Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Studenten der Naturwissenschaften an die Microarray-Technologie heranzuführen, indem die Expressionsunterschiede bei Hefe unter oxidativem Stress untersucht werden. Dies wird erreicht, indem zunächst die Gesamt-RNA aus Hefekulturen, die mit Wasserstoffperoxid behandelt wurden, und den unbehandelten Kontrollen isoliert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, CDNA aus diesen RNA-Proben zu generieren und zu reinigen.

Das CDNA wird dann verwendet, um Biotin-markiertes CRNA durch In-vitro-Transkription herzustellen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Fragmentierung der Biotin-markierten CRNAs für die Hybridisierung mit den AFI-metrischen Hefe-Genchips. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Expressionsunterschiede in den beiden Hefeproben zeigen und durch Bioinformatik die Leistungsfähigkeit der Microarray-Analyse für Studenten demonstrieren.

Das Outreach-Team des Vermont Genetics Network hatte die Idee zu dieser Methode, als es damit beauftragt wurde, Studenten der Naturwissenschaften im gesamten Bundesstaat Vermont mit Mikrostrahlentechnologie zu versorgen, um ihre naturwissenschaftliche Ausbildung zu verbessern. Bis heute wurde diese Methode an mehreren Standorten an acht Abiturschulen im ganzen Bundesstaat angeboten. Der Hauptvorteil der Verwendung von Mikrostrahlen in den Lehrmodulen besteht darin, dass wir die Möglichkeit haben, allgemeine molekularbiologische Techniken, die jeden Tag im gesamten Labor angewendet werden, einer Gruppe von Personen beizubringen.

Und wir können dies auch nutzen, um Schülern und Lehrern gleichermaßen und unseren Gruppen zu unterrichten. Wir haben tatsächlich Studenten und Professoren, die gemeinsam an einem Projekt arbeiten. Sie erlernen bestimmte Techniken, die viel Fingerspitzengefühl erfordern, wie z.B. den Umgang mit RNA, was keine leichte Aufgabe ist.

Sie lernen, wie man DNA mit Hilfe von Visualisierungsreagenzien ausfällt. Sie können tatsächlich die Techniken anwenden, denen sie im Studium oder in alltäglichen molekularbiologischen Labors begegnen werden. Obwohl diese Methode geeignet ist, um Einblicke in oxidativen Stress und Hefe zu gewinnen, ist sie sicherlich auf andere Modellorganismen und andere biologische Systeme anwendbar, die Sie sich vielleicht ansehen möchten.

Die Genexpression verändert sich, unabhängig davon, ob sie mit Entwicklungsveränderungen, Umweltgiften, spezifischen Krankheitszuständen und vielem mehr verbunden ist. Um die Expressionsunterschiede bei Hefe unter oxidativem Stress zu untersuchen, wird zunächst die Gesamt-RNA durch enzymatische Lyse aus zwei Hefekulturen extrahiert. Eine Kultur wurde durch eine einstündige Behandlung mit 0,5 millimolaren Wasserstoffperoxid in hanks gepufferter Kochsalzlösung oxidativem Stress ausgesetzt, während die andere Kultur nur mit HBSS als Kontrolle behandelt wurde.

Beginnen Sie damit, zwei 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit den entsprechenden Identifikationsinformationen zu beschriften. Übertragen Sie 1,5 Milliliter der entsprechenden Hefekultur in jedes Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 5.000 g zwei Minuten lang bei Raumtemperatur.

Verwenden Sie nach der Zentrifugation eine Mikropipette, um den Überstand vorsichtig zu entfernen und zu entsorgen, ohne das Pellet zu beschädigen. Überprüfen Sie, ob das Pellet groß genug ist, bevor Sie mit dem Vorgang fortfahren. Wenn das Pellet zu klein ist, geben Sie 1,5 Milliliter Kultur in dasselbe Röhrchen, in dem sich das Pellet befindet, und zentrifugieren Sie dann, um ein größeres Pellet zu erhalten.

Entsorgen Sie den Überstand mit einer Mikropipette und entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Hefepellet. Geben Sie dann 100 Mikroliter SG-Puffer und 30 Mikroliter Liase-Lösung zum Mischen in den Hefepellet-Wirbel. Inkubieren Sie beide Röhrchen während der Inkubation 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Schwenken Sie jedes Rohr vorsichtig alle 10 Minuten, um Platten zu erzeugen. Einer der wichtigsten Schritte bei der Sphero-Plattierung von Hefe besteht darin, sicherzustellen, dass Sie nach der Behandlung tatsächlich hundertprozentiges Sphero-Plast hergestellt haben. Das bedeutet, dass nicht alle lytischen Enzyme gleich sind.

Sie müssen also überprüfen, ob ein gutes lytisches Enzym eine gute Sphärobeschichtung bietet, was bedeutet, dass Sie diese Proben nehmen, sie auf einen Objektträger legen und unter dem Mikroskop überprüfen müssen, indem Sie 0,1% SDS hinzufügen, um sicherzustellen, dass Sie Protoplastenbildung haben. Um eine vollständige Sphärobeschichtung zu beobachten, pipettieren Sie 10 Mikroliter der Hefeprobe auf einen Objektträger, während Sie die Probe unter dem Mikroskop mit einem Mikroliter von 0,1 % SDS untersuchen, um die Hefezellen aufquellen zu lassen und perfekte Kugeln oder Sphäroide zu bilden. Es ist wichtig zu beobachten, dass die knospenden Zellen ebenfalls S-Sphäroide bilden.

Wenn eine partielle Sphäroplattierung beobachtet wird, wird eine erweiterte Behandlung mit Liase empfohlen. Sobald die vollständige Sphärobeschichtung mit 350 Mikrolitern BRLT-Puffer auf jedes Röhrchen bestätigt wurde, fügen Sie 250 Mikroliter 100%iges Ethanol hinzu. Stellen Sie sicher, dass das Röhrchen fest verschlossen ist, indem Sie den Deckel geschlossen halten und eine Minute lang kräftig vortexen.

Durch dieses Verfahren werden die Sphero-Platten verläuselt. Verwenden Sie danach R- und einfache Z-Spin-Säulen, um die RNA aus den beiden Kulturen zu sammeln und zu reinigen. Bewerten Sie schließlich die Qualität der extrahierten RNA mit 1,2 % vorgefertigtem Arous-Gel für die Elektrophorese zur Herstellung von Biotin-markiertem CRNA.

Die aus den Hefezellen extrahierte Gesamt-RNA wird zunächst zur Synthese von CD NA durch reverse Transkription verwendet. Bereiten Sie nach der CD-NA-Erzeugung Phase-Lock-Gelröhrchen für die Verwendung in CD-NA-Fällungszentrifuge-Phase-Lock-Gelröhrchen eine Minute lang bei voller Geschwindigkeit vor, um sicherzustellen, dass sich das Gel am Boden des Röhrchens befindet. Phase-Lock-Röhrchen nicht vortexen, um CD-NA-Pipette 162 Mikroliter der unteren Schicht eines pH 8,0 Tris-gepufferten Phenylchloroform-, Isoamylalkohol- oder PCI-Gemisches auszufällen, und zu den 162 Mikrolitern des zweiten Strangs, des CD-NA-Synthesereaktionsrohrs gleiche Volumina an wässrigen und organischen Gemischen hinzufügen, sind für diesen Schritt erforderliche Mengen an wässrigen und organischen Gemischen erforderlich.

Fünf Sekunden lang vortexen, um den Inhalt zu vermischen. Übertragen Sie anschließend mit einer Mikropipette das gesamte CD-N-A-P-C-I-Gemisch in das Phase-Lock-Gel-Röhrchen. Wirbeln Sie die Phase-Lock-Gel-Röhrchen-Zentrifuge nicht zwei Minuten lang bei voller Geschwindigkeit.

Verwenden Sie dann eine Mikropipette, um die oberste Schicht vom Phase-Lock-Gel-Röhrchen auf ein neu beschriftetes 1,7-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Versuchen Sie, so viel wie möglich von der Schicht zu sammeln. Geben Sie Folgendes in das 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, 405 Mikroliter 100 % Ethanol, 80 Mikroliter Ammoniumacetat und einen Mikroliter Pelletfarbenwirbel

Legen Sie das Röhrchen kurz mit dem Scharnier des Röhrchens nach außen in die Zentrifuge und zentrifugieren Sie 20 Minuten lang bei voller Drehzahl. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, nehmen Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur vorsichtig aus der Zentrifuge und achten Sie darauf, das CD NA-Pellet nicht zu beschädigen. Das Pellet sollte wegen der Pelletfarbe rosa sein und ungefähr die Größe eines Salzkorns haben.

Legen Sie das CD NA-Pellet an der Seite des Rohrs unter dem Scharnier auf Eis und fahren Sie sofort mit der Reinigung des Pellets fort. Um mit der Reinigung des CD NA-Pellets zu beginnen, verwenden Sie eine P 1000 Mikropipette, um vorsichtig den gesamten Überstand aus dem Röhrchen zu entfernen. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.

Es wird Ihre Probe bei 500 Mikrolitern kaltem, 80%igem Ethanol in das Röhrchen gegeben. Verschließen Sie das Rohr vorsichtig und drehen Sie es mehrmals langsam um. Beobachte dein Pellet sehr genau, um sicherzustellen, dass es sich nicht von der Seite des Rohrs löst.

Wenn sich das Pellet löst, können Sie es wieder an den Boden des Röhrchens bringen, indem Sie das Röhrchen entweder wieder in das Gestell legen und das Pellet am Boden absetzen lassen oder das Röhrchen 15 Sekunden lang bei voller Geschwindigkeit zentrifugieren. Verwenden Sie anschließend eine P 1000 Mikropipette, um das Ethanol vorsichtig zu entfernen, ohne das Pellet zu stören. Kippen Sie das Rohr, um so viel Flüssigkeit wie möglich entfernen zu können.

Fügen Sie ein neues Eloqua aus kaltem, 80%igem Ethanol hinzu, verschließen Sie das Röhrchen und drehen Sie es mehrmals langsam um. Nach dem Entfernen des gesamten Ethanols mit einer P 1000 Mikropipette möglich. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Sekunden lang bei voller Geschwindigkeit.

Verwenden Sie dann eine P 10 Mikropipette, um die letzten Mikroliter Ethanol zu entfernen, ohne das Pellet zu stören. Legen Sie das offene Röhrchen für 10 bis 20 Minuten in eine Trockenbox, um das restliche Ethanol zu verdampfen. Das Pellet geht leicht verloren, wenn es trocken ist, also achten Sie darauf, das Rohr vorsichtig zu behandeln und die Kappe zu schließen.

Wenn die Trocknung abgeschlossen ist, visualisieren Sie das getrocknete Pellet, um zu bestätigen, dass es im Rohr vorhanden ist. Zum Schluss resuspendieren Sie das getrocknete Pellet in 22 Mikrolitern RNA-freiem Wasser und stellen das Röhrchen auf Eis. Dieses CDNA wird dann verwendet, um Biotin-markiertes CRNA durch In-vitro-Transkription mit dem Enzo BioArray-Kit herzustellen.

Nachdem das mit Biotin markierte CRNA gereinigt und quantifiziert wurde, wird es für die Zielpräparation fragmentiert. Sobald die CDNA generiert wurde, verwenden wir die Standard-In-vitro-Transkriptionsmethode, um biotinylierte CRNA zu erzeugen. Die CRNA muss eine Fragmentierung durchlaufen, bevor sie auf den Mikrostrahlenchip angewendet werden kann.

Um dieses Verfahren zu starten, übertragen Sie eine Menge, die fünf Mikrogramm CRNA entspricht, in ein markiertes 0,5-Milliliter-PCR-Röhrchen. Fügen Sie genügend RNAs freies Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 16 Mikroliter zu bringen, und geben Sie dann vier Mikroliter mit fünf x Fragmentierungspuffer in das Röhrchen. Das Gesamtvolumen in der Tube sollte 20 Mikroliter betragen.

Das Röhrchen vortexen und 10 Sekunden lang zentrifugieren. Dann inkubieren Sie das Röhrchen bei 94 Grad Celsius für 30 Minuten. Legen Sie das Röhrchen nach der Inkubation in einem Thermocycler auf Eis.

Die fragmentierte und unfragmentierte CRNA aus jeder Probe wird dann durch Elektrophorese mit einem 1,2 %-vorgefertigten AROS-Gel bewertet. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, wird das Gel auf einem Transluminator visualisiert und ein Bild aufgenommen. Das endgültige Syntheseprodukt wird mit den Atric-Hefe-Genchips hybridisiert und hier werden repräsentative Ergebnisse aus der Microarray-Analyse gezeigt.

Diese erste Abbildung ist ein Beispiel für ein gescanntes Atrics Hefe-Genchip-Bild, das von der atrics Genchip-Betriebssoftware generiert wurde. Dies ist ein 2D-Streudiagramm aller genetischen Transkripte, etwa 6.700 Gene, die Kontroll- und behandelte Hefedaten vergleichen. Jeder Punkt steht für ein einzelnes Gen.

Lila gefärbte Gene weisen auf Gene hin, die unterschiedlich exprimiert werden, während rot eingefärbte Gene dies nicht sind. In diesem Beispiel sind die meisten der differentiell exprimierten Gene diejenigen, die an der Zellzykluskontrolle beteiligt sind, wie aus ihren Beschreibungen hervorgeht. Dieses Flussdiagramm aus der Datenbank zur Annotationsvisualisierung und integrierten Entdeckung veranschaulicht differentiell exprimierte Gene in einem betroffenen biologischen Signalweg.

Die mit einem roten Stern gekennzeichneten Gene weisen auf die herunterregulierten Gene im miotischen Signalweg hin. Abschließend werden hier repräsentative Ergebnisse eines Vulkandiagramms gezeigt, das mit einer Geo-Spezies-Gensichter-Software erstellt wurde. Kontroll- und behandelte Proben wurden mit einem P-Wert-Cutoff von 0,05 und einem 1,5-fachen Cutoff der Expressionsänderung verglichen.

Wir haben uns für die Verwendung von Hefe entschieden, weil Hefe leicht und schnell zu züchten ist, aber wir haben auch erkannt, dass der wichtigste Teil der Arbeit mit Hefe darin besteht, eine anständige Sphärobeschichtung zu erzeugen. Eines der Dinge, die wir bei Microarrays nicht tun wollen, ist eine unvollständige Verdauung durchzuführen und eigentlich nur plastische Zellen zu sphärorodieren, die sich in einer G eins oder einer G zwei M Phase befinden. Und dann führt man ein Microarray-Experiment mit Hefen durch, die sich in einer bestimmten Replikationsphase befinden.

Ein weiterer komplizierter Punkt, den wir in dieser Übung zu verdeutlichen versuchen, ist, dass die Leute jeden Tag über die Pelletierung von CD NA sprechen, aber es ist nicht unbedingt einfach. Und was wir in unserem Modul gemacht haben, ist, dass wir tatsächlich spezielle Röhren und Visualisierungsreagenzien verwendet haben. Wir können also tatsächlich die DNA ausspinnen, und man kann die Berufung visualisieren, was es für Schüler und Lehrer gleichermaßen einfacher macht.

Damit kann in allen Phasen der DNA- und RNA-Arbeit nach ihrer Entwicklung verwendet werden. Dieses Modul hat den Weg für die Dozenten an den Baccalaureate-Instituten geebnet, möglicherweise andere Modellorganismen oder andere Behandlungsschemata zu erforschen, die mit bestehenden Lehrplänen oder möglicherweise ihren eigenen Forschungsinteressen kompatibel sein könnten. Und um Ihnen ein Beispiel für einige der Modifikationen zu geben, die vorgenommen wurden, gab es eine Stelle, die sich mit den Auswirkungen der Herbizidbehandlung auf Hefe befasst hatte, oder eine andere, die sich mit der LAMP-IDE-Behandlung in Hefe befasste, während eine andere Seite sich mit den Entwicklungsveränderungen in einer Säugetierzelllinie befasste, an der sie besonders interessiert waren.

Und schließlich hatte sich eine andere Seite mit den Auswirkungen von differentiellen Lichtquellen auf Arabidopsis oder Pflanzen befasst. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Mikrostrahlenexperiment mit Studenten der Naturwissenschaften einrichten, einschließlich der Isolierung von Gesamt-RNA aus Hefe, der Erzeugung von CDNA und der Fragmentierung von Biotin-markiertem CRNA. Praktische Erfahrungen mit solchen Technologien auf hohem Niveau tragen dazu bei, die naturwissenschaftliche Ausbildung im Grundstudium zu verstärken und zu stärken.