Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

Ziel dieses Verfahrens ist es, Boten-RNA sichtbar zu machen, die mit dem endoplasmatischen Retikulum oder er assoziiert ist. Dies wird erreicht, indem zunächst Gewebekulturzellen von Säugetieren auf Deckgläser plattiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen mit Extraktionspuffer zu behandeln, um zytoplasmatische mRNA zu entfernen, die nicht an das er gebunden ist.

Die nächsten Schritte bestehen darin, die Zellen schnell zu fixieren und die mRNA durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zu färben. Die letzten Schritte bestehen darin, die mit dem er verbundene Fluoreszenzmenge abzubilden und dann zu quantifizieren. Letztendlich können die Ergebnisse zeigen, wie mRNAs unter verschiedenen Bedingungen mit der Oberfläche dieser Organelle assoziiert sind.

Diese Methode kann helfen, wichtige zellbiologische Fragen zu beantworten, z. B. ob mRNAs, die sekretorische Proteine kodieren, unabhängig von Ribosomen oder Proteinsynthese auf der Oberfläche des ers gehalten werden können. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da sie einige knifflige Schritte zur zellulären Manipulation erfordert. Die Aussaat der Gewebekulturzellen auf säurebehandelten Deckgläsern für mindestens einen Tag vor dem Experiment kostet sieben und aufgrund des OS sind Zellen beide geeignete Optionen, da sie eine hohe sezernierte Proteinproduktion und gut definierte ERs aufweisen.

Wenn ein exogener Mr NA untersucht wird, transfizieren Sie die Zellen einen Tag nach der Aussaat und inkubieren Sie die Zellen dann für weitere 18 Stunden, um eine MRT zu ermöglichen. NA-Ausdruck. Am Tag des Experiments. Um eine hohe Extraktionseffizienz zu erreichen, sollten die Zellen eine Fluenz von 80 % Co auf dem Deckglas nicht überschreiten, um zu erkennen, ob mRNAs unabhängig von der Translation mit dem ER interagieren. Zellen können mit Wirkstoffen behandelt werden, die die Interaktion zwischen Ribosomen und mRNA stören, bei diesen Wirkstoffen oder Kontrollmedien zu den Zellen 30 Minuten vor der Extraktion.

In diesem Fall werden translationale Inhibitoren, reines Mycin und Homo Harrington in oder HHT verwendet. Beginnen Sie mit dem Erwärmen einer frisch zubereiteten Extraktionslösung, die Dig Tonin und einen Arbeitspuffer von einem XCHO enthält, auf 37 Grad Celsius. Stellen Sie einen Heizblock auf 40 Grad Celsius ein und setzen Sie einen umgedrehten Metallblock ein, um eine ebene Arbeitsfläche zu bilden.

Befeuchten Sie den Metallblock mit Wasser, beschichten Sie ihn dann mit einem frischen Stück Paraform und glätten Sie alle Blasen mit RNAs-freien Handschuhen und fusselfreien Taschentüchern. Bereiten Sie als Nächstes für jedes Paar Deckgläser eine Platte mit sechs Vertiefungen vor, um die Zellen zu waschen und an vier Vertiefungen zu befestigen. Geben Sie zwei Milliliter erwärmten CHO-Puffer in die letzten beiden Vertiefungen.

Fügen Sie zwei Milliliter der Fixierlösung hinzu. Lagern Sie die Platte dann bis zur Verwendung bei 37 Grad Celsius. Geben Sie auf den Heizblock einen Tropfen 100 Mikroliter der Extraktionslösung für jeden Deckglas der zu verarbeitenden Zellen.

Nehmen Sie nun mit einer Juwelierzange einen mit Zellen beschichteten Deckzettel auf und tauchen Sie ihn in die erste und zweite Vertiefung mit dem CHO-Puffer. Dadurch wird das Wachstumsmedium abgewaschen. Tragen Sie dann schnell den überschüssigen Puffer von der Rückseite des Deckglases ab.

Und legen Sie die Deckschicht mit der Zellenseite nach unten kurz auf die Extraktionslösung. Übertragen Sie nach 10 Sekunden die Deckglaszellenseite nach oben in den Fixierungspuffer, wo sie mindestens 15 Minuten verbleiben sollte. Der Schritt der Zellextraktion ist unerlässlich, um alle cyop-plastische mRNA zu entfernen, die nicht ER-gebunden ist.

Bereiten Sie zusätzlich einen Kontrolldeckzettel vor, auf dem die Zellen ohne Extraktion fixiert sind. Schritt nach der Fixierung. Waschen Sie diese nicht ex-extrahierten Kontrollzellen zweimal mit PBS und permease Sie dann in PBS und TRITTON X 100.

Obwohl es nicht erforderlich ist, sollte das Eingraben extrahierter Zellen auch mit der gleichen PBS- und Triton-Lösung gewaschen werden, um die Hintergrundfluoreszenz nach dem Durchdringen der Zellen zu reduzieren. Waschen Sie die Rutschen zweimal mit PBS, um das Fixiermittel und das Reinigungsmittel zu entfernen. Waschen Sie die Objektträger anschließend zweimal mit 60%fide in einmaligem Natriumcitratpuffer oder SSC.

Wenn jedoch eine Oligo-DT-Fischsonde verwendet wird, um alle Zellen zu färben, reduziert Poly-mRNA den Fide-Gehalt auf 25 %Als nächstes bereiten Sie den Hybridisierungspuffer mit der Fischsonde vor. Verdünnen Sie die Stammfischsonde auf 0,2 Mikromolar in der gleichen Konzentration von fide im Hybridisierungspuffer. Bereiten Sie nun die Färbekammer vor.

Füllen Sie den Boden einer 150 Millimeter großen Petrischale mit Wasser. Lassen Sie dann ein Stück Paraform auf dem Wasser schwimmen und drehen Sie die Schale auf den Kopf. Die Para-Folie haftet am Boden der Schale, wenn das Wasser entweicht.

Wenn Luftblasen vorhanden sind, entfernen Sie diese mit Handschuhen und fusselfreien Tüchern für jedes Deckblatt und schieben Sie 100 Mikroliter der Hybridisierungslösung, die den Fisch enthält, auf die Para-Folie. Legen Sie nun die Deckschicht mit der Zellseite nach unten auf die Lösung. Zum Schluss inkubieren Sie die Kammer fünf bis 24 Stunden lang in einer warmen, befeuchteten Kammer.

Bevor die Zeit zum Färben der Fische abgelaufen ist, bereiten Sie einen RNAs-freien Waschbereich vor, befeuchten Sie die ebene Fläche mit Wasser und bedecken Sie ihn mit Paramstreifen. Entfernen Sie alle Luftblasen mit Handschuhen und leinenfreien Taschentüchern. Wenn die Färbung abgeschlossen ist, übertragen Sie die Kammer in den Arbeitsbereich für jeden Deckzettel Pipettieren Sie einen Milliliter Waschpuffer auf den Waschbereich.

Para-Folie zum Übertragen der Deckgläser Zuerst einen halben Milliliter Fischwaschpuffer in der Nähe des Randes jedes Deckglases pipettieren. Die Flüssigkeit wird durch Kapillarwirkung unter den Deckglas gezogen. Entfernen Sie anschließend mit einer Pinzette die Deckgläser aus der Kammer und legen Sie sie auf die Tropfen des Waschpuffers.

Und warten Sie fünf Minuten. Wiederholen Sie diese Waschtechnik noch dreimal. Verwenden Sie frische 1-Milliliter-Tropfen Waschpuffer auf der Waschstelle.

In der Zwischenzeit die Objektträger mit 70 % Ethanol reinigen und mit fusselfreien Tüchern trocknen. Tragen Sie dann für jeden Deckglas 25 Mikroliter DPI-Eindecklösung auf einen Objektträger auf. Nehmen Sie mit einer Pinzette einen Deckglas auf und trocknen Sie die Rückseite mit einem fusselfreien Tuch, um überschüssigen Waschpuffer zu entfernen. Übertragen Sie dann die Abdeckung mit der Seite der Zelle nach unten auf den Tropfen der Montagelösung.

Die fertigen Dias können bis zur Bebilderung bei vier Grad Celsius gelagert werden. Sieben Zellen, die mit Plasmiden transfiziert wurden, die plazentare alkalische Phosphatase oder Cytochrom P 4 58 B enthielten, von denen eine entweder mit Tonin extrahiert und dann fixiert oder direkt fixiert wurde, um den Prozentsatz dieser mRNA zu bestimmen, der ER-assoziiert ist. Die nicht-nukleäre Fluoreszenz wurde in beiden Proben quantifiziert und der Anteil der ER-assoziierten mRNA für beide mRNAs berechnet.

Etwa 60% der zytoplasmatischen Fraktion wurden mit dem ER assoziiert, um die ER-Assoziation dieser Transkripte zu überwachen. Nach der transfizierten Ribosomendissoziation wurden sieben Zellen mit Kontrollmedien, reinem MYCIN oder HHT, behandelt und anschließend Tonin und fixierte mRNA extrahiert. Die Färbung zeigte, dass die A-LPP-, nicht aber die CYP-8-P-Eins-mRNA nach der Ribosomenstörung mit der ER assoziiert blieb.

Die mRNA-Quantifizierung unterstützte diese Beobachtung und zeigte vor allem, dass der Gehalt an nukleärer mRNA in allen Proben konsistent war. Diese Daten zeigen, dass eine Untergruppe von ER-gerichteten mRNAs, wie z. B. das A-LPP-Transkript, nach der Ribosomenzerlegung auf der Oberfläche des ER verbleibt. Mit diesem Protokoll können wir beginnen zu untersuchen, wie verschiedene mRNAs in unterschiedlichen subzellulären Kompartimenten wie dem endoplasmatischen Fadenkreuz lokalisiert sind, wenn sie mit anderen Assays kombiniert werden, die zur Analyse des mRNA-Kernexports verwendet werden.

Dieses Verfahren kann verwendet werden, um das anfängliche Targeting von neu synthetisierten mRNAs auf die Oberfläche des ers zu untersuchen.