Mit hochauflösenden Computertomographie, die dreidimensionale Struktur und Funktion pflanzlicher Gefäßsystem Visualisieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe der Synchrotron-basierten Röntgen-Mikrotomographie-Technologie die Struktur und Funktion des Gefäßtransports in Pflanzen zu erforschen. Dies wird erreicht, indem zunächst Proben für den Einbau in einen Futterhalter oder den Lebendpflanzenhalter vorbereitet werden, wobei sichergestellt wird, dass der zu scannende Teil so vertikal wie möglich ist, und die erforderlichen physiologischen Vormessungen durchgeführt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die vorbereiteten Proben oder lebenden Pflanzen in den A LS Beamline 8.3 0.2 Stall zu legen und den Stall für das Scannen zu sichern. Nächster.

Nach der korrekten Positionierung der Probe wird der Scan eingeleitet. Der letzte Schritt besteht darin, die Workstation-Computer zu nutzen, um die Qualität des Scans zu normalisieren, zu rekonstruieren und zu bewerten, bevor die Daten für den 3D-Visualisierungsprozess an ein VISO übergeben werden. Schließlich wird die Röntgen-Mikrotomographie eingesetzt, um feine Details der Zusammenhänge und des Funktionszustands des wasserleitenden Gefäßsystems in Pflanzen sichtbar zu machen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie seriellem Schneiden und Lichtmikroskopie besteht darin, dass pflanzliches Gewebe in jeder Ausrichtung mit bisher unerreichter Auflösung untersucht werden kann. Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Pflanzenbiologie zu verstehen, von grundlegenden Aspekten des Wassertransports in Pflanzen über Trockenheit bis hin zur Frosttoleranz gegenüber der systemischen Ausbreitung von Krankheitserregern in Wirtspflanzen. Dieses Protokoll ist, wie beschrieben, für die Arbeit an der fortschrittlichen Lichtquelle ausgelegt.

8,3 0,2. Für Arbeiten an anderen Synchrotronanlagen können Beamline-Anpassungen erforderlich sein. Achten Sie darauf, die Sicherheits- und Strahlenschulung zu befolgen, die für die Nutzung dieser Einrichtungen erforderlich ist, um mit der Probenvorbereitung für lebende Pflanzen zu beginnen.

Züchten Sie die Pflanzen zunächst in Töpfen mit einem Durchmesser von etwa 10 Zentimetern und stellen Sie sicher, dass der Hauptstiel oder ein anderer Teil der Pflanze, der gescannt werden soll, so zentriert wie möglich und vertikal im Topf ausgerichtet ist. Die physikalischen Abmessungen des HRCT-Instruments Hutch begrenzen lebende Pflanzen auf eine Höhe von etwa einem Meter. Infolgedessen wird die Bildgebung von lebenden Pflanzen am besten an Sämlingen oder Setzlingen durchgeführt.

Wenn Sie in kleinen Töpfen gezüchtet werden, verwenden Sie einen speziell angefertigten starren Aluminium-Topfhalter, um die lebenden Topfpflanzen zu montieren. Die Höhe der oberen Platte sollte angepasst werden, um eine Reihe von Topfhöhen aufzunehmen. Hier ist die Oberseite der Platte so gestaltet, dass sie mit der Oberseite der Bodenoberfläche übereinstimmt und die Pflanze aus der Mitte der zweiteiligen Platte herausragt.

Nach der Montage in der Halterung messen Sie das Wasserpotenzial des Stängels mit einer SHO-Lander-Druckkammer oder einem Clip-on-Blattparameter, um den physiologischen Zustand der Pflanze vor dem Scannen zu bestimmen. Drehen Sie ein kleines Stück Kupferdraht um den Stängel, um eine konsistente Scanposition bei Pflanzen zu gewährleisten, die wiederholt gescannt werden. Platzieren Sie nun einen dünnwandigen Acrylzylinder über der Pflanze auf dem Pflanzenhalter aus Aluminium und befestigen Sie ihn mit Schrauben, um die Probe zu stabilisieren.

Zusätzliche Plastikfolie, Papiertücher und Klebeband sollten verwendet werden, um Vibrationen und Bewegungen von Pflanzenteilen weiter zu minimieren, die zu Bildverzerrungen führen können. Befestigen Sie den maßgefertigten Topflappen an der luftgelagerten Bühne und verriegeln Sie ihn zwischen der Röntgenquelle und dem Bildsensor und der Kameraausrüstung. Achten Sie darauf, den Stiel so vertikal wie möglich zu positionieren und die Probe auf der Basis der Magnetplatte zu zentrieren, um sicherzustellen, dass sie im Sichtfeld bleibt. Während der Rotation kann frisches Pflanzenmaterial, in der Regel Stängel oder Haustiere, nach der sofortigen Entnahme aus einer lebenden Pflanze gescannt werden.

Wenn das Ziel des Experiments darin besteht, das gesamte Xylemnetzwerk sichtbar zu machen, muss das Wasser in den Gefäßen zunächst evakuiert und durch Luft ersetzt werden. Montieren Sie dazu die Probe in einer Verleumdungsdruckkammer und drücken Sie Druckluft oder Stickstoff etwa fünf Minuten lang bei niedrigem Druck durch die Probe. Die Arten unterscheiden sich in der Zeit, die für die Evakuierung des Schiffsnetzes benötigt wird.

Wenn die Absicht darin besteht, das Ausmaß der Emboliebildung im frischen Pflanzengewebe zu beurteilen, entfernen Sie Proben aus der Pflanze mit einer frischen Rasierklinge, um die Schnitte unter Wasser zu machen. Als nächstes wickeln Sie die Probe in eine Schicht Paraform ein, um eine Austrocknung während des Scans zu verhindern, setzen Sie die Probe in ein Bohrfutter, das an einer Metallplatte befestigt ist, die in die Mitte des luftgelagerten Tisches eingeschraubt ist, und richten Sie die Probe wie zuvor beschrieben vertikal aus, um sicherzustellen, dass die Probe im Sichtfeld bleibt. Um Proben aus getrocknetem holzigem Gewebe vorzubereiten, schneiden Sie die Proben zunächst auf eine Länge von etwa sechs Zentimetern.

Wählen Sie Proben aus, die im Zielscanbereich so gerade wie möglich sind und einen Durchmesser von etwa einem Zentimeter haben. Der nächste Schritt besteht darin, die gesamte Probe langsam zu dehydrieren, um eine optimale Visualisierung der Gewebeprobe und einen optimalen Bildkontrast zu gewährleisten. Legen Sie die holzige Gewebeprobe bei niedriger Temperatur in einen Trockenofen, um die Probe langsam zu trocknen, ohne dass das Gewebe reißt oder gespalten wird.

In einigen Situationen kann es wünschenswert sein, einen treuhänderischen Marker an der Probe anzubringen. Dadurch ist sichergestellt, dass die anschließende Dissektion und Visualisierung mittels Rasterelektronenmikroskopie an bestimmten Punkten im HRCT-Bild orientiert werden kann. Befestigen Sie dazu eine Metall- oder Glasperle oder einen Draht mit Parfum an der Außenseite des Stiels.

Montieren Sie abschließend die Probe in den Bohrer und zentrieren Sie sie wie oben beschrieben, bevor Sie scannen. Bestimmen Sie die Vergrößerung, die für Ihre Anwendung am besten geeignet ist. Die hier verwendete A LS Beamline 8.3 0.2 ist in der Lage, mit Objektiven mit Vergrößerungen von zwei x fünf x und 10 x zu scannen.

Stellen Sie die Röntgenenergie auf 15 Kiloelektronenvolt ein. Die Belichtungszeiten sind in der Regel abhängig von der Dicke und Dichte der Probe und reichen von 100 bis 1000 Millisekunden. Wählen Sie ein Winkelinkrement, das für Ihre Anwendung geeignet ist.

Die Proben werden während eines Scans um 180 Grad gedreht, und die Anzahl der Bilder, die während der Drehung aufgenommen werden, kann einen erheblichen Einfluss auf die Größe des Datensatzes, die Länge des Scan-Intervalls und die endgültige Bildqualität haben. Typische Scans werden in Schritten von 0,25 Grad durchgeführt, was 513 Bilder pro Scan ergibt. Kürzere Scan-Intervalle können mit der kontinuierlichen Tomographie-Einstellung erreicht werden, bei der sich die Probe kontinuierlich dreht, während die Bilder für jeden Scan aufgenommen werden, wobei auch Hellfeld- und Dunkelfeldbilder aufgenommen werden müssen.

Hellfeldbilder sind Bilder, bei denen sich die Probe nicht im Strahl befindet. Diese werden oft vor und nach dem Scan der Probe durch horizontale Verschiebung der Probe gesammelt. Dunkelfelder werden durch Schließen des Röntgenverschlusses erfasst.

Dies misst die Signalmenge, die die Kamera ohne Röntgenstrahlen anzeigt. Sobald der Scan abgeschlossen ist, übertragen Sie die rohen 2D-TIFF-Bilder vom Erfassungscomputer auf einen Dateiserver und exportieren Sie sie dann auf einen Computer, um sie für die Datenverarbeitung zu verwenden. Als Nächstes müssen die Bilder in einen prozentualen Übertragungsmaßstab konvertiert werden.

Beamline 8.3 0.2 verfügt über ein benutzerdefiniertes Plugin zur Hintergrundnormalisierung, das heruntergeladen und mit den frei verfügbaren Softwarepaketen verwendet werden kann. Image J oder Fiji laden die normalisierten Bilder in das Octopus-Softwarepaket und rekonstruieren dann einen 3D-Datensatz aus den 2D-Roh-TIFF-Bilddateien mit den angegebenen Verarbeitungsschritten. Als nächstes kann der Stapel von Bildern in einem von einer Vielzahl von Softwarepaketen visualisiert werden.

Hier wird das aviso-Softwarepaket verwendet, um Datensätze in den Systemspeicher zu laden und die Probe in virtueller Quer-, Längs- oder radialer Schichtausrichtung anzuzeigen. Aufgrund der 3D-Attribute des Datensatzes können virtuelle Schichten durch die Probe in jeder Ebene gedreht werden, um sie an den interessierenden Bereichen auszurichten. Sobald die Segmentierung abgeschlossen ist, ist es möglich, die Strukturen der Zielpflanzen oder funktionelle Veränderungen in Volumen, Länge, Breite, Vorhandensein oder Abwesenheit von Wasser, Luft usw. zu quantifizieren. Synchrotron-HRCT-Scans wurden mit Beamline 8.3 0.2 erfolgreich an einer Vielzahl von Pflanzengeweben und -arten durchgeführt und haben neue Einblicke in die Struktur und Funktion des pflanzlichen Xylems in bisher unerreichter Auflösung in 3D geliefert.

Die Visualisierungs- und Explorationsmöglichkeiten, die die 3D-Rekonstruktionen bieten, ermöglichen eine präzise Bestimmung der Lage und Ausrichtung von Strukturen mit den Xylem-Netzwerken sowohl auf Verbrauchsproben als auch in lebenden Pflanzen. Hier sehen wir eine 3D-Rekonstruktion eines Mammutbaumstamms, der Trockenstress ausgesetzt war und sowohl luft- als auch wassergefüllte Luftröhren aufweist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Andere Methoden wie die Rasterelektronenmikroskopie können verwendet werden, um die Strukturen, die wir im Inneren der Pflanzen sehen, zu validieren und Größenschwellenwerte zu ermitteln, die dann in die Verarbeitungsprogramme eingespeist werden, die wir für die Datenanalyse verwenden.