Name: Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine in Hippocampusschnitt Kulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: Erfahren Sie die ImmunoGold-Markierung synaptischer Proteine in Hippocampus-Schnittkulturen der Ratte. Diese Methode ermöglicht die ultrastrukturelle Lokalisierung von Proteinen in CA1-Pyramidalneuronen mittels Elektronenmikroskopie.

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Die Autoren möchten sich Matthew Florence zur Herstellung der Hippocampusschnitt Kulturen danken. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus US-amerikanischen National Institute on Aging und Alzheimer Association NZG unterstützt.

Ein. Fixierung Fixative sind cancerogen Handschuhe tragen und handhaben die Fixiermittel in einer Abzugshaube. Soweit nicht anders angegeben, sind alle Inkubationen auf Eis durchgeführt und alle Lösungen sollten vor der Verwendung gefiltert werden. Verwenden Elektronenmikroskopie-grade Reagenzien. Tag 1 <ol><li class="jove_content"> Nach experimentellen Bedingungen (zB virale Injektion, medikamentöse Behandlung), legen Sie die Membran mit organotypischen Schnitten des Hippocampus in einem 60 x 15 mm Polystyrol Petrischale mit eiskaltem 0,1 M Phosphatpuffer (Sorensen Phosphat-Puffer), pH 7,3. Fügen Sie 1 bis 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer direkt auf die Scheiben, um sie kalt. </li></ol> Entscheidender Schritt: Verwenden Sie immer frisch zubereitet Puffer und Fixative. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert des Puffers innerhalb gewünschten Bereich. Ein Scheitern zu tun beschädigen könnten zellulären Strukturen. <ol start="2"><li> Um die CA1 Unterfeld der Scheibe zu isolieren, verwenden Sie einEinmalskalpell sanft über die Scheibe neben der DG, parallel zur CA1 Zellschicht (Abbildung 1) geschnitten. Dann schneiden Sie die restlichen Scheibe vertikal, um die CA3 Unterfeld und die Subiculum entfernen. Schneiden Sie eine Ecke der Scheibe zur Identifizierung der Oberseite des Gewebes. </li></ol> HINWEIS: Falls keine virale Lieferung von Protein von Interesse erforderlich ist, das gesamte Gewebeschnitt fixiert, nachdem die Medien mit einem sanften eiskaltem Puffer spülen entfernt wird. Dieses wird dann durch Ausschneiden der CA1 gefolgt. Entscheidender Schritt: Verfolgen Sie die Oberseite des Gewebes, um für die richtige Schneiden der Gitter später. <ol start="3"><li> Entfernen Sie vorsichtig das Gewebe aus der Membran unter Verwendung der Rückseite des Skalpells. Verwenden einer Pasteurpipette zu übertragen, um sanft das Gewebe bis zu einer 12-well Platte mit 0,1 M Phosphatpuffer. </li><li> Entfernen Sie den Puffer in der auch von der Platte und 500 &amp; mu, l - 1 ml eiskaltem Fixiermittel (pH 7,3) wie folgt zusammen: 0,1% Pikrinsäure, 1% Paraformaldehyd und 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer. Inkubieren für 2 Stunden bei 4 ° C. </li></ol> HINWEIS: Pikrinsäure kann explosiv sein, wenn sie trocken. Halten Sie es angefeuchtet mit Wasser in einem Behälter dicht geschlossen halten. An einem trockenen und gut belüfteten Ort aufbewahren. <ol start="5"><li> Entfernen Sie die Fixiermittel aus dem Brunnen und waschen Proben 3 mal (20 min jeweils) in 0,1 M Phosphatpuffer. </li><li> Inkubieren für 40 min in 1% Tanninsäure (w / v) in 0,1 M Maleinat-Puffer, pH 6,0. </li><li> Spülen Sie zweimal (jeweils 20 min) in Maleatpuffer. </li><li> Inkubieren für 40 min in 1% Uranylacetat (w / v) in Maleatpuffer im Dunkeln. Uranylacetat ist lichtempfindlich und ist radioaktiv. Das Becherglas mit Parafilm beim Auflösen und speichern Sie unbenutzte Puffer im Dunkeln bei 4 ° C. </li><li> Spülen Sie zweimal (jeweils 20 min) in Maleatpuffer. </li><li> Inkubieren für 20 min in 0,5% Platin Chloride (w / v) in Maleatpuffer. </li><li> Spülen Sie zweimal (jeweils 20 min) in Maleatpuffer. Speichern die Proben bei 4 ° C, bis sie zur weiteren Verarbeitung bereit sind. </li></ol> 2. Dehydration und Embedding Propylenoxid ist krebserregend. Vermeiden Dämpfe durch die Arbeit mit ihm in einer Abzugshaube. Verwenden Sie absolute, 100% reinem Ethanol, die keine Spuren von Wasser enthält. Verdünnen Sie dieses absolute Ethanol zu unterschiedlichen Konzentrationen zur Entwässerung herzustellen. Tag 2 <ol><li> Inkubation für 5 min in 50% Ethanol und dann 5 min in 70% Ethanol. </li><li> Inkubieren für 15 min in frisch zubereiteten 1% p-Phenylendiamin (PPD) in 70% Ethanol. </li><li> Spülen dreimal in 70% Ethanol. </li><li> Inkubation für 5 min in 80% Ethanol und dann 5 min in 95% Ethanol. </li><li> Inkubieren in 100% Ethanol zweimal jeweils 5 min. </li><li> Bereiten Glasfläschchen mit Schraubverschluss und stellen Sie sicher, sie sind sauber und komplett trocken. Übertragen Slices Glasfläschchen undbeschriften jedes Fläschchen einfach und klar. </li><li> Inkubation für 5 min in 1:1 Ethanol: Propylenoxid. </li><li> Inkubieren in 100% Propylenoxid zweimal jeweils 5 min. </li><li> Fügen Harz (Epon) zu jedem Fläschchen ein 1:1-Gemisch mit Propylenoxid zu machen. Sanft für 2 Stunden zu mischen. Nicht schütteln die Fläschchen zu rigoros, um Blasen, die mit Einbettung stören könnten. </li><li> Hinzufügen Harz, um ein 3:1-Gemisch mit Propylenoxid, und Mischen für 2 Stunden zu machen. </li><li> Übertragen auf 100% Harz und inkubieren O / N. </li></ol> Tag 3 <ol start="12"><li> Sandwich-Proben zwischen Streifen aus ACLAR Kunststoff und Heilmittel für 24 Stunden bei 60 ° C. </li></ol> 3. Schneiden und Montage auf Grids Tag 4 <ol><li> Geschnitten semidünnen (0,5 um) Abschnitte und Flecken mit 1% Toluidinblau + 1% Borax, um die korrekte Ausrichtung der Proben zu bestimmen. </li><li> Geschnitten Ultradünnschnitten (60 nm) und Halterungen auf Nickel Gitter, ein Abschnitt pro Raster. </li></ol>4. Immunhistochemie Alle Puffer und Wasser sollte vor dem Gebrauch gefiltert werden. Tag 5 <ol><li> Geben Sie einen Tropfen (~ 50 ul) von 1% Tween-20/phosphate Puffer (T / PB), pH 7,5, auf ein Stück sauberer Parafilm auf einer ebenen Fläche. Vorsichtig holen die Gitter mit sauberen Pinzette durch die Kante und schweben auf dem Puffer, Abschnitt unten, und inkubieren für 10 min bei RT. </li><li> Überschüssiges Flüssigkeit aus dem Gitter durch Anordnen Abschnitt nach oben auf auf Filterpapier und anschließend schwimmen auf 50 mM Glycin in T / PB für 15 min bei RT. </li></ol> Entscheidender Schritt: Zur Vermeidung übermäßigen &quot;carry-over&quot; von Lösungen aus einer Lösung Tropfen zum nächsten während der Inkubationen, abtropfen überschüssige Flüssigkeit durch leichtes Berühren der Kante des Gitters auf # 1 Filterpapier zwischen jeder Lösung ändern. Außerdem entfernen Lösung zwischen den Armen des EM eingefangenen Forceps Halten des Gitters durch sanftes Dochtwirkung mit einem Faserband aus Filterpapier zwischen den Zangenschenkeln während ensuklingeln die Abschnitte nicht vollständig austrocknen. <ol start="3"><li> Trocknen des Gitters mit Filterpapier und anschließend schwimmen auf blockierende Lösung, die 2,5% BSA und 2,5% Serum von dem Tier des sekundären Antikörpers in T / PB 30 min bei RT. </li><li> Inkubieren mit primärem Antikörper (in T / PB) bei RT oder O / N bei 4 ° C. Die optimale Zeit und Temperatur der Inkubation sowie Antikörperkonzentration, müssen experimentell bestimmt. </li><li> Waschen Sie das Raster drei Mal (2 min jeweils) mit T / PB. </li><li> Inkubieren mit sekundärem Antikörper (1:20 Anti-Kaninchen oder Anti-Maus gekoppelt bis 10 nm Gold) für 1 Stunde bei RT. </li><li> Dreimal (2 min jeweils) mit T / PB. </li><li> Postfix mit 2% Glutaraldehyd in T / PB für 5 min. </li><li> Dreimal (2 min jeweils) mit T / PB und dann dreimal (2 min jeweils) mit gefiltertem Wasser. </li><li> Inkubieren mit 2% Uranylacetat in Wasser für 10 min. </li></ol> Während das Gitter Färbung, bereiten Sie einen CO 2-freien Kammer durch placinga Stück Parafilm im Zentrum eines Glases Petrischale. Dann legen 4-6 Pellets von NaOH in der Schale um den Parafilm um CO 2 in der Luft aufnehmen. Halten Sie die oben geschlossen für ein paar Minuten. Verwenden einer Pasteurpipette und schnellen Übertragen eines kleinen Volumens von Bleicitrat Reynold-Lösung des Parafilm im Glas Petrischale. Öffnen Sie die obere gerade genug, um die Pasteurpipette einlegen, um die Wiedereinführung von CO 2 in die Kammer zu minimieren. HINWEIS: Um Reynolds Bleicitrat Lösung zu machen, kochen 100 ml entionisiertem Wasser in einem Mikrowellenherd und lassen in einem luftdichten Behälter kühl. In einem 50-ml-Messkolben mit Stopfen, mix 1,33 g Bleinitrat, 1,76 g Natriumcitrat und 30 ml des abgekochtes Wasser durch kräftiges Schütteln für 1 min. Dann zeitweise schütteln für 30 min. Zu diesem trübe Lösung, 8 ml 1 M Natronlauge und langsam umzukehren den Kolben ein paar mal. Lösung klar geworden. Wird die Lösung auf 50 ml mit der gekochten water. Bewahren Sie die Lösung dicht geschlossen halten. Wenn Niederschlag erscheint, zu verwerfen und einen neuen ein. <ol start="11"><li> In drei kleineren Bechern vorzubereiten warm, frisch gekochtes deionisiertem Wasser. Waschen Sie die Uranylacetat durch Eintauchen des Rasters im ersten Becherglas und sanft wirbeln sie herum für 30 sek. Wiederholen Sie diesen Schritt in den beiden anderen Becher. </li><li> Öffnen Sie die Spitze des Glases Petrischale gerade genug, um das Gitter auf der Tropfen Bleicitrat Reynold-Lösung stellen. Falls möglich, tragen eine Maske während diese Weise, um die Atmung zu Bleicitrat vermeiden und um die Bildung von Niederschlag zu verhindern. Inkubieren für 10 min. </li><li> Öffnen Sie die obere gerade genug, um das Gitter zu entfernen. Einatmen der Bleicitrat. Waschen Sie die Grid dreimal durch Eintauchen sequentiell in drei Bechern mit warmen, frisch gekochtes destilliertes Wasser. Lassen Sie das Gitter trocken auf einem Stück Filterpapier, Abschnitt up. Die Probe ist nun bereit für das Elektronenmikroskop. </li></ol>

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

In diesem Protokoll haben wir die Phend und Weinberg Methode für Gehirn und Rückenmark Gewebe dendritischen Dornen in Ratten Hippocampusschnitt Kulturen zu studieren angenommen. Dendritischen Dornen in der hippocampalen CA3-CA1-Region sind empfindliche Strukturen, die eine Vielzahl von Proteinen, die eine wichtige Rolle spielen bei der Regulierung der neuronalen Funktionen. Das vorgestellte Verfahren stellt eine ausgewogene Ansatz zur Erzielung verbesserter Antigenizität unter Beibehaltung guter ultrastrukturelle Konser...

<table><tbody><tr><td>60 x 15 mm Polystyrol Petrischale</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Einwegskalpell</td><td>EXELINT</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultureinsätze</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>10 nm Ziegen-Anti-Kaninchen gold</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Neurogranin Antikörper</td><td>Millipore</td><td>AB5620</td><td></td></tr><tr><td>100% Pikrinsäure</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>19550</td><td></td></tr><tr><td>96% Paraformaldehyd</td><td>Acros Organics</td><td>AC41678-0030</td><td></td></tr><tr><td>25% Glutaraldehyd (EM-Qualität)</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>p-Phenylendiamin</td><td>Sigma</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>Platin(IV)-chlorid</td><td>Sigma</td><td>379840</td><td></td></tr><tr><td>Gerbsäure-Elektronenmikroskopie</td><td></td><td>21710</td><td></td></tr></tbody></table>

post-einbettung immunogoldmarkierung der synaptischen proteine ​​in hippocampusschnitt kulturen

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunelektronenmikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um biologische Moleküle auf subzellulärer Ebene zu studieren. Antikörper gekoppelt elektronendichten Marker wie kolloidales Gold offenbaren kann die Lokalisation und Verteilung von spezifischen Antigenen in verschiedenen Geweben ein. Die beiden am häufigsten verwendeten Techniken sind pre-embedding und Post-embedding Techniken. In vor-Einbettung Immunogold-Elektronenmikroskopie (EM)-Techniken, muss das Gewebe permeabilisiert zu Antikörper Eindringen zu ermöglichen, bevor er eingebettet werden. Diese Techniken sind ideal zum Konservieren Strukturen aber schlechte Penetration des Antikörpers (oft nur die ersten paar Mikrometer) ist ein erheblicher Nachteil, 2. Die post-Einbettung Kennzeichnung Methoden können dieses Problem vermeiden, weil Kennzeichnung erfolgt auf Abschnitten von festen Geweben, in denen Antigene leichter zugänglich sind. Im Laufe der Jahre wurden eine Reihe von Änderungen, die post-Einbettung verbessert Immunreaktivität zu verbessern und Ultrastruktur bewahren <sup&gt; 3-5. Gewebefixierung ist ein entscheidender Teil des EM-Studien. Fixative chemisch vernetzen die Makromoleküle, die Gewebestrukturen einrastet. Die Wahl der Fixateur wirkt nicht nur strukturelle Erhaltung, sondern auch Antigenität und Kontrast. Osmiumtetroxid (OsO 4), Formaldehyd, Glutaraldehyd und wurden die Standard-Fixiermittel für Jahrzehnte, einschließlich des zentralen Nervensystems (CNS) Gewebe, die besonders anfällig für strukturelle Beschädigungen bei chemischen und physikalischen Verarbeitung sind. Leider ist OsO 4 hochreaktiv und wurde gezeigt, dass maskieren Antigene 6, was zu einer schlechten und unzureichende Etikettierung. Alternative Ansätze zur chemischen Fixierung vermeiden sind Einfrieren der Gewebe. Aber diese Techniken sind schwierig durchzuführen und erfordern teure Instrumente. Um einige dieser Probleme anzugehen und ZNS-Gewebe Kennzeichnung, Phend et al verbessern. ersetzt OsO 4 mit Uranylacetat (UA) und Tannin acid (TA), und erfolgreich zusätzliche Modifikationen eingeführt, um die Empfindlichkeit der Antigennachweis und strukturelle Erhaltung im Gehirn und Rückenmark Geweben 7 zu verbessern. Wir haben dieses Osmium-free post-Einbettung Methode Rattenhirngewebe angenommen und optimiert die Immunogoldmarkierung Technik zu erkennen und zu studieren synaptischen Proteinen. Wir stellen Ihnen hier eine Methode, um die ultrastrukturellen Lokalisation der synaptischen Proteinen in Ratten hippocampalen CA1 Pyramidenzellen bestimmen. Wir verwenden organotypischen hippocampalen kultivierten Scheiben schneiden. Diese Scheiben halten die trisynaptic Schaltung des Hippocampus, und sind daher besonders nützlich zur Untersuchung synaptischer Plastizität, ein Mechanismus weithin angenommen, Lernen und Gedächtnis zugrunde liegen. Organotypischen hippocampalen Schnitten aus postnatalen Tag 5 und 6 Maus / Rattenjungen können wie zuvor beschrieben 8 werden und sind besonders nützlich, um akut Knockdown oder überexprimieren exogenen Proteinen. Wir haben dieses Protokoll ch verwendetaracterize Neurogranin (Ng), einem Neuronen-spezifischen Proteins mit einem kritische Rolle bei der Regulierung der synaptischen Funktion 8,9. Darüber hinaus haben wir es verwendet, um die Lokalisierung von ultrastrukturelle Calmodulin (CaM) und Ca 2 + / Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII) 10 charakterisieren. Wie in den Ergebnissen dargestellt, ermöglicht dieses Protokoll gute ultrastrukturelle Erhaltung der dendritischen Dornen und effiziente Kennzeichnung von Ng zu helfen charakterisieren ihre Verteilung in der Wirbelsäule 8. Weiterhin kann das hier beschriebene Verfahren eine breite Anwendbarkeit bei der Untersuchung viele andere Proteine ​​in neuronalen Funktionen beteiligt sind.

2B zeigt ein Beispiel der Verteilung des endogenen Ng Moleküle in dendritischen Dornen von hippocampalen CA1 pyramidalen Neuronen. Nickelgittern mit ultradünnen (60 nm) enthält Geweben CA1-Region des Hippocampus (wie in 2A zu sehen) wurden in 1% abgedeckt T / PB, 50 mM Glycin, dann mit 2,5% BSA und 2,5% Serum vor der Inkubation mit Anti blockiert Ng-Antikörpers. Nach dem Waschen mit T / PB, wurden Netze dann in anti-Kaninchen sekundären Antikörper gekoppelt an 10 nm Gold bedeckt. Schlie...

Die Lokalisation und Verteilung von Proteinen liefern wichtige Informationen für das Verständnis ihrer zellulären Funktionen. Die überlegene Ortsauflösung der Elektronenmikroskopie (EM) verwendet, um die subzelluläre Lokalisierung eines bestimmten Antigens nach Immunohistochemie bestimmen. Für Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS), Erhaltung strukturelle Integrität während Antigenität war besonders schwierig im EM-Studien. Hier nehmen wir ein Verfahren, das verwendet wurde, um Strukturen und Antigene im ZNS zu studieren zu bewahren und zu charakterisieren synaptischen Proteinen in Ratten-Hippocampus-CA1 pyramidalen Neuronen.

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine ImmunoGold-Markierung durchzuführen, um die ultrastrukturelle Lokalisation synaptischer Proteine in CA1-parasagittalen Neuronen des Hippocampus von Ratten zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst der CA1-Bereich des organspezifischen Schnitts entfernt, die obere Ecke abgeschnitten wird, um die korrekte Orientierung zu merken, und das Gewebe anschließend in einem osmiumfreien Fixansatz auf Eis inkubiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, das fixierte Gewebe zu dehydrieren und durch Infiltration mit Harz zu verfestigen. Anschließend werden ultradünne Schnitte aus in Harz eingebetteten Geweben geschnitten und auf Nickelgitter aufgebracht. Der letzte Schritt besteht darin, eine Immunhistochemie an den Gewebeschnitten durchzuführen. Letztendlich wird die immunoelektronenmikroskopische Untersuchung verwendet, um die Lokalisation von Proteinen im Synapsenbereich zu bestimmen. Okay.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der synaptischen Plastizität beantworten, beispielsweise wie die Lokalisation von Proteinen innerhalb dendritischer Dornen zur Aufklärung ihrer Rolle bei der synaptischen Funktion beitragen kann. Obwohl dieses Verfahren für organotypische Hippocampus-Schnitte optimiert ist, kann es auch für andere neuronale Präparationen äußerst wertvoll sein, darunter akute Hirnschnitte und primäre neuronale Kulturen. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie den organotypischen hippocampalen Schnitt in eine Polystyrol-Petri-Schale mit frischem, eiskaltem Sorensen-Phosphatpuffer geben.Fügen Sie zusätzlich ein bis zwei Milliliter eiskaltes Pufferlösung direkt auf die Schnitte hinzu. Um das CA1-Teilgebiet des Schnitts zu isolieren, schneiden Sie vorsichtig mit einem Einweg-Skalpell quer durch den Schnitt neben der Gyrus dentatus, parallel zur CA1-Zellschicht. Schneiden Sie dann den verbleibenden Schnitt vertikal, um das CA3-Teilgebiet und das Sulu zu entfernen.Schneiden Sie anschließend eine Ecke der CA um eine Scheibe ab, um die Oberseite des Gewebes zu markieren, und entfernen Sie das Gewebe vorsichtig mithilfe der Rückseite des Skalpells von der Membran. Überführen Sie das Gewebe vorsichtig in eine 12-Loch-Platte, die kalte Sorensen-Pufferlösung enthält. Entfernen Sie den Puffer und geben Sie 0,5 bis ein Milliliter kalten Fixansatz mit einem pH-Wert von 7,3, der in Sorensen-Puffer verdünnt ist, hinzu, sodass die Probe vollständig bedeckt ist.Anschließend zwei Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation das Fixativ aus der Mulde entfernen und die Proben dreimal für jeweils 20 Minuten mit eiskaltem Sorensens-Puffer waschen. Danach die Probe in 1 % Tanninsäure (Gewicht pro Volumen) in 0,1 molarer Malat-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 6,0 inkubieren.Nach 40 Minuten wird die Gerbsäure durch zweimaliges Waschen der Probe je 20 Minuten im Malatpuffer abgespült. Anschließend wird die Probe 40 Minuten lang in 1 % Urinacetat in Malatpuffer inkubiert. Urinacetat ist lichtempfindlich und radioaktiv. Deshalb vorsichtig handhaben und die Probe während der Inkubation im Dunkeln bei vier Grad Celsius aufbewahren.Nach der Inkubation die Proben zweimal für jeweils 20 Minuten in eiskaltem Malatpuffer spülen, anschließend 20 Minuten in 0,5 % Platinchlorid in Inmate-Puffer inkubieren. Abschließend überschüssiges Platinchlorid durch zweimaliges Waschen je 20 Minuten abspülen. Jede Inmate-Puffer-Lösung; bewahren Sie die Proben in Malatpuffer bei vier Grad Celsius auf, bis sie für die weitere Verarbeitung bereit sind.Um die Immunhistochemie zu beginnen, werden die fixierten CA1-Regionen zunächst entwässert, in Harz eingebettet und geschnitten, um 60 Nanometer dünne Schnitte auf Nickelgittern zu erhalten, wie im Textprotokoll zu diesem Video beschrieben. Anschließend einen Tropfen 1 % Tween 20-Phosphatpuffer bei pH 7,5 auf ein sauberes Stück Paraform legen. Dann das Gitter vorsichtig mit sauberen Pinzetten aufnehmen und mit der Schnittseite nach unten auf dem Puffer schwimmen lassen; 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation die überschüssige Flüssigkeit abziehen, indem das Gitter mit der Schnittseite nach oben auf Filterpapier gelegt wird.Entfernen Sie außerdem vorsichtig mit einem Streifen Filterpapier jegliche zwischen den Armen der EM-Pinzette eingeschlossene Lösung, wobei sichergestellt werden muss, dass die Schnitte nicht vollständig austrocknen. Geben Sie dann einen Tropfen 50 Millimolar Glycin auf die Parafolie und legen Sie das Gitter mit der Schnittseite nach unten in die Glycin-Lösung bei Raumtemperatur. Während die Probe 15 Minuten inkubiert, geben Sie 2,5 % Serum aus dem Tier der sekundären Antikörper zu einer 2,5 %igen BSA-Lösung hinzu und platzieren einen Tropfen dieser Mischung auf die Parafolie.Nach der 15-minütigen Inkubation trocknen Sie das Raster mit Filterpapier ab und legen es für 30 Minuten auf die Blockierungslösung. Bereiten Sie bei Raumtemperatur die Inkubationskammer vor, indem Sie aufgerollte Kim-Tücher entlang des Innenrands einer sauberen Kunststoff-Petrischale platzieren. Legen Sie ein sauberes Stück Param in die Mitte der Petrischale und geben Sie dann gefiltertes Wasser zu den Kim-Tüchern hinzu.Als Nächstes einen Tropfen der Primärantikörperlösung auf das Paraformaldehyd-Gitter geben und die Probe bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius darauf schwimmen lassen. Die optimale Inkubationszeit und -temperatur sowie die Antikörperkonzentration müssen experimentell bestimmt werden. Nach der Inkubation mit dem Primärantikörper das Gitter dreimal je zwei Minuten mit 1 % Tween 20 in Phosphatpuffer waschen. Anschließend mit Sekundärantikörper inkubieren, wobei ein Verdünnungsverhältnis von 1:20 verwendet wird (anti-Kaninchen- oder anti-Maus-Antikörper), gekoppelt an 10 Nanometer großes Gold, für eine Stunde.Bei Raumtemperatur dreimal für jeweils zwei Minuten mit 1 % Tween 20 Phosphatpuffer waschen. Anschließend die Probe fünf Minuten lang in gepuffertem 2 % Glutaraldehyd nachfixieren. Überschüssigen Glutaraldehyd durch dreimaliges Spülen mit 1 % Tween 20 Phosphatpuffer und danach dreimaligem Spülen mit filtriertem Wasser für jeweils zwei Minuten entfernen.Nach dem Spülen die Probe 10 Minuten lang in 2 % Urinatessigsäure inkubieren. Während der Inkubation eine CO2-freie Kammer vorbereiten, indem ein Stück Paraformaldehyd in die Mitte einer Glas-Petrischale gelegt wird. Anschließend 10 bis 15 Pellets Natriumhydroxid in die Schale um das Paraformaldehyd herumgeben, um das im Luftraum enthaltene CO2 zu absorbieren.Halten Sie die Oberseite einige Minuten lang geschlossen. Verwenden Sie danach eine Pasteurpipette und übertragen Sie schnell eine kleine Menge frisch zubereiteter Reynolds-Bleizitratlösung in den Paraform. Öffnen Sie die Oberseite gerade genug, um die Pasteurpipette einzuführen, um die erneute Einführung von CO2 in die Kammer zu minimieren.In drei kleinen Bechern warmes, frisch gekochtes, deionisiertes Wasser bereitstellen, um den Urin-Azetat abzuwaschen, indem das Gitter in den ersten Becher getaucht und vorsichtig 30 Sekunden lang geschwenkt wird. Diesen Schritt in den beiden anderen Bechern wiederholen. Nach dem Spülen die Oberseite der Glas-Petri-Schale gerade so weit öffnen, dass das Gitter auf den Tropfen der Reynolds-Zitrat-Bleilösung gelegt werden kann.Tragen Sie nach Möglichkeit eine Maske, um zu verhindern, dass Sie auf Zitratblei atmen und sich ein Präzipitat bildet. Öffnen Sie nach 10 Minuten die Abdeckung leicht und nehmen Sie das Objektträgergitter heraus. Spülen Sie es dreimal, indem Sie es nacheinander in drei frische Bechergläser mit warmem destilliertem Wasser eintauchen.Dann trocknen Sie das Raster auf einem Abschnitt Filterpapier. Die Probe ist nun bereit zur Untersuchung mit dem Elektronenmikroskop. Ultra-dünne Gewebeschnitte eines Bereichs des Hippocampus, hier als Transmissionselektronenmikrografie dargestellt, enthalten leicht unterscheidbare Dendriten und Dornfortsätze von parahippocampalen Neuronen. Die Identifizierung asymmetrischer Synapsen zwischen axonalen Endigungen, gekennzeichnet mit einem T, und dendritischen Dornen, gekennzeichnet mit einem S, wird durch das Vorhandensein einer postsynaptischen Dichte und einer gut definierten Plasmamembran erleichtert.Die Verteilung von Neuro-Grandin in dendritischen Dornen ist mithilfe der ImmunoGold-EM-Markierung sichtbar und wird in diesen TEM-Aufnahmen durch die Pfeile hervorgehoben. Der radiale Abstand von Neuro-Grandin vom Zentrum des Dorns bis zur Plasmamembran des Dorns kann als normalisierter radialer Abstand gemessen werden. Ein Abstand von null entspricht einem Teilchen, das auf der Membran liegt, und ein Abstandswert von eins stellt ein Teilchen im Zentrum des Dorns dar.Der Abstand von Neuro-Grandin zum dendritischen Dorn kann dann grafisch dargestellt werden. Hier ist seine Verteilung als normalisierter radialer Abstand in Blau dargestellt und mit einer zufälligen Verteilung in Rosa verglichen; diese Grafik zeigt, dass sich Neuro-Grandin in unmittelbarer Nähe zur Plasmamembran befindet. Diese Technik ebnete Forschern, die das Nervensystem untersuchen, den Weg, um die Lokalisation und Verteilung von Rezeptoren, rezeptorinteragierenden Proteinen, Transportern und Ionenkanälen sowie vieler anderer Proteine in verschiedenen Hirngeweben – einschließlich Kortex, Thalamus, Riechkolben und Kleinhirn – zu erforschen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Fixierungsmitteln äußerst gefährlich sein kann, und beachten Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einem Laborkittel sowie die Handhabung der Fixierungsmittel im Abzug.

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