Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Saccharomyces cerevisiae

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, das Vorhandensein von mRNA-Molekülen mit Einzelmolekülspezifität in einzelnen Hefezellen nachzuweisen. Fixieren Sie zunächst die Hefezellen und das Formaldehyd mit lyasehaltigem Puffer. Durchlässig für die Zellen, bis die meisten Zellen nicht mehr hell sind.

Als nächstes inkubieren Sie die Permezellen mit fluoreszenzmarkierten einzelsträngigen DNA-Molekülen und montieren die Zellen dann auf ein plasmagereinigtes Deckglas. Letztendlich können die durch die Fluoreszenzmikroskopie erzielten Ergebnisse das Vorhandensein und die Lokalisierung von mRNA-Molekülen in einzelnen Zellen detailliert beschreiben. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Genexpression, Microarrays und Northern Blots besteht darin, dass einzelne mRNAs in einzelnen Zellen sichtbar gemacht werden können.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Transkription zu beantworten. Dazu gehört auch die Quantifizierung der Anzahl von arm-RNAs pro Zelle in einer Population, die als Grundlage für Regulationsmodelle auf Promotorebene dienen kann. Es kann auch verwendet werden, um die Lokalisation und die Halbwertszeiten von Transkripten während des Zellzyklus zu bestimmen.

In einer Plasma-Preen-Vakuumkammer gleitet die Abdeckung auf die Objektträger. Stellen Sie dann die Vakuumkammer in eine Mikrowelle und stellen Sie sicher, dass sie versiegelt ist. Schalten Sie die Pumpe ein, sobald die Pumpe gestartet ist.

Schalten Sie jetzt das Vakuum ein, schalten Sie die Mikrowelle ein und stoppen Sie fünf Sekunden, nachdem das Plasma sichtbar ist. Schalten Sie dann das Vakuum aus, gefolgt von der Pumpe. Ziehen Sie die Vakuumkammer heraus.

Übertragen Sie dann die Deckgläser mit der gereinigten Seite nach oben in 12. Well-Platten lassen die Hefe auf einen A 600 von etwa 0,1 bis 0,2 wachsen. In minimalen Medien reichen 10 mil Zellen für etwa 10 Hybridisierungen aus.

Geben Sie ein 10. Volumen 37%iges Formaldehyd direkt in das Wachstumsmedium und inkubieren Sie es 45 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 3000 g. Das Pellet wird in einem Milliliter Puffer B wieder suspendiert und in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt.

Zweimal mit einem Milliliter eiskaltem Puffer B in einem Mikrozentrifugenröhrchen waschen. Eine Minute lang bei 13.000 U/min zentrifugieren. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter Sphero-Beschichtung hinzu, puffern und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Überwachen Sie die Zellen alle paar Minuten mikroskopisch, bis die meisten Zellen schwarz sind. Dann zweimal mit eiskaltem Puffer waschen. B.Schleudern mit einer niedrigen Drehzahl von 3.500 U/min.

Fügen Sie einen Milliliter 70%ige Ethanol-Resus hinzu. Hängen Sie das Pellet vorsichtig auf und stellen Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius oder lagern Sie es unbegrenzt bei minus 20 Grad Celsius. Um die Hybridisierungslösung herzustellen, fügen Sie ein bis drei Mikroliter Sonde zu 100 Mikrolitern Hybridisierungspuffer hinzu.

Dann Wirbel und Zentrifuge. Wir haben drei verschiedene Gene gleichzeitig mit drei verschiedenen Sondensets abgebildet. Nun zentrifugieren Sie, die fixierte Hefeprobe und saugen Sie den Waschpuffer ab.

Fügen Sie die Hybridisierungslösung hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln unter leichtem Schütteln über Nacht bei 37 Grad Celsius am nächsten Tag. Behandeln Sie saubere Decklippen fünf Minuten lang mit 150 Mikrolitern 0,01 % Polylysin. Anschließend aspirieren und an der Luft trocknen.

Die Objektträger werden dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen und nach einer Wäsche mit einem XSSC Resus an der Luft getrocknet, die Zellen werden in 150 Mikrolitern von 0,1 Mikrogramm pro Milliliter suspendiert. Frisch zubereiteter Dappy färben, die Zellsuspension aliquot auf die mit Polylysin behandelten Deckgläser auftragen und 30 Minuten inkubieren. Tauen Sie anschließend das verlängerte Goldeinbettmedium auf Raumtemperatur auf.

Geben Sie drei Mikroliter auf einen Objektträger. Geben Sie dann etwa 0,5 Milliliter Ethanol auf ein Deckglas. Entfernen Sie in der 12-Well-Platte den Deckglas und trocknen Sie ihn an der Luft, während Sie ihn mit einer Pinzette festhalten.

Legen Sie die Abdeckung, schieben Sie die Zelle mit der Rutsche nach unten auf das Eindeckmedium und lassen Sie sie mehrere Stunden oder über Nacht im Dunkeln aushärten. Versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack und fahren Sie mit der Bildgebung fort. Nehmen Sie eine Reihe von Bildern um den Referenzpunkt auf, bei dem der Gesamtabstand fünf Mikrometer mit einer Größe von 0,2 Mikrometern beträgt.

Wiederholen Sie die Bildgebung für jeden Färbekanal, der jedem Sondensatz entspricht. Gehen Sie dann wie im Begleittext beschrieben vor. Um die Zellen durch Segmentierung von Wassereinzugsgebieten zu identifizieren, identifizieren Sie die Flecken mit einem radialen Gradienten und messen Sie die Flecken mit einer Gaußschen Anpassung.

In der Regel werden Histogramme aus Fischbildern berechnet und verwendet, um die Anzahl der in einzelnen Zellen vorhandenen mRNAs zu bestimmen. Ein wichtiger Vorteil der mikroskopiebasierten RNA-Quantifizierung besteht darin, dass man Informationen über die Lokalisation von Transkripten erhalten kann. Zum Beispiel verwendet dieser Fisch einzelne Sonden, um mRNAs in einzelnen Zellen mit einem induzierbaren CCB CBF eins Allel zu identifizieren.

Da viele mRNA-Moleküle am Ort der Transkription vorhanden sind, ist es einfach, das Vorhandensein und die Lage von Transkriptionsstellen im Zellkern zu identifizieren. Die Verwendung verschiedener Farbstoffe zur Markierung von mRNAs verschiedener Gene erleichtert die Quantifizierung mehrerer mRNA-Spezies in denselben Zellen. In diesem Experiment wurden Hefezellen in Gegenwart von Alpha-Faktor und Sorbit inkubiert. Unter Verwendung von Fischen mit den Stelara-Sonden zeigen die Daten, dass eine Zelle nur auf das Pheromon reagiert, das durch eine rote FUS-Startstelle angezeigt wird.

Gleichzeitig reagiert eine andere Zelle überwiegend auf Sorbit, wobei die Startstelle von S TL one grün markiert ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einzelne mRNA-Moleküle in Hefe markiert und visualisiert, sobald Sie sie beherrschen. Diese Technik kann in zwei Tagen ordnungsgemäß durchgeführt werden.

Denken Sie daran, eine ausreichend dichte Konzentration von Zellen zu haben. Für verdünnte Proben müssen mehr Felder abgebildet und gespeichert werden.