Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, einen neuen Ansatz zur quantitativen Analyse von Membranproteinen an retinalen Ribbonsynapsen zu entwickeln. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der retinalen Neurobiologie zu beantworten, beispielsweise die genaue Lokalisation von Proteinen an Synapsen innerhalb des Schaltkreises. Der Hauptvorteil der Technik liegt darin, dass sie die Anzahl, Dichte und Dynamik mehrerer Proteine an retinalen Ribbonsynapsen abschätzen kann.

Um das Verfahren der Gefriertauschung und der Ultramikrotomschnitte zu demonstrieren, haben wir Ron Petralia und Ya-Xian Wang aus dem NIDCD Advanced Imaging Core hinzugezogen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie unter dem Mikroskop einen Augapfel dissezieren. Entfernen Sie dazu zuerst die Hornhaut.

Entfernen Sie dann die Linse und den Glaskörper mit einer Pinzette von der interretinalen Oberfläche. Anschließend wird die Sklera abgezogen, bis das Retina vom Augenbecher isoliert ist. Schneiden Sie die Netzhaut unverzüglich mit einem Rasiermesser in Streifen von 100 bis 200 Mikrometer Dicke.

Anschließend die Netzhautstreifen in 4 % Paraformaldehyd in 0,1 molarer PB mischen. Danach in 4 % Paraformaldehyd plus 0,01 % Glutaraldehyd bei Raumtemperatur. Nach mehreren Waschungen in PB mit 0,15 Millimolar Calciumchlorid die Netzhautstreifen mit Glycerin in 0,1 molarer PB kryoschützen, bevor die Gefriertauschung erfolgt. Vor dem Einlegen des gefrorenen Gewebes in die flachen Einbettungshalter eine dünne Scheibe aus einer durchsichtigen Kunstfolie schneiden und auf den Boden jedes Halters legen, um die Entfernung der polymerisierten Probenschachtel nach Abschluss zu erleichtern.

Stellen Sie nun die automatische Sequenz im AFS ein. Füllen Sie das AFS mit flüssigem Stickstoff und platzieren Sie die flachen Einbettungshalter im AFS. Füllen Sie diese mit 1,5 % Uranylacetat in Methanol und kühlen Sie sie vor.

Um die Netzhautstreifen bei 184 Grad Celsius in flüssigem Propan schockzufrieren, verwenden Sie einen feinen Pinsel, um die Proben auf kleine Stücke doppelseitigen Klebebands zu legen, das an den Metallstiften an den Enden der Eintauchstangen befestigt ist. Danach entfernen Sie mit dem Pinsel überschüssiges Pufferlösung durch Abwischen. Tauchen Sie die Stangen etwa fünf Sekunden lang in das flüssige Propan ein.

Überführen Sie sie dann mithilfe einer kleinen Transportkammer, die mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist, in das AFS. Nachdem die gefrorene Probe sowie die Instrumente, Pinzette und Skalpell, in das AFS eingebracht wurden, kühlen Sie die Instrumente mehrere Minuten lang in der Kammer, bevor Sie das Gewebe berühren. Alternativ kühlen Sie sie, indem Sie die Spitzen der Instrumente einige Sekunden lang in die kleine mit flüssigem Stickstoff gefüllte Transportkammer tauchen.

Entfernen Sie danach die Probe und das Klebeband vom Stummel mit einem feinen Skalpell. Legen Sie anschließend zwei Stücke gefrorener Schnitte in jede der sieben Vertiefungen des flachen Einbettungs-Aluminiumhalters mit 1,5 % Uranylacetat in Methanol. Lagern Sie sie mindestens 32 Stunden lang bei 90 Grad Celsius im AFS.

Danach die Temperatur im automatischen Programm schrittweise auf 45 Grad Celsius erhöhen. Anschließend die Proben dreimal in vorab gekühltem Methanol waschen. Als Nächstes die Proben schrittweise mit Kalt-Einbettungsharzen als Einbettmedium infiltrieren.

Am nächsten Tag das Harz erneut wechseln und den Harzspiegel so einstellen, dass er die obere Kante der Vertiefungen erreicht. Die UV-Lampe am AFS aufbauen und die Proben im AFS mit UV-Licht bis zum Ende der automatischen Sequenz aushärten. Anschließend die Proben aus dem AFS entfernen.

Typischerweise weisen die Probenblöcke noch immer eine leichte Rosafärbung und Farbe auf. Stellen Sie die Proben über Nacht nahe an das Fluoreszenzlicht in der Abzugshaube bei Raumtemperatur oder bis sie vollständig klar erscheinen. In diesem Schritt schneiden Sie 70 Nanometer dicke Ultradünnschnitte mit einem Ultramikrotom und sammeln sie auf formvarbeschichteten, kohlenstoffbeschichteten Nickelgittern.

Waschen Sie die Objektträger einmal mit destilliertem Wasser und anschließend dreimal mit TBS. Inkubieren Sie die Objektträger danach für 30 Minuten in 20 Mikrolitern 5 % BSA in TBS und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur in 20 Mikrolitern einer Mischung, die Ziegen-Anti-CTB und einen Antikörper gegen eine NMDAR-Untereinheit enthält. Danach waschen Sie die Objektträger dreimal mit jeweils 20 Mikrolitern TBS bei pH 7,6.

Anschließend die Objektträger einmalig mit TBS bei pH 8,2 fünf Minuten lang waschen. Die Objektträger zwei Stunden lang mit 20 Mikrolitern einer Mischung inkubieren, die Esel-anti-Kanin-IgG, gekoppelt an 10 Nanometer große Goldpartikel, und Esel-anti-Ziege-IgG, gekoppelt an 18 Nanometer große Goldpartikel, enthält. Nach zwei Stunden die Objektträger dreimal mit jeweils 20 Mikrolitern TBS bei pH 7,6 waschen, gefolgt von einer Wäsche mit ultrareinem Wasser, und anschließend die Objektträger lufttrocknen.

Anschließend die Objektträger acht Minuten lang mit 5 % Uranylacetat in destilliertem Wasser kontrastieren, gefolgt von 0,3 % Bleicitrat in destilliertem Wasser für fünf Minuten im Dunkeln. Für Dreifachmarkierungsexperimente die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur mit 20 Mikrolitern einer Mischung aus anti-geziegen CTB, anti-maus PSD-95 und anti-kaninchen UN2A inkubieren. Danach die Objektträger zwei Stunden lang mit 20 Mikrolitern einer Mischung aus IGGs, die an 18, 10 und fünf Nanometer große Goldpartikel gekoppelt sind, inkubieren.

In diesem Abschnitt legen Sie zuerst die Maßstabsleiste fest. Anschließend messen Sie mit der ImageJ-Software die Länge der PSD einzelner RGC-Dendriten. Danach zählen Sie die Goldpartikel innerhalb von 10 Nanometern zur Membran basierend auf einer durchschnittlichen Dicke von sieben bis neun Nanometern für die Plasmamembran.

Berechnen Sie die Partikeldichte als Anzahl der Goldpartikel pro linearer Mikrometer. Messen Sie dann den Abstand zwischen dem Zentrum jedes Goldpartikels und der Mitte der PSD für die synaptische Lokalisation bzw. dem Rand der PSD für die extrasynaptische Lokalisation. Dieses Bild zeigt die doppelte Immungoldmarkierung von GluA2/3 und CTB.

Dies ist die präsynaptische Ribbons und die kleinen Goldpartikel sind in der PSD der RGC-Prozesse angehäuft. Dieses Bild zeigt die doppelte Immungoldmarkierung von GluN2B und CTB. Die kleinen Goldpartikel befinden sich an der extrasynaptischen Plasmamembran.

Und dieses Bild zeigt die doppelte Immungoldmarkierung von GluN2A und CTB. Ähnlich wie bei GluA2/3 sind kleine Partikel innerhalb der PSD angeordnet. Die dreifache Immungoldmarkierung von GluN2A, PSD-95 und CTB ist hier dargestellt.

GluN2A-Goldpartikel und PSD-95-Goldpartikel sind innerhalb der PSD auf individuellen CTB-positiven RGC-Dendriten ko-lokalisiert. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Gewebe sehr schonend zu fixieren, da die Proteinantigenität, beispielsweise die von NMDA-Rezeptoren, bei starker und langer Fixierung deutlich abnimmt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Membranproteine mit großer Genauigkeit an retinalen Riebelsynapsen nachgewiesen und analysiert werden können.