Name: Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Erfahren Sie die Echtzeit-Visualisierung endogener mRNA in lebenden Drosophila melanogaster Eierkammern mittels molekularer Leuchtfeuer und konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von RNA-Lokalisierungsmechanismen.

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Wir danken Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) für die Synthese, Kennzeichnung und Reinigung molekularer Leuchttürme und Daniel St Johnston (The Gurdon Institute, University of Cambridge) für die Oskar-MS2/ MCP-GFP transgene Fliegenlager. Diese Arbeit wurde durch einen National Science Foundation CAREER Award 1149738 und einen Professional Staff Congress-CUNY Award an dPB unterstützt.

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<li>Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons%3A+Fluorescent+probes+for+detection+of+endogenous+mRNAs+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).</li>
<li>Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li>
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<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550(2017).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+microRNAs+by+combining+molecular+beacon+probes+with+T7+exonuclease-assisted+cyclic+amplification+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).</li>
<li>Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+quantification+of+specific+microRNA+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Research. 40 (2), e13(2012).</li>
<li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626(2014).</li>
<li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li>
<li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li>
<li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li>
<li>Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Beacon+Nano-Sensors+for+Probing+Living+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells.</a> Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).</li>
<li>Ban, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+Purification+of+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Differentiating+Embryonic+Stem+Cells+through+Molecular+Beacons+Targeting+IRX-4%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).</li>
<li>Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacon-based+real-time+PCR+detection+of+primary+isolates+of+Salmonella+Typhimurium+and+Salmonella+Enteritidis+in+environmental+and+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples.</a> BMC Microbiology. 9, 97(2009).</li>
<li>McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+Oogenesis%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).</li>
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<li>Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+oskar+RNA+regulates+oskar+translation+and+requires+Oskar+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein.</a> Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).</li>
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<li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105(2007).</li>
<li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).</li>
<li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li>
<li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
<li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commununications%22%5BJournal%5D)">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962(2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu offenbaren.

Die Live-Visualisierung des endogenen mRNA-Handels in Drosophila-Eikammern beruht auf der Verwendung spezifischer, effizienter und nukleaseresistenter MBs, die nun einfach mit der PinMol-Software entworfen werden können. MBs sind spezifische Sonden, die entwickelt wurden, um eindeutige Sequenzen innerhalb einer Ziel-mRNA zu erkennen (vorzugsweise Regionen frei von sekundärer Struktur), was eine hochaufgelöste Detektion eines Transkripts ermöglicht. Die einzige Einschränkung bei der Einführung dieser Tec...

Zellbiologische Studien, die dynamische Ereignisse mit räumlicher und zeitlicher Auflösung visualisieren, wurden durch die Entwicklung fluoreszenzbasierter Live-Zell-Bildgebungstechniken ermöglicht. Derzeit wird die in vivo mRNA-Visualisierung über Technologien erreicht, die auf RNA-Aptamer-Protein-Wechselwirkungen, RNA-Aptamer-induzierter Fluoreszenz organischer Farbstoffe und Nukleinsäuresonde-Glühen1,2, 3. Sie alle bieten eine hohe Spezifität, Empfindlichkeit und Signal-Hintergrund-Verhältnis. RNA-aptamerzentrierte Ansätze erfordern jedoch eine umfassende genetische Manipulation, bei der ein Transgen entwickelt wurde, um eine RNA mit künstlichen Strukturmotiven auszudrücken, die für die Protein- oder organische Farbstoffbindung erforderlich sind. Beispielsweise erfordert das MS2/MCP-System die Koexpression eines Transgens, das ein RNA-Konstrukt exmittiert, das mehrere Tandemwiederholungen der Bindungssequenz für das Bakteriophage MS2-Beschichtungsprotein (MCP) enthält, und ein weiteres Transgen, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert. mit MCP4,5verschmolzen. Die Zugabe solcher sekundären Strukturmotive zur RNA, zusammen mit einem sperrigen fluoreszierend getaggten Protein, hat Bedenken aufkommen lassen, dass native RNA-Prozesse betroffen sein könnten6. Eine Technologie, die diesem Anliegen begegnet und weitere einzigartige Vorteile bietet, ist der nukleinsäurebasierte Ansatz, molekulare Leuchttürme (MBs). MBs ermöglichen den Multiplex-Nachweis von endogenen mRNAs, die Diskriminierung einzelner Nukleotidvariationen und eine schnelle Kinetik der Hybridisierung mit Ziel mRNA7,8. MBs sind Oligonukleotid-Sonden, die in einer abgeschreckten Haarnadelfalte verbleiben, bevor sie sich einer fluorogenen Konformationsänderung unterziehen, sobald sie sich mit ihren Zielen hybridisieren (Abbildung 1C)9. Mehrere Gruppen hatten Erfolg bei der Verwendung von MBs, um sowohl nicht-kodierende RNAs (microRNAs und lncRNAs)10,11,12,13, RNA-Retroviren14 und dynamisches DNA-Protein zu detektieren Wechselwirkungen15. Sie wurden erfolgreich für die Bildgebung in verschiedenen Organismen und Geweben eingesetzt, wie Zebrafisch-Embryonen16, Neuronen13, Tumorgewebe17, Differenzierung Kardiomyozyten18, und Salmonellen 19.
Hier beschreiben wir den Design-, Liefer- und Detektionsansatz für endogene mRNAs in lebenden D. melanogaster Eikammern gekoppelt mit einem Mikroskopie-Setup, das schnell genug ist, um den Dynamikbereich des aktiven molekularen Transports zu erfassen. Die D. melanogaster Eikammer diente als ideales multizelluläres Modellsystem für eine breite Palette von Entwicklungsstudien, von der frühen Keimbahnstammzellteilung und mütterlichen Genexpression bis hin zur Generierung des segmentalen Körperplans20, 21. Eierkammern sind leicht zu isolieren, groß und durchscheinend und können stundenlangen Ex-vivo-Analysen standhalten, wodurch sie für bildgebende Experimente sehr zugänglich sind. Viele Arbeiten konzentrierten sich auf die asymmetrische Lokalisierung von mütterlichen Transkripten in diskrete subzelluläre Regionen, bevor sie aktiv übersetzt wurden. Insbesondere muss die Oskar mRNA-Lokalisierung und ihre anschließende Übersetzung am hinteren Pol der Eizelle streng reguliert erfolgen, um einen tödlichen bicaudalen Embryo-Phänotyp22zu vermeiden. oskar mRNA wird in den 15 Keimbahnzellen transkribiert, krankenschwestern Zellen genannt, und aktiv durch zytoplasmatische Brücken, ringal genannt, in die Oozyte transportiert, die Keimlinzelle, die das reife Ei wird und letztlich befruchtet wird (Abbildung 1A ). Die beträchtliche Menge an Informationen, die bereits über die dynamische Rekrutierung und den Austausch von Proteinfaktoren zu und von Oskar mRNP sowie über die grenzüberschreitende grenzüberschreitende Reise von Oskar mRNP zur Verfügung stehen, macht Oskar zu einem bevorzugten Studienkandidaten. die vielen Prozesse des mRNA-Lebenszyklus. MBs haben maßgeblich dazu beigetragen, Details über den Prozess der mRNA-Lokalisierung zu enthüllen und die Regulation und Funktion von Proteinfaktoren zu entschlüsseln, die den mRNA-Transport während der Drosophila-Oogenese steuern. Insbesondere durch mikroinjizierende MBs in Pflegezellen und Durchführung von Live-Zell-Bildgebungsexperimenten ist die Verfolgung endogener mRNAs möglich8,23.
Die hier vorgestellte Roadmap bietet die Schritte eines vollständigen Prozesses, von der Durchführung eines Live-Zell-Bildgebungsexperiments mit MBs über die Erfassung von Bilddaten bis hin zur Durchführung von Datenanalysen zur Verfolgung endogenes mRNA in seiner nativen zellulären Umgebung. Die Schritte können modifiziert und weiter optimiert werden, um den Anforderungen von Forschern gerecht zu werden, die mit anderen Geweben/Zelltypen innerhalb ihrer eigenen Laborumgebung arbeiten.

<table><tbody><tr><td>Spektrofluorometer</td><td>Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon</td><td>n/a</td><td>Photonenzählspektrofluorometer</td></tr><tr><td>Quarzküvette</td><td>Fireflysci (ehemals Precision Cells Inc.)</td><td>701MFL</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td>Dünne Pinzetten sind sehr wichtig, um die einzelnen Eikammern zu trennen</td></tr><tr><td>Halogenkohlenwasserstofföl 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas Nr.1 22 mm x 40 mm</td><td>VWR</td><td>48393-048</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Fruchtfliegen-Anästhesiepad</td><td>Genesee Scienific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL pH 7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td> <td>mit Spinning-ScheibeInverses Mikroskop Leica DMI-4000B mit Yokogawa CSU 10 Spinning Disc Leica Microsystems Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>PatchMan NP 2 Mikromanipulator</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>920000037</tr><tr><td>FemtoJet Mikroinjektor</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>920010504</tr><tr><td>Injektionsnadel: Femtotips II</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>930000043</tr><tr><td>Ladespitze: 20 &mu; L Microloader</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>930001007</tr><tr><td>Micro Cover Brille Nr. 1 oder 1.5, 22 mm x 40 mm</td><td>VWR</td><td>48393-026; 48393-172</td><td></td></tr><tr><td>Trockenhefe</td><td>Beliebiges Lebensmittelgeschäft</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Computer, > 20 GB RAM</td><td></td><td></td><td>Obwohl die Verarbeitung auf den meisten Computern durchgeführt werden kann, erhöhen höhere Funktionen die Geschwindigkeit der Verarbeitung</td></tr></tbody></table>

visualisierung und verfolgung endogenes mrnas in live drosophila melanogaster eierkammern

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluoreszenzbasierte bildgebende Verfahren in Kombination mit Entwicklungen in der Lichtmikroskopie haben die Art und Weise revolutioniert, wie Zellbiologen Live-Zell-Bildgebungsstudien durchführen. Die Methoden zum Nachweis von RNAs haben sich stark ausgeweitet, seit bahnbrechende Studien die standortspezifische mRNA-Lokalisierung mit der Genexpressionsregulation verknüpften. Dynamische mRNA-Prozesse können nun über Ansätze visualisiert werden, die mRNAs erkennen, gekoppelt mit Mikroskopie-Setups, die schnell genug sind, um den dynamischen Bereich des molekularen Verhaltens zu erfassen. Die molekulare Beacon-Technologie ist ein hybridisierungsbasierter Ansatz, der in der Lage ist, endogene Transkripte in lebenden Zellen direkt zu detektieren. Molekulare Leuchttürme sind haarförmige, intern abgeschreckte, single-nukleotiddiskriminierende Nukleinsäuresonden, die erst bei Hybridisierung zu einer einzigartigen Zielsequenz fluoreszieren. In Verbindung mit fortschrittlicher Fluoreszenzmikroskopie und hochauflösender Bildgebung ermöglichen sie eine räumliche und zeitliche Verfolgung der intrazellulären Bewegung von mRNAs. Obwohl diese Technologie die einzige Methode ist, die in der Lage ist, endogene Transkripte zu erkennen, haben Zellbiologen diese Technologie aufgrund von Schwierigkeiten bei der Entwicklung solcher Sonden für die Bildgebung von lebenden Zellen noch nicht vollständig angenommen. Eine neue Softwareanwendung, PinMol, ermöglicht ein verbessertes und schnelles Design von Sonden, die am besten geeignet sind, um mRNA-Zielregionen innerhalb einer lebenden Zelle effizient zu hybridisieren. Darüber hinaus ermöglichen hochauflösende, Echtzeit-Bildaufnahme und aktuelle Open-Source-Bildanalyse-Software eine verfeinerte Datenausgabe, was zu einer feineren Bewertung der Komplexität führt, die den dynamischen Prozessen zugrunde liegt, die im Lebenszyklus der mRNA beteiligt sind.
Hier stellen wir ihnen ein umfassendes Protokoll zur Gestaltung und Lieferung molekularer Leuchttürme in Drosophila melanogaster Eierkammern vor. Die direkte und hochspezifische Detektion und Visualisierung endogener mütterlicher mRNAs erfolgt über die konfokale Mikroskopie der Spinnscheibe. Imaging-Daten werden mithilfe der Objekterkennung und -verfolgung in der eisigen Software verarbeitet und analysiert, um Details über die dynamische Bewegung von mRNAs zu erhalten, die in spezialisierte Regionen innerhalb der Eizelle transportiert und lokalisiert werden.

Mit PinMolkönnen mehrere MBs für ein mRNA-Ziel ausgelegt werden (Abbildung 1B-C). Nach Der Synthese und Reinigung werden die ausgewählten MBs charakterisiert und mittels In-vitro-Analyse verglichen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58545/58545fig1.jpg"> Abbildung 1: Technik und Gewebebeschreibung für die Bildgebung von endogenen mRNAs.</...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung, Detektion, Analyse und Verfolgung des endogenen mRNA-Handels in der lebenden Drosophila melanogaster Eikammer mit molekularen Baken, Spinnscheiben-Konfokalmikroskopie und Open-Source-Analyse vor. software.

Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der RNA-Biologie über den Mechanismus und die Funktion der polarisierten RNA-Lokalisierung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Echtzeit-Visualisierung des endogenen RNA-Handels mit lebenden Geweben ermöglicht. Die Implikationen dieser Technik reichen auf die Therapie von RNA-bedingten Krankheiten, da sie das Potenzial hat, neue therapeutische Ziele aufzudecken.Obwohl diese Methode Einblicke in RNA-Prozesse in der Fruchtfliegeneikammer geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Zebrafische oder Kulturzellen angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, wegen der Herausforderungen kämpfen, die mit dem Design und der Lieferung der molekularen Leuchtfeuerrequisiten verbunden sind. Wählen Sie für die molekulare Baken-Mikroinjektion das 40X-Ölobjektiv aus und montieren Sie einen Deckelschlupf mit der sezierten Eikammer auf die Mikroskopstufe.Suchen Sie eine Eikammer in der mittleren bis späten Entwicklungsphase, die richtig für die Mikroinjektion ausgerichtet ist. Dann einen Mikroinjektor mit den entsprechenden Injektions- und Kompensationsdrücken einrichten. Mit dem Mikromanipulator-Joystick senken Sie vorsichtig eine Nadel, die mit einem Mikroliter molekularer Leuchtmittel in den Öltropfen geladen ist.Bringen Sie die Spitze in den Fokus zur Peripherie des Sichtfeldes. Führen Sie eine saubere Funktion aus, um die Luft von der Nadelspitze zu entfernen und sicherzustellen, dass es Einen Fluss von der Nadel gibt und bringen Sie die Nadel in die Heimatposition. Konzentrieren Sie sich auf die zu mikroinjizierende Eikammer und bringen Sie die Nadel in der Nähe des Rands der Eikammer wieder in den Fokus.Führen Sie eine Feineinstellung der Z-Position des Objektivs durch, so dass die Membran, die die Follikelzellen von den Pflegezellen trennt, im Fokus steht. Setzen Sie die Nadel für die Injektion der molekularen Leuchttürme über einen Zeitraum von zwei bis fünf Sekunden in eine Ammenzelle ein. Um einen reproduzierbaren Mikroinjektionserfolg zu gewährleisten, konzentrieren Sie sich sorgfältig auf die Membran, die die Follikelzellen und die Pflegezellen trennt, die injiziert werden, während die Spitze der Nadel mit dem Mikromanipulator in den Fokus gerückt wird.Wenn alle molekularen Baken injiziert wurden, entfernen Sie vorsichtig die Nadel und ziehen Sie sie in die Heimatposition zurück. Ändern Sie das Ziel in die gewünschte Vergrößerung für die Bildaufnahme. Dann konzentrieren Sie sich auf die Eikammer unter dem neuen Ziel und beginnen Sie mit der Bildaufnahme.Zur Punkterkennung der molekularen Baken öffnen Sie die Bilder in Bild J.Verwenden Sie das Werkzeug Konvertieren in ICY, um die Bilder zurück in ICY zu konvertieren. Eine Maßstabsleiste wird automatisch auf den Stapel gelegt. Bearbeiten Sie die Skalenleiste nach Bedarf über das Inspektorfenster.Deaktivieren Sie dann das Augensymbol für die Maßstabsleiste unter der Ebenenregisterkarte, um die Maßstabsleiste aus dem ursprünglichen Stapel zu entfernen. Wählen Sie Erkennung und Nachverfolgung, Erkennung und Spotdetektor aus, und bestätigen Sie, dass die aktuelle Sequenzeingangserkennung und der Kanal Null für die Eingabe- und Vorverarbeitungsparameter ausgewählt sind. Für Detektor, wählen Sie hellen Fleck über dunklen Hintergrund mit Kraft Verwendung von 2D-Wellenlängen für 3D nur, wenn es nicht genügend Z-Slices in den Stapeln, um die Analyse durchzuführen.Wählen Sie Skalen und Empfindlichkeit für jede Skala aus, die weitere Skalen für größere Spots hinzufügt, und bestätigen Sie, dass der Bereich von Interesse aus der Sequenz für den Bereich von Interesse festgelegt ist. Bestätigen Sie zum Filtern, dass keine Filterung festgelegt wurde, und wählen Sie das entsprechende Dateiformat unter Ausgabe aus. Wenn die Ergebnisse des Spotdetektors für die Tracking-Analyse verwendet werden sollen, wählen Sie Export ins Schwimmbad aus.Wiederholen Sie für die Analyse der Kolokalisierung die Spoterkennung für den anderen Kanal. Um die molekularen Leuchtfeuer zu verfolgen, wählen Sie Erkennung und Verfolgung, Tracking, Spot-Tracking und führen Sie den Spotdetektor mit den gleichen Parametern wie für die Spot-Erkennung aus. Klicken Sie auf Schätzen der Parameter und wählen Sie die gewünschte Zielbewegung im Parameter-Schätz-Popup-Fenster aus.Klicken Sie dann auf "Run Tracking". Um die Spuren zu visualisieren, wählen Sie Erkennung und Verfolgung, Tracking und Spur-Manager aus. Wählen Sie für den Farbspurprozessor aktivieren aus, und wählen Sie eine Farbe für die Spuren aus.Wählen Sie unter Spurprozessor den Zeitclip des Spurprozessors aus. Geben Sie im Fenster "Check Clipper" die Anzahl der Erkennungen ein, die vor und nach dem aktuellen Zeitpunkt angezeigt werden sollen. Speichern Sie die Track-Informationen als XML-Spurdatei und verwenden Sie das Kamerasymbol, um einen Screenshot der Ergebnisse zu erhalten.Um den Stapel entlang der Z-Richtung zu projizieren, verwenden Sie die Suchleiste, um das Plugin zu finden und die maximale Projektion aus dem Dropdown-Menü auszuwählen. Wählen Sie im Inspektorfenster die Sequenzregisterkarte, den Canvas und die Drehung aus, um das Bild an die gewünschte Ausrichtung anzupassen und einen Screenshot des gedrehten Bildes zu erhalten. Wählen Sie dann Region von Interesse, 2D-Interessenbereich, wählen Sie Region von Interesse Form, und wählen Sie die Region von Interesse auf dem Bild für das Zuschneiden.Installieren Sie das Timestamp-Overlay-Plugin und fügen Sie einen Zeitstempel hinzu, der den Anweisungen im Popup-Fenster folgt, um Anweisungen zum Platzieren und Formatieren des Zeitstempels zu erhalten. Um das Zeitintervall zu ändern oder hinzuzufügen, klicken Sie im Fenster Sequenzeigenschaften auf Bearbeiten. Aktivieren Sie das Augensymbol, um die Maßstabsleiste unter der Ebenenregisterkarte im Inspektorfenster wieder hinzuzufügen.Dann erhalten Sie einen Screenshot der Zeitstempel-Ergebnisse und speichern Sie das Bild in TIFF- und AVI-Formaten. Mit dieser Methode, wie gezeigt, ist es möglich, die Transport- und Lokalisierungsmuster von endogenen mRNAs über molekulare Baken in verschiedenen Stadien der Oogenese und insbesondere bei und nach der mittleren Oogenese zu visualisieren. Bei einzeln in die gleichen Stadium Eikammern injiziert, verschiedene Oskar spezifische molekulare Leuchttürme präsentieren das gleiche Muster der Lokalisation.Molekulare Leuchttürme, die in das Zytoplasma einer Ammenzelle injiziert werden, diffundieren frei in benachbarte Pflegezellen sowie in die Eizelle. So sind die Beacons in der Lage, mit ihren Zielen zu hybridisieren und Fluoreszenzsignale an anderen Standorten als der Mikroinjektionsstelle zu erzeugen. In oskar GFP transgene Eikammern bei der mittleren Oogenese zeigt die Analyse der Erfassungsdaten eine umfangreiche Kolokalisierung des Fluoreszenzsignals gentechnisch veränderter GFP-getaggter Oskar mRNA mit dem fluoreszenzsignal, das mit molekularen Baken nachgewiesen wurde.Darüber hinaus können 5D-Stacks weiter analysiert werden, um Oskar mRNA-Trajektorien für den Ferntransport sowohl in der Krankenschwester natund-Zytoplasma zu bestimmen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der RNA-Biologie, um den endogene mütterliche mRNA-Transport und die Lokalisierung in der Drosophila-Eikammer zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

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