Selektive Viral Transduktion von Adult-geboren olfaktorischen Neuronen für chronische In vivo Optogenetische Stimulation

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, Neuronen des Riechkolbens per Fernbedienung zu aktivieren und zu beobachten, wie sich ihre Aktivierung auf das Verhalten auswirkt. Dies wird durch die Einführung eines Trendgens des Kanals Redin zwei, gekoppelt an YFP, in Zielneuronen von Erwachsenen mit stereotaktischen Injektionen eines lentiviralen Vektors erreicht. Dann wird eine LED kalibriert und für die Implantation vorbereitet, um eine allgemeine Vorstellung von der Lichtmenge zu erhalten, die in das Gehirn übertragen wird.

Der letzte Schritt des Eingriffs ist die Implantation der LED über dem Riechkolben, um ihre korrekte Positionierung und Befestigung zu gewährleisten. Letztendlich wird die neuronale Aktivierung durch CFOs, Immunfärbungen und die Ergebnisse von Verhaltenstests bestätigt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der standardmäßigen elektrischen Stimulation oder pharmakologischen Störungen besteht darin, dass die optogenetische Stimulation markierter Neuronen sowohl hinsichtlich der Art als auch der Anzahl der aktivierten Neuronen sehr spezifisch ist.

Die Implikation dieser Technik steht für die Therapie oder Diagnose neurodegenerativer Erkrankungen aufgrund der präzisen zeitlichen und räumlichen Steuerung zur Verfügung. Diese Methode kann Aufschluss über die Rolle adulter Knochenneuronen im olfaktorischen Knochennetzwerk geben. Es kann auf andere oberflächliche Regionen wie die kortikalen oder zerebralen Lungenneuronen angewendet werden.

Beginnen Sie damit, vorbereitete Vektortiter aus dem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius zu holen. Bewahren Sie sie vor der Verwendung ein und entsorgen Sie übrig gebliebene Titer. Schneiden Sie die Spitze der gepoolten Boro-Quarzglas-Pipetten mit einer Schere ab.

Ziel ist es, Spitzen mit einem Durchmesser von 30 bis 40 Mikrometern herzustellen. Bewahren Sie die vorbereiteten Pipetten in einer staubfreien Box auf. Richten Sie als Nächstes einen Mikroinjektor ein, um eine mit Mineralöl vorbereitete Pipette mit 50 Nanolitern Rückfüller zu injizieren, und führen Sie sie in den Mikroinjektorkolben ein, der am stereotaktischen Rahmen befestigt werden sollte.

Sobald der Virustiter aufgetaut ist, entleeren Sie teilweise Öl aus der Glaspipette und füllen Sie sie dann wieder mit dem Titer auf. Übertragen Sie zwei Mikroliter Virus auf ein steriles Stück Para-Film. Senken Sie die Glaspipette vorsichtig in den Tropfen und füllen Sie die Pipette mit ein bis zwei Mikrolitern Virus.

Vergewissern Sie sich, dass sich keine Luftblasen in der Pipette befinden, und fahren Sie dann mit der Vorbereitung des Tieres fort, nachdem Sie eine Maus mit Ketamin und Xylazin, verdünnt in steriler Kochsalzlösung, betäubt haben. Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht auf Schmerzreize reagiert, z. B. auf ein Zehenkneifen, bevor Sie fortfahren. Entfernen Sie nun die Haare von der Kopfhaut der Maus und desinfizieren Sie die Kopfhaut.

Setzen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen und befestigen Sie den Kopf mit Ohrstangen und einer Nasenstange mit einem Skalpell. Schneiden Sie die Kopfhaut zwischen den Augen bis zwischen den Ohren ein. Ziehe die Haut zur Seite, um den Schädel freizulegen, und verankere die Haut mit einem Paar Klammern.

Reinigen Sie dann die Oberfläche des Schädels mit steriler Kochsalzlösung. Die stereotaktische Apparatur wird mit der Spitze der Glaspipette bei breg ma auf Null gesetzt. Positionieren Sie dann die Spitze an der Injektionsstelle.

Passen Sie die Position der Nasenstange entsprechend der Berechnung der stereotaktischen Koordinaten an. Anhand dieser Koordinaten werden das bgma und die Injektionsstelle auf die gleiche Höhe ausgerichtet. Bohren Sie mit einem chirurgischen Hochgeschwindigkeitsbohrer an jeder Injektionsstelle vorsichtig ein kleines Loch in den Schädel.

Achten Sie darauf, dass Sie Ihre Blutgefäße auf der Oberfläche des Gehirns beim Bohren nicht aufreißen. Entfernen Sie nun mit einer gebogenen Spritzennadel an der Spitze die Reste des dünnen Knochens, um den URA mater freizulegen. Vergewissern Sie sich, dass das Loch an der richtigen Position zentriert ist.

Senken Sie die Pipette ab und stellen Sie die dorsale Bauchhöhe auf Null. Wenn die Spitze der Pipette die Oberfläche des Gehirns berührt, senken Sie die Pipette auf die richtige dorsale Tiefe ab und warten Sie 30 Sekunden, bis das Druckgleichgewicht erreicht ist. Injizieren Sie nun viermal 50 Nanoliter Virus, also insgesamt 200 Nanoliter Virus, und warten Sie 30 Sekunden zwischen den Injektionen.

Eine Minute nach der letzten Injektion ziehen Sie die Pipette langsam zurück und nehmen Sie die Maus aus dem Gerät. Reinigen Sie die Inzisionsstelle mit Betadine-Lösung und nähen Sie die Haut. Lassen Sie die Maus mit chirurgischem Faden auf einem Wärmekissen erholen, bevor Sie sie schließlich in ihren Käfig zurückbringen, bevor Sie die blaue Miniatur-LED implantieren.

Für die optogenetische Stimulation muss es vorbereitet und getestet werden. Verkauft werden die LED-Pins an einer elektrischen Buchse, so dass der Stecker auf der gegenüberliegenden Seite der LED positioniert ist. Vergewissern Sie sich, dass kein elektrischer Kurzschluss vorliegt, und identifizieren Sie den Plus- und Minuspol am Stecker.

Testen Sie abschließend die LED, indem Sie sie an einen LED-Controller anschließen, um die absolute Lichtleistung der LED-Halterung zu messen oder einzustellen, die LED auf einem Mikromanipulator und bereiten Sie den Belichtungsmesser vor. Bohren Sie ein drei Millimeter großes Loch in eine undurchsichtige PVC-Platte und befestigen Sie dieses Loch am Leistungsmesser. Positionieren Sie nun die LED in direktem Kontakt mit dem Fotodetektor des Powermeters und messen Sie bei der maximalen LED-Lichtintensität, die in der Regel bei vier 70 Nanometern liegt.

Verwenden Sie den Leistungsmesser, um eine Standardkurve der optischen Leistung im Vergleich zum Eingangsstrom zu erstellen. Verwenden Sie dann die zur Berechnung der Leistung pro Quadratmillimeter, um die Ausbreitung von Licht durch das Gehirn zu messen. Erhalten Sie Vibram geschnittene Blöcke aus frischem Hirngewebe mit einer Dicke von 300, 500, 1000, eintausendfünfhundert und zweitausendfünfhundert Mikrometern Dicke, indem Sie ein Schädelstück mit einer Kraniotomie erhalten, die mit der bei lebenden Mäusen identisch ist.

Platzieren Sie es zwischen der LED und dem Detektor. Messen Sie nun die Lichtleistung ohne Gewebe. Platzieren Sie dann jeden Gewebeblock zwischen der LED und dem Fotodetektor des Leistungsmessers und messen Sie die Leistungsänderung.

Erstellen Sie eine Kurve der Gewebedicken im Vergleich zum relativen Transmissionsanteil. Der Transmissionsanteil ist das Verhältnis der durch das Gewebe gemessenen Leistung im Vergleich zu ohne das Gewebe. Verwenden Sie diese Daten, um die LED zu kalibrieren und dann mit der Implantation fortzufahren.

Bereiten Sie die LED und den Stecker vor, indem Sie sie mit 70 % Ethanol desinfizieren und den Stecker an einer stereotaktischen Halterung befestigen. Nachdem Sie eine betäubte Maus in den stereotaktischen Rahmen eingesetzt haben, verwenden Sie eine Nasenstange, um die Oberfläche des Schädels perfekt horizontal und parallel zur Oberfläche der Miniatur-LED auszurichten. In diesem Fall wird der Bereich des Schädels, der dem Riechkolben entspricht, ausgerichtet.

Schneiden Sie nun mit einem Skalpell die Kopfhaut von drei Millimetern vor den Augen bis drei Millimeter hinter den Ohren ab. Ziehen Sie die Haut zur Seite und verankern Sie sie mit einem Paar Klammern. Kratzen Sie die Membranen an der Oberfläche des Schädels mit einer Rasierklinge ab.

Bereiten Sie sich darauf vor, eine rechteckige Kraniotomie über den Off-Effekt-Glühbirnen durchzuführen. Zuerst dünnen Sie den Schädel mit einem Hochgeschwindigkeitsbohrer vorsichtig aus, bis nur noch eine dünne Knochenschicht übrig bleibt. Entfernen Sie anschließend vorsichtig den restlichen Knochen mit Hilfe einer verbogenen Spritzennadel.

Vermeiden Sie es, die Dura mater zu durchstechen. Spülen Sie nun das Operationsgebiet mit steriler Kochsalzlösung ab und trocknen Sie anschließend den Schädel. Nach der Reinigung und Trocknung des freiliegenden Schädels tragen Sie eine dünne Basisschicht aus Cyanacrylatkleber auf den Schädel auf, um später das Zahnacrylat zu verkleben.

Das Hinzufügen von zwei kleinen Schrauben kann erforderlich sein, um die LED zu befestigen. Die Schrauben sollten hinter der LED in den Schädel eingesetzt und mit beiden Acrylfarben bedeckt werden. Nachdem Sie den LED-Stecker an der Halterung befestigt haben, senken Sie die Miniatur-LED über den Riechkolben ab, wobei ihre Hauptachse parallel zur rostralen Cordnachsen verläuft.

Befestigen Sie dann die LED mit zwei Schichten Dentalacryl am Schädel. Während das Acryl noch flüssig ist, ziehen Sie die freien Ränder der Kopfhaut zurück und kleben Sie sie auf zwei Schichten Dentalacryl. Achten Sie darauf, kein Acryl auf den Verbinder aufzutragen, nachdem das Acryl ausgehärtet ist.

Nehmen Sie das Tier aus dem Rahmen und lassen Sie es auf einem Wärmekissen aufwachen. Nach der Rückkehr in den Käfig dauert die vollständige Genesung mindestens sieben Tage später. Ein dünnes leichtes elektrisches Kabel wird verwendet, um das Tier an einen LED-Controller zu binden, was viel Bewegungsfreiheit ermöglicht, wobei die Polarität des Drahtes als invertiert zu beachten ist.

Die Polarität kann die LED beschädigen. Entfernen Sie nach dem Experiment die LED, um sicherzustellen, dass es sich um funktionsfähiges CH-Opsin handelt. Zwei YFP wurden etwa 48 Stunden nach der Injektion in transduzierten Neuronen exprimiert und blieben mehrere Monate lang stabil.

Ein sagittaler Schnitt eines paraldehydfixierten Tieres 15 Tage nach der Injektion zeigte eine dichte Markierung und die Größe der Injektionsstelle. Im RMS wanderte eine große Anzahl neugeborener Zellen entlang des RMS, um die verschiedenen Schichten des Riechkolbens zu besiedeln. Das Fusionsprotein wurde in allen Neuronenkompartimenten exprimiert, einschließlich der Soma-Dendriten und -Dornen.

Die Miniatur-LED-Implantation ermöglichte eine großflächige und kostengünstige optische Stimulation eines breiten interessierenden Bereichs, indem sie die Lichtstreuung im Hirngewebe und die Schwelle der Aktivierung von Kanal-Redin Two charakterisierte. Es wurde geschätzt, dass die optische Aktivierung in einer Tiefe von etwa zwei Millimetern unter der Oberfläche der LED ausgelöst wird, um die funktionelle Aktivierung der Kanaladoption, zwei exprimierende Neuronen in vivo, zu überwachen. Der Ausdruck von CFOs.

Ein Marker für die neuronale Aktivität nach wiederholter Lichtstimulation wurde analysiert. Ein Meister. Diese Technik kann in einer Stunde durchgeführt werden, um das Virus zu injizieren, und nach mindestens drei Wochen zwei weitere Stunden, um LAD zu implantieren.

Die Kalibrierung von LAD ist wichtig und nimmt zusätzliche Zeit in Anspruch. Andere Methoden, wie z.B. die elektrochirurgische In-vivo-Aufzeichnung, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Beziehung zwischen der Aktivierung eines Zelltyps und der Reaktion in einem anderen nach seiner Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der systemischen Neurowissenschaften den Weg, um genaue Korrelationen zwischen der Aktivierung von Neuronen bei Neugeborenen und der Geruchswahrnehmung im olfaktorischen System der Maus zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen viralen Vektor mit STEREOTAKTISCHEN Koordinaten injiziert, wie man eine LED für die Implantation vorbereitet und kalibriert, wie man die LED implantiert und wie man Sauerstoff und Stimulation verwendet, um Verhaltensexperimente durchzuführen. Bitte denken Sie auch daran, dass die Verwendung von viralen Vektoren äußerst gefährlich sein kann und dass geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. eine angemessene Schulung und Entsorgung gefährlicher Materialien.