Beurteilung der Magenentleerung in Non-adipösen diabetischen Mäusen mit a [ ¹³ C]-Octansäure Atemtest

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Methode zur Messung der Magenentleerung bei Mäusen mit Hilfe eines 13-Kohlenstoff-Octa-NOICSÄURE-Atemtests zu etablieren. Mäuse und andere Kleintiere waren natürlich sehr nützlich, um uns zu helfen, die Pathophysiologie der Krankheit zu verstehen. Unsere Laborstudien zur Gastroparese und eines der Probleme bei der Gastroparese ist, dass Wissen Sie, um Krankheiten zu untersuchen, müssen wir die Magenentleerung im Laufe der Zeit verfolgen. Dies war ein Problem mit den derzeitigen Techniken, da die derzeitigen Techniken erfordern, dass man eine Substanz in den Magen der Maus gibt, entweder in flüssiger oder fester Form, und dann einige Zeit später die Maus tötet und abschätzt, was den Magen verlassen hat.

Was wir tun wollten, war eine nicht-invasive Technik zur Messung der Magenentleerung zu etablieren, und was wir getan haben, ist, dass wir den bekannten 13-Kohlenstoffano-Säure-Atemtest angepasst haben, um ihn an Mäusen anwenden zu können. Dies ermöglicht es uns, wiederholte Messungen im Laufe der Zeit durchzuführen und dann das, was wir sehen, sowohl mit der Histologie als auch mit der Physiologie zu korrelieren. Die Geräte, die wir hier verwenden, ermöglichen es uns, den Vorgang zu automatisieren, obwohl dies natürlich auch manuell möglich ist.

Der Vorteil der Automatisierung ist nicht nur die Tatsache, dass wir im Laufe der Zeit viel mehr Magenentleerungen durchführen können, sondern dass wir dies tatsächlich bei mehreren Mäusen gleichzeitig tun können. Was wir zeigen werden, ist eine Methode, mit der wir bis zu 12 Mäuse gleichzeitig behandeln können. Die folgende Animation zeigt den Aufbau unseres Magenentleerungsexperiments für die in vivo Messung der Magenentleerung.

Die Mäuse werden in durchsichtige Kunststoffröhrchen mit konstantem Luftstrom gesteckt. Nachdem sich die Mäuse an die Röhren gewöhnt haben und der Luftstrom eingestellt ist, verabreichen wir eine Testmahlzeit, die aus Eigelb besteht, das mit 13 kohlenstoffmarkierter Octo-NOICSÄURE vermischt ist. Da die Mäuse angebunden und trainiert sind, fressen sie in der Regel die Testmahlzeit.

Innerhalb von zwei Minuten wird die verabreichte OCT-NOIC-Säure im Zwölffingerdarm aufgenommen und in der Leber verstoffwechselt, freigesetzt und ausgeatmet, was zu einer Anreicherung von 13 Kohlendioxid in der Umgebungsluft führt, die dann mit unserem Isotopenanalysator gemessen wird. Werfen wir einen genaueren Blick darauf, was im Mauskörper passiert. Nach dem Verzehr der Testmahlzeit, die 13 kohlenstoffmarkierte OCT-NOICSÄURE enthält, gelangt die Mahlzeit in den Magen.

Die OCT-NOIC-Säure bleibt im Magen intakt. Nach der Passage durch den Pylorus wird es schnell im Zwölffingerdarm absorbiert. Die markierte Verbindung gelangt durch die Pfortader in die Leber und wird zu 13 Kohlenstoff-markiertem Kohlendioxid metabolisiert.

Das markierte Kohlendioxid wird im venösen Blut freigesetzt und ausgeatmet. Der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt in diesem ganzen Prozess ist die Magenentleerung. Das bedeutet, dass die pulmonale Ausscheidung von 13 Kohlendioxid direkt mit der Magenentleerung der markierten Mahlzeit korrespondiert.

Luftproben werden in bestimmten Zeitabständen entnommen und mit dem Kohlenstoffisotopenanalysator analysiert. Es können verschiedene Isotopenanalysatoren verwendet werden. In dieser Studie haben wir uns für die Verwendung eines LGR 13-Kohlenstoffisotopenanalysators mit niedrigem GATOS-Gehalt entschieden.

Die Entnahme von Proben für vier Stunden ergibt reproduzierbare 13 Kohlendioxid-Kinetiken, die die Geschwindigkeit der Magenentleerung widerspiegeln. Kurven-Anpassung. Die Verwendung der nichtlinearen Regression ermöglicht die Berechnung der halben Entleerungszeiten.

Dieses Verfahren eignet sich für die Nachsorge von Mäusen mit chronischen Erkrankungen. In dieser speziellen Studie verwenden wir weibliche, nicht adipöse Diabetiker, N-O-D-L-T-J-Mäuse, die ein Modell für Typ-1-Diabetes beim Menschen sind. Vor der Analyse dürfen sich alle Mäuse in den Testkammern gewöhnen, um den Stress zu minimieren.

Da eine Verzögerung der Magenentleerung ein charakteristischer Indikator für Stress und Mäuse ist, bewegen sich nicht gewöhnte Mäuse noch etwa eine Stunde nach dem Transfer in die Kammer und koten und urinieren. Häufig gelten die Mäuse als erfolgreich gewöhnungsbedürftig, wenn sie sich schnell in ihrer neuen Umgebung einleben. Nach dem Transfer in die Kammer, nach einer kurzen Zeit der Erkundung, ruhen sich die gewöhnten Mäuse ruhig in der Kammer aus.

Bei habituierten Mäusen sollten die Testergebnisse der Magenentleerung einen Unterschied von weniger als 10 % innerhalb der Maus zeigen. Sobald die Mäuse trainiert und für die Magenentleerung bereit sind, müssen sie am Tag vor dem Experiment nüchtern behandelt werden. Die Mäuse werden über Nacht auf einem Bodenfastengestell aus Metallgitter nüchtert.

Um Phasien vorzubeugen, stellen Sie sicher, dass sie freien Zugang zu Trinkwasser haben. Diabetische Mäuse sollten nicht länger als 16 Stunden gefastet werden. Konsistenz ist bei einem Magen-MCN-Experiment äußerst wichtig.

Faktoren wie der gleiche Umgang mit den Mäusen, das tägliche Fasten der Mäuse, die Überprüfung des Glukosespiegels und die Verabreichung von Insulin jeden Tag zur gleichen Zeit. Als Benutzer ist es äußerst wichtig, jeden Tag das gleiche Parfüm und den gleichen Laborkittel zu tragen, da all diese Faktoren die Magen-MTN-Daten verändern. Die Materialien, die wir für die Zubereitung des Eimehls verwenden, sind eine Ei-OC-Säure, ein Glasbecherglas, ein Falkenröhrchen und ein Spatel mit gebogenem Ende.

Beginnen Sie mit dem Abwiegen von fünf Gramm Eigelb in einer 50-Milliliter-Falkentube. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter Okin-NOICSÄURE mit einer Konzentration von zwei Mikrolitern pro Gramm in das Falcon-Röhrchen mit dem Ei und mischen Sie es kräftig mit dem Spatel im Falcon-Röhrchen. Eine Minute lang wird das Ei dann in ein Becherglas umgefüllt und über einem Brötchen und Brenner so lange erhitzt, bis es gerinnt und seine Konsistenz geeignet ist.

Um kleine Kugeln herzustellen, dauert dies in der Regel etwa 30 Sekunden. Die Kugeln aus Eigelb sollten 0,2 Gramm pro Maus wiegen. Es ist wichtig, die kumulative Dosis bei allen Mäusen konstant zu halten.

Unser Bereich für eine akzeptable kumulative Dosisrückgewinnung liegt bei 55 bis 100 %Beginnen Sie mit der Einrichtung der Magenentleerungskammern. Verwenden Sie saubere Kammern und Abdeckungen, die an der Luft getrocknet wurden. Auch. Alle Rohre, die die Kammer mit dem Analysator oder der Kohlendioxid-Luftzufuhr verbinden, sollten feuchtigkeitsfrei sein.

Feuchtigkeit kann das rote Signal des Analysators beeinträchtigen. Verbinden Sie die Kammern mit den Einlassrohren, die für einen Kohlenwasserstoff-gewaschenen Luftstrom sorgen. Es ist wichtig, dass diese Luft immer konstant ist, da jede Änderung der Kohlendioxidmenge den Ausgangswert verändern kann.

Verbinden Sie dann die Auslassschläuche von den Kammern mit der Maschine, schließen Sie die Rohre und schalten Sie den Luftstrom ein. Tragen Sie eine sehr kleine Menge Vaseline auf das Ende der Abdeckungen auf, damit sie sich schließen und leicht und sicher verschließen lassen. Diese dichte Versiegelung ist notwendig, um das gesamte von den Mäusen produzierte Kohlendioxid zu sammeln.

Wiegen Sie die Mäuse mit einem kleinen Maushalter, um den Stresspegel zu reduzieren. Das Körpergewicht wird als Maß für ihre anhaltend gute Gesundheit bestimmt. Platzieren Sie dann jede Maus in der entsprechenden Kammer.

Es ist wichtig, dass die Luft zu diesem Zeitpunkt in die Kammern strömt. Jede Maus ist mit einem Ortungsgerät ausgestattet. Die Daten über das Gewicht der Maus, den Blutzucker und die Behandlungen werden mithilfe einer Softwaredatenbank verfolgt, die diese Nummer verwendet.

Wir verwenden eine Software, die es uns ermöglicht, die Maus-ID-Nummer automatisch direkt mit den Geschäftsdaten zu verknüpfen. Dies kann natürlich auch manuell erfolgen. Um die Messung zu starten, lassen Sie die Mäuse sich an die Kammern gewöhnen, bevor Sie die Luftmengen anpassen.

Sobald die Mäuse ruhig erscheinen, was einige Minuten dauern kann, passen Sie den Luftdurchsatz für jede Mauskammer an. Dies kann für jede Maus unterschiedlich sein. In der Regel wird der Luftstrom zu Beginn des Experiments angepasst, um sicherzustellen, dass das ausgeatmete Kohlendioxid ein Niveau erreicht, das von den verwendeten Geräten erfasst werden kann, und um sicherzustellen, dass das Niveau niedrig genug bleibt, um einen gesunden Luftumsatz zu gewährleisten.

Wir verwenden anfängliche Kohlendioxidwerte zwischen 1000 und 1500 Teilen pro Million, wenn wir Schwierigkeiten mit der Einstellung haben, prüfen Sie auf Luftlecks. Wiederholen Sie anschließend den Vorgang für jede der Kammern und warten Sie auf eine weitere Messrunde, um zu sehen, ob Anpassungen des Luftstroms den Kohlendioxidgehalt korrigiert haben. Es ist wichtig, vor der Fütterung der Mäuse einen konstanten Ausgangswert zu erhalten.

Wenn dies erreicht ist, geben Sie der ersten Maus die Eimehl und notieren Sie die Zeit, zu der jede Maus ihr Futter erhält. Wir führen das Verfahren vier Stunden lang durch, um genügend Werte für die Anpassung der 13-Kohlendioxid-Anreicherungskurve für jede Maus zu erhalten. Überprüfen Sie die Mäuse alle 30 bis 60 Minuten, um sicherzustellen, dass der Kohlendioxidgehalt noch sicher ist.

Bei den Mäusen misst unsere Maschine alle 25 Sekunden 12 Kohlendioxid-, 13 Kohlendioxid- und Wasserkonzentrationen. Daher können 12 Mäuse gleichzeitig mit einem fünfminütigen Intervall zwischen den Messwerten analysiert werden. Wenn Sie manuell Proben nehmen oder ein anderes Gerät verwenden, stellen Sie sicher, dass Ihre Messwerte in Abständen von mindestens fünf bis 10 Minuten erfasst werden.

Bereiten Sie vor Ende des Tests neue Schachteln mit Futter vor, damit die Mäuse sofort nach Beendigung des Tests mit dem Fressen beginnen können. Dieses Diagramm stellt die Datenpunkte einer Maus mit normaler Magenentleerung dar. Sie zeigt einen Anteil von 13 Kohlenstoff, der in der ausgeatmeten Luft zurückgewonnen wird, ausgedrückt als Prozentsatz der verabreichten Dosis pro Stunde, ausgedrückt als Funktion der Zeit.

Die Datenpunkte werden durch eine Kurve mit der folgenden Gleichung angepasst. Warum ist der Prozentsatz der 13 Kohlenstoffe, die pro Stunde in der Atemluft zurückgewonnen werden, und eine B- und CA-Regression konstant? Die T-Hälfte wird berechnet, indem die Parameter dieser Kurve in die inverse Gamma-Funktion gesetzt werden, wie in einer früheren Studie in unserem Labor festgestellt, die normale Entleerungszeit der Magenhälfte für eine nicht-diabetische NOD-Maus im Alter von neun bis 15 Wochen reicht von 62 bis 1 31 Minuten, wie durch das graue Kästchen dargestellt.

Die blaue Kurve stammt von einer Maus mit einer beschleunigten Magenentleerung mit einem T-Halbwert von 40 Minuten, und die rote Kurve von einer Maus mit einer verzögerten Magenentleerung mit einem T-Halbwert von 168 Minuten. Abschließend wird in diesem Video gezeigt, wie die feste Magenentleerung mit Hilfe eines nicht-invasiven Atemtests gemessen werden kann. An Mäusen zeigten wir, wie man die Tiere auf die Prüfung vorbereitet, die Herstellung des Futters und die Sammlung der Daten.

Diese Methode zur Messung der festen Magenentleerung mit der Verabreichung von 13 Kohlenstoff-OCT Eichensäure wurde zuvor für den Menschen berichtet, und wir haben das Protokoll für die Anwendung bei Mäusen angepasst. Dieses Protokoll bietet uns eine wertvolle Methode zur wiederholten Messung der Magenentleerung in ein und derselben Maus, die es ermöglicht, die Magenentleerung für die Untersuchung von Langzeiterkrankungen zu untersuchen. Es gibt mehrere zukünftige Anwendungen dieser Methode.

Zum Beispiel die Erprobung verschiedener Medikamente zur Behandlung der diabetischen Gastroparese.