Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine ImmunoGold-Markierung durchzuführen, um die ultrastrukturelle Lokalisation von synaptischen Proteinen in hippokampalen CA-One-Parametall-Neuronen der Ratte zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zuerst die CA eine Region der organotypischen Scheibe entfernt, die obere Ecke abgeschnitten wird, um sich an die richtige Ausrichtung zu erinnern, und in einem osmiumfreien Fixiermittel auf Eis inkubiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, das fixierte Gewebe zu dehydrieren und es aushärten zu lassen, indem es mit Harz infiltriert wird.

Als nächstes werden ultradünne Schnitte aus Geweben geschnitten, die in Harz eingebettet sind, und sie werden auf Nickelgitter gelegt. Der letzte Schritt besteht darin, eine Immunhistochemie an den Schnittgeweben durchzuführen. Letztlich wird die Immunelektronenmikroskopie eingesetzt, um die Lokalisation von Proteinen in der Synapse zu bestimmen. Okay.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der synaptischen Plastizität zu beantworten, z. B. wie die Lokalisierung von Proteinen in dendritischen Dornen dazu beitragen kann, ihre Rolle bei der synaptischen Funktion zu verstehen. Obwohl diese Methode für organotypische Hippocampus-Schnitte optimiert ist, kann sie auch für andere neuronale Präparate, einschließlich akuter Hirnschnitte und primärer neuronaler Kulturen, enorm wertvoll sein. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die organotypische Hippocampusscheibe in eine Petrischale aus Polystyrol legen, die frischen, eiskalten Sorensen-Phosphatpuffer enthält.

Geben Sie zusätzlich ein bis zwei Milliliter eiskalten Puffer direkt auf die Scheiben. Um das Unterfeld der Scheibe von CA one zu isolieren, schneiden Sie mit einem Einwegskalpell vorsichtig über die Scheibe neben dem Gyrus dentatus, der parallel zur Zellschicht von CA one verläuft. Schneiden Sie dann die verbleibende Scheibe vertikal ab, um das CA three-Unterfeld und das Sulu zu entfernen.

Schneiden Sie als Nächstes eine Ecke der CA-Scheibe ab, um die Oberseite des Gewebes zu identifizieren, und entfernen Sie das Gewebe vorsichtig mit der Rückseite des Skalpells von der Membran. Übertragen Sie das Gewebe vorsichtig auf eine 12-Well-Platte, die eiskalten Sorensen-Puffer enthält. Entfernen Sie den Puffer und fügen Sie 0,5 bis 1 Milliliter eiskaltes Fixiermittel bei einem pH-Wert von 7,3 hinzu, das in Sorensen-Puffer verdünnt ist, so dass es die Probe ausreichend bedeckt.

Dann zwei Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation das Fixiermittel aus der Vertiefung nehmen und die Proben dreimal 20 Minuten lang in eiskaltem Sorensen-Puffer waschen. Anschließend wird die Probe in 1 % Gerbsäuregewicht pro Volumen in 0,1 molaren Malatpuffer bei einem pH-Wert von 6,0 inkubiert.

Spülen Sie nach 40 Minuten die Gerbsäure weg, indem Sie die Probe zweimal 20 Minuten lang im Malatpuffer waschen. Inkubieren Sie die Probe anschließend 40 Minuten lang in 1%igem Urinalacetat in Malatpuffer-Urinalacetat, das lichtempfindlich und radioaktiv ist. Gehen Sie also vorsichtig vor und legen Sie die Probe während der Inkubation bei vier Grad Celsius im Dunkeln.

Nach der Inkubation spülen Sie die Proben zweimal für jeweils 20 Minuten in eiskaltem Malatpuffer und inkubieren Sie dann 20 Minuten lang in 0,5 % Platinchlorid in Insassenpuffer. Spülen Sie abschließend alle Platinchloridreste durch zweimaliges Waschen für 20 Minuten ab. Jeder Häftlingspuffer lagert die Proben in Malatpuffer bei vier Grad Celsius, bis sie für die weitere Verarbeitung bereit sind.

Zu Beginn der Immunhistochemie werden die fixierten CA one-Regionen zunächst mit dehydriertem Harz eingebettet und geschnitten, um ultradünne Schnitte von 60 Nanometern auf Nickelgittern zu erhalten, wie im Textprotokoll für dieses Video beschrieben. Geben Sie anschließend einen Tropfen 1%Tween 20 Phosphatpuffer bei pH 7,5 auf ein Stück sauberes Paraform. Nehmen Sie dann das Gitter vorsichtig mit einer sauberen Pinzette auf und lassen Sie es mit dem Abschnitt nach unten auf dem Puffer schwimmen, inkubieren Sie nach der Inkubation 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, lassen Sie überschüssige Flüssigkeit vom Gitter ab, indem Sie die Teilseite nach oben auf das Filterpapier legen.

Entfernen Sie außerdem alle Lösungen, die zwischen den Armen der EM-Pinzette eingeschlossen sind, indem Sie sie vorsichtig mit einem Stück Filterpapier ableiten, während Sie darauf achten, dass die Abschnitte nicht vollständig austrocknen. Geben Sie dann einen Tropfen 50 millimolares Glycin auf den Para-Film und treiben Sie den Gitterabschnitt mit der Seite nach unten auf der Glycinlösung bei Raumtemperatur. Während die Probe 15 Minuten lang inkubiert, geben Sie 2,5 % Serum aus dem Tier des Sekundärantikörpers zu einer 2,5 %igen BSA-Lösung und geben Sie einen Tropfen dieser Mischung auf den Parafilm.

Nach der 15-minütigen Inkubation das Gitter mit Filterpapier trocknen und 30 Minuten auf der Blockierungslösung schwimmen lassen. Bereiten Sie die Inkubationskammer bei Raumtemperatur vor, indem Sie aufgerollte Kim-Tücher auf die Innenseite einer sauberen Petrischale aus Kunststoff legen. Legen Sie ein Stück sauberes Param in die Mitte der Petrischale und geben Sie dann gefiltertes Wasser zu den Kim-Tüchern.

Geben Sie anschließend einen Tropfen der primären Antikörperlösung auf den Paraform und lassen Sie die Probe bei Raumtemperatur oder über Nacht darauf schwimmen. Bei vier Grad Celsius müssen der optimale Zeitpunkt und die optimale Temperatur der Inkubation sowie die Antikörperkonzentration experimentell bestimmt werden. Nach der Inkubation mit dem Primärantikörper wird das Gitter dreimal für jeweils zwei Minuten mit 1 %Tween 20 Phosphatpuffer gewaschen. Dann inkubieren Sie nach einer Stunde mit einem bis 20 Anti-Kaninchen- oder Anti-US-Antikörpern, gekoppelt an 10 Nanometer Gold.

Bei Raumtemperatur dreimal für jeweils zwei Minuten mit 1%Tween 20 Phosphatpuffer waschen. Anschließend wird die Probe fünf Minuten lang in gepuffertem 2%igem Glutaraldehyd fixiert. Entfernen Sie überschüssiges Kausalaldehyd, indem Sie dreimal mit 1 % Tween, 20 Phosphatpuffer und dann dreimal mit gefiltertem Wasser spülen und jedes Mal zwei Minuten lang spülen.

Nach dem Spülen den Rost 10 Minuten lang in 2%igem Urinalacetat inkubieren. Bereiten Sie während der Inkubation eine CO2-freie Kammer vor, indem Sie ein Stück Paraform in die Mitte einer gläsernen Petrischale legen. Geben Sie dann 10 bis 15 Pellets Natriumhydroxid in die Schale um den Paraform, um CO2 in der Luft zu absorbieren.

Halten Sie die Oberseite einige Minuten lang geschlossen. Verwenden Sie anschließend eine Weidepipette und übertragen Sie schnell eine kleine Menge frisch zubereiteter Reynolds-Bleicitratlösung auf das Paraform. Öffnen Sie den Deckel gerade so weit, dass Sie die Weidepipette einführen können, um den Wiedereintrag von CO2 in die Kammer zu minimieren.

In drei kleinen Bechern warmes, frisch gekochtes deionisiertes Wasser zubereiten, das Urinalacetat abwaschen, indem das Gitter in den ersten Schnabel getaucht und 30 Sekunden lang vorsichtig herumgewirbelt wird. Wiederholen Sie diesen Schritt in den anderen beiden Bechern. Öffnen Sie nach dem Spülen die Oberseite der Petrischale des Glases gerade so weit, dass Sie das Gitter auf den Tropfen der Reynolds-Bleicitratlösung legen können.

Tragen Sie dabei nach Möglichkeit eine Maske, um das Einatmen von Bleicitrat zu vermeiden und die Bildung eines Niederschlags zu verhindern. Öffnen Sie nach 10 Minuten die Oberseite leicht und entfernen Sie den Rost. Waschen Sie es dreimal, indem Sie es nacheinander in drei frische Becher mit warmem destilliertem Wasser tauchen.

Lassen Sie dann das Gitter auf einem Stück Filterpapier nach oben schneiden. Die Probe ist nun bereit für die Betrachtung mit dem Elektronenmikroskop: Ultradünne Gewebeschnitte der ca. einen Region des Hippocampus, die hier als Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme gezeigt werden, enthalten leicht unterscheidbare Dendriten und Stacheln von Parametall-Neuronen. Die Identifizierung asymmetrischer Synapsen zwischen axonalen terminalen Terminalen, die mit einem T bezeichnet werden, und dendritischen Dornen, die mit einem S gekennzeichnet sind, wird durch das Vorhandensein einer postsynaptischen Dichte und einer gut definierten Plasmamembran erleichtert.

Die Verteilung von neuro Grandin in dendritischen Dornen ist mit Hilfe der ImmunoGold EM-Markierung zu erkennen und wird in diesen TEM-Bildern durch die Pfeile hervorgehoben. Der radiale Abstand von Neuro-Grandin von der Mitte der Wirbelsäule zur Plasmamembran der Wirbelsäule kann als normalisierter radialer Abstand gemessen werden. Ein Abstand von Null entspricht einem Partikel, das auf der Membran liegt, und ein Abstandswert von eins stellt ein Partikel in der Mitte der Wirbelsäule dar.

Der Abstand von Neurograndin zur dendritischen Wirbelsäule kann dann grafisch dargestellt werden. Hier ist seine Verteilung als normalisierter radialer Abstand in Blau dargestellt, und im Vergleich zu einer zufälligen Verteilung in Pink zeigt diese Grafik, dass Neuro Grandin nahe an der Plasmamembran positioniert ist. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher, die das Nervensystem untersuchen, um die Lokalisierung und Verteilung von Rezeptoren, Rezeptor-interagierenden Proteinen, Transportern und Ionenkanälen und vielen anderen in verschiedenen Gehirngeweben zu untersuchen, einschließlich des Kortex, des Thalamus, des Riechkolbens und des Kleinhirns.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Fixiermitteln äußerst gefährlich sein kann und die Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einem Laborkittel und der Umgang mit den Fixiermitteln in der Filmhaube immer bei der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.