faseroptik oder die übertragene Lichtmenge signifikant verschlechtern. Funktionelle Verhaltensassays bei einer wachen Maus zeigen eine direkte Reaktion auf die Stimulation durch eine Faseroptik, die über dem motorischen Kortex implantiert wird, wie diese in vivo elektrophysiologischen Videodaten zeigen, die die Aktivierung von Zielneuronen durch das Implantat und die Verhaltensreaktion des Tieres während der Hirnstimulation zeigen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Photostimulation von Zielhirnregionen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. welche Muster der Schaltkreiskonnektivität mit den Zielzellen verbunden sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man faseroptische Implantate und Kopplerstränge zusammenbaut und wie man sie über Gehirngewebe implantiert, das optogenetische Porter exprimiert.