Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, einen neuen Ansatz zu entwickeln, um Membranproteine an retinalen Bandsynapsen quantitativ zu analysieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der retinalen Neurobiologie zu beantworten, wie z. B. die genaue Position von Proteinen an Synapsen innerhalb des Schaltkreises. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass sie die Anzahl, Dichte und Geschwindigkeit mehrerer Proteine an retinalen Bandsynapsen abschätzen kann.

Zur Demonstration des Verfahrens der Gefriersubstitution und des ultradünnen Schnitts haben wir die Ärzte Ron Petralia und Ya-Xian Wang vom NIDCD Advanced Imaging Core. Um diesen Vorgang zu beginnen, sezieren Sie einen Augapfel unter dem Mikroskop. Entfernen Sie dazu zunächst die Hornhaut.

Anschließend werden die Linse und der Glaskörper mit einer Pinzette von der interretinalen Oberfläche entfernt. Anschließend schälen Sie die Sklera, bis die Netzhaut von der Augenmuschel isoliert ist. Schneiden Sie die Netzhaut sofort mit einem Rasiermesser in 100 bis 200 Mikrometer dicke Streifen.

Mischen Sie anschließend die Netzhautstreifen in 4% Paraformaldehyd in 0,1 molaren PB. Dann in 4% Paraformaldehyd plus 0,01% Glutaraldehyd bei Raumtemperatur. Nach mehreren Wäschen in PB mit 0,15 millimolaren Calciumchlorid kryokontieren Sie die Netzhautstreifen mit Glycerin in 0,1 molaren PB, bevor Sie es einfrieren. Schneiden Sie vor dem Einlegen des gefrorenen Gewebes in die flachen Einbetthalter einen dünnen Kreis aus einer durchsichtigen Plastikfolie aus und legen Sie ihn auf die Unterseite jedes Halters, damit die polymerisierte Probenbox nach Fertigstellung leichter entnommen werden kann.

Stellen Sie nun die automatische Reihenfolge im AFS ein. Füllen Sie das AFS mit flüssigem Stickstoff und setzen Sie die flachen Einbetthalter in das AFS ein. Füllen Sie sie mit 1,5%Uranylacetat in Methanol und kühlen Sie sie vor.

Um die Netzhautstreifen in flüssigem Propan bei 184 Grad Celsius einzufrieren, legen Sie die Proben mit einem feinen Pinsel auf kleine Stücke Doppelklebeband, die an den Metallstummeln am Ende der Tauchstäbe befestigt sind. Danach den überschüssigen Puffer mit der Bürste ableiten. Tauchen Sie die Stäbe etwa fünf Sekunden lang in das flüssige Propan.

Übertragen Sie sie dann über eine kleine Transportkammer, die mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist, in das AFS. Nachdem Sie die gefrorene Probe und die Instrumente, Pinzette und Skalpell, in das AFS gelegt haben, kühlen Sie die Instrumente einige Minuten lang in der Kammer ab, bevor Sie das Gewebe berühren. Oder kühlen Sie sie, indem Sie die Spitzen der Instrumente für einige Sekunden in die kleine Transportkammer legen, die mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist.

Entfernen Sie danach die Probe und das Klebeband mit einem feinen Skalpell vom Stummel. Legen Sie anschließend zwei Stücke Gefrierteile in jede der sieben Vertiefungen in den flachen, einbettenden Aluminiumhalter mit 1,5 % Uranylacetat in Methanol. Halten Sie sie mindestens 32 Stunden lang bei 90 Grad Celsius im AFS.

Erhöhen Sie dann die Temperatur in der automatischen Sequenz schrittweise auf 45 Grad Celsius. Danach waschen Sie die Proben dreimal in vorgekühltem Methanol. Als nächstes infiltrieren Sie die Proben nach und nach mit Niedertemperatur-Einbettungsharzen als Einbettungsmedium.

Wechseln Sie am nächsten Tag das Harz erneut und passen Sie den Harzgehalt an, um die Oberkante der Vertiefungen zu erreichen. Richten Sie das UV-Licht auf dem AFS ein und polymerisieren Sie die Proben mit UV-Licht im AFS bis zum Ende der automatischen Sequenz. Entfernen Sie dann die Proben aus dem AFS.

In der Regel weisen Beispielblöcke immer noch etwas Rosa und Farbe auf. Platzieren Sie die Proben in der Nähe des Leuchtstofflichts in der chemischen Abzugshaube bei Raumtemperatur über Nacht oder bis sie völlig klar erscheinen. Schneiden Sie in diesem Schritt 70 nonometer dicke ultradünne Abschnitte mit einem Ultramikrotom und sammeln Sie sie auf den mit Kohlenstoff beschichteten Nickelgittern von Formvar.

Waschen Sie die Gitter einmal in destilliertem Wasser, gefolgt von drei Wäschen TBS. Inkubieren Sie dann die Gitter 30 Minuten lang in 20 Mikrolitern 5 % BSA in TBS und dann über Nacht bei Raumtemperatur in 20 Mikrolitern einer Mischung, die Ziegen-Anti-CTB und einen Antikörper gegen eine NMDAR-Untereinheit enthält. Waschen Sie danach die Gitter dreimal mit jeweils 20 Mikrolitern TBS bei ph 7,6.

Anschließend die Gitter einmal mit TBS bei ph 8,2 für fünf Minuten waschen. Inkubieren Sie die Gitter zwei Stunden lang mit 20 Mikrolitern einer Mischung, die Esel-Anti-Kaninchen-IGG in Verbindung mit 10-Nanometer-Goldpartikeln und Esel-Anti-Ziegen-IGG in Verbindung mit 18-Nanometer-Goldpartikeln enthält. Waschen Sie die Gitter nach zwei Stunden dreimal in 20 Mikrolitern TBS bei einem pH-Wert von 7,6, gefolgt von einer Wäsche im Reinstwasser und trocknen Sie die Gitter dann an der Luft.

Anschließend die Gitter acht Minuten lang mit 5 % Uranylacetat in destilliertem Wasser gegengefärbt, gefolgt von 0,3 % Bleicitrat in destilliertem Wasser für fünf Minuten im Dunkeln. Für Experimente zur Dreifachmarkierung inkubieren Sie die Gitter über Nacht bei Raumtemperatur mit 20 Mikrolitern einer Mischung aus Anti-Ziegen-CTB, Anti-Maus-PSD-95 und Anti-Kaninchen-UN2A. Inkubieren Sie dann die Gitter zwei Stunden lang mit 20 Mikrolitern einer Mischung aus IGGs, die mit 18-, 10- und Fünf-Nanometer-Goldpartikeln gekoppelt sind.

Legen Sie in diesem Abschnitt zunächst die Maßstabsleiste fest. Messen Sie dann die Länge der PSD einzelner RGC-Dendriten mit der ImageJ-Software. Zählen Sie dann die Goldpartikel innerhalb von 10 Nanometern um die Membran, basierend auf einer durchschnittlichen Dicke von sieben bis neun Nanometern für die Plasmamembran.

Berechnen Sie die Partikeldichte als Anzahl der Goldpartikel pro linearem Mikrometer. Messen Sie dann den Abstand zwischen der Mitte jedes Goldpartikels und der Mitte der PSD für die synaptische Position oder den Rand der PSD für die extrasynaptische Position. Dieses Bild zeigt die doppelte Immungold-Markierung von GluA2/3 und CTB.

Dies ist das präsynaptische Band und die kleinen Goldpartikel sind in der PSD der RGC-Prozesse geclustert. Dieses Bild zeigt die doppelte Immungold-Markierung von GluN2B und CTB. Die kleinen Goldpartikel befinden sich auf der extrasynaptischen Plasmamembran.

Und dieses Bild zeigt die doppelte Immungold-Markierung von GluN2A und CTB. Ähnlich wie bei GluA2/3 sind kleine Partikel innerhalb der PSD geclustert. Die dreifache Immungold-Markierung von GluN2A, PSD-95 und CTB ist hier dargestellt.

GluN2A-Goldpartikel und PSD-95-Goldpartikel sind innerhalb der PSD auf einzelnen CTB-positiven RGC-Dendriten kolokalisiert. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Gewebe sehr sanft zu fixieren, da einige Proteinantigenitäten, wie z. B. die der NMDA-Rezeptoren, mit starker längerer Fixierung deutlich abnehmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Membranproteine an retinalen Bandsynapsen mit großer Präzision nachgewiesen und analysiert werden können.