Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, das Vorhandensein von mRNA-Molekülen mit Einzelmolekül-Spezifität in einzelnen Hefezellen nachzuweisen. Zunächst fixieren Sie die Hefezellen mithilfe eines Puffergemischs mit Formaldehyd und Lyase. Permeabilisieren Sie die Zellen, bis die meisten Zellen nicht mehr hellphasig erscheinen.

Als Nächstes inkubieren Sie die permeabilisierten Zellen mit fluoreszenzmarkierten einzelsträngigen DNA-Molekülen und bringen die Zellen anschließend auf eine mit Plasma gereinigte Deckglasoberfläche auf. Letztendlich können die mittels Fluoreszenzmikroskopie erhaltenen Ergebnisse die Präsenz und Lokalisation von mRNA-Molekülen in einzelnen Zellen detailliert darstellen. Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu etablierten Verfahren wie der Genexpression, Mikroarrays und Northern Blots besteht darin, dass einzelne mRNA-Moleküle in einzelnen Zellen sichtbar gemacht werden können.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Transkription zu beantworten. Dazu gehört die Quantifizierung der Anzahl von arm-RNAs pro Zelle in einer Population, was Modelle der Regulation auf Promotorebene unterstützen kann. Sie kann auch verwendet werden, um die Lokalisation und Halbwertszeiten von Transkripten während des Zellzyklus zu bestimmen.

Platzieren Sie in einer Vakuumkammer für die Plasma-Vorbehandlung Deckgläser auf den Objektträgern. Anschließend stellen Sie die Vakuumkammer in eine Mikrowelle und vergewissern Sie sich, dass sie dicht verschlossen ist. Schalten Sie die Pumpe ein, sobald der Betrieb der Pumpe gestartet wurde.

Schalten Sie jetzt die Vakuumpumpe ein, anschließend die Mikrowelle und stoppen Sie fünf Sekunden, nachdem das Plasma sichtbar ist. Dann schalten Sie das Vakuum aus, gefolgt von der Pumpe. Nehmen Sie die Vakuumkammer heraus.

Danach die Deckgläser sauberer Seite nach oben in 12-Loch-Platten überführen und die Hefe in minimalen Medien auf eine A 600 von etwa 0,1 bis 0,2 anwachsen lassen. 10 ml Zellen ergeben ausreichend Material für etwa 10 Hybridisierungen.

Geben Sie ein Zehntelvolumen 37 % Formaldehyd direkt zum Wachstumsmedium hinzu und inkubieren Sie 45 Minuten bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 3000 Gs für fünf Minuten. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Puffer B und übertragen Sie es in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Zweimal mit einem Milliliter eiskaltem Puffer B in einem Mikrozentrifugenröhrchen waschen. Eine Minute bei 13.000 U/min zentrifugieren. Anschließend einen Milliliter Sphero-Plattierungspuffer zugeben und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Überwachen Sie die Zellen mikroskopisch alle paar Minuten, bis die meisten Zellen schwarz erscheinen. Anschließend zweimal mit eiskaltem Puffer waschen. B. Zentrifugieren bei einer niedrigen Drehzahl von 3.500 U/min.

Geben Sie ein Milliliter 70 %igen Ethanol res. su. zu. Lösen Sie das Pellet vorsichtig auf und lagern Sie über Nacht bei vier Grad Celsius oder unbegrenzt bei minus 20 Grad Celsius. Um die Hybridisierungslösung herzustellen, geben Sie ein bis drei Mikroliter Probe zu 100 Mikrolitern Hybridisierungspuffer.

Danach vortexen und zentrifugieren. Wir haben drei verschiedene Gene gleichzeitig mit drei verschiedenen Sonden-Sets abgebildet. Nun zentrifugieren, die fixierte Hefe-Probe und die Waschpufferlösung abpipettieren.

Fügen Sie die Hybridisierungslösung hinzu und inkubieren Sie am nächsten Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius im Dunkeln unter leichtem Schütteln. Behandeln Sie saubere Deckgläser mit 150 Mikrolitern 0,01 % Polylysin fünf Minuten lang. Anschließend aspirationieren und lufttrocknen.

Die Objektträger werden dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen und nach einer Waschung mit 1× SSC resuspendiert, die Zellen in 150 Mikrolitern von 0,1 Mikrogramm pro Milliliter suspendiert. Ein frisch zubereiteter DAPI-Färbelösungstropfen wird auf die mit Polylysin behandelten Deckgläser aufgetragen und 30 Minuten inkubiert. Danach wird das ProLong Gold-Aufbaumedium auf Raumtemperatur aufgetaut.

Geben Sie drei Mikroliter auf einen Objektträger. Geben Sie anschließend etwa 0,5 Milliliter Ethanol auf ein Deckglas. Entfernen Sie in der 12-Loch-Platte das Deckglas und lassen Sie es unter Verwendung einer Pinzette lufttrocknen.

Legen Sie die Deckglaszelle mit der Zellseite nach unten auf das Montagemedium und lassen Sie sie mehrere Stunden oder über Nacht im Dunkeln aushärten. Versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack und fahren Sie mit der Bildaufnahme fort. Nehmen Sie einen Zack von Bildern um den Referenzpunkt herum auf, wobei der Gesamtabstand fünf Mikrometer mit einer Schrittweite von 0,2 Mikrometer beträgt.

Wiederholen Sie die Bildaufnahme für jeden Farbstoffkanal, der jedem Sonden-Set entspricht. Fahren Sie anschließend wie im begleitenden Text beschrieben fort. Um die Zellen mittels Wasserscheidentsegmentierung zu identifizieren, erkennen Sie die Flecken anhand eines radialen Gradienten und vermessen Sie die Flecken mithilfe einer Gaußschen Anpassung.

Üblicherweise werden Histogramme aus FISH-Bildern berechnet und zur Bestimmung der Anzahl an mRNA-Molekülen in einzelnen Zellen verwendet. Ein wesentlicher Vorteil der mikroskopiebasierten RNA-Quantifizierung besteht darin, dass man Informationen über die Lokalisation der Transkripte erhält. Beispielsweise verwendet dieser FISH-Ansatz einzelne Sonden, um mRNA-Moleküle in einzelnen Zellen mit einem induzierbaren CCB-CBF1-Allel nachzuweisen.

Da viele mRNA-Moleküle an der Transkriptionsstelle vorhanden sind, lässt sich das Vorhandensein und die Lokalisation von Transkriptionsstellen im Zellkern leicht identifizieren. Die Verwendung verschiedener Farbstoffe zur Markierung von mRNAs unterschiedlicher Gene erleichtert die Quantifizierung mehrerer mRNA-Spezies in denselben Zellen. In diesem Experiment wurden Hefe-Zellen in Gegenwart von Alpha-Faktor und Sorbitol inkubiert. Unter Verwendung von FISH mit den Stelara-Sonden zeigen die Daten eine Zelle, die nur auf das Pheromon reagiert, was durch eine rote FUS1-Startstelle angezeigt wird.

Gleichzeitig reagiert eine andere Zelle vorwiegend auf Sorbitol, wobei die S TL-Einsetzstelle grün markiert ist. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie einzelne mRNA-Moleküle in Hefe markiert und sichtbar gemacht werden können. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie innerhalb von zwei Tagen ordnungsgemäß durchgeführt werden.

Stellen Sie sicher, dass die Zellkonzentration ausreichend hoch ist. Verdünnte Proben erfordern die Aufnahme und Speicherung von mehr Bildfeldern.