Eine einfache und effiziente Methode, um Nuclear Factor Aktivierung in menschlichen Neutrophilen Erkennen von Durchflusszytometrie
April 9th, 2013
Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im Blut. Neutrophile besitzen transkriptionell reguliert Funktionen wie Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen und Hemmung der Apoptose. Diese Funktionen können mit dem hier vorgestellten Verfahren, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren können mittels Durchflusszytometrie in isolierten Zellkernen untersucht werden
Dieses Experiment verwendet die Durchflusszytometrie zum Nachweis und zur Quantifizierung von Kernproteinen in isolierten und immunmarkierten Zellkernen von Neutrophilen, um die Neutrophilen aus dem peripheren Blut des Menschen zu reinigen. Entfernen Sie die roten Blutkörperchen mit Dextrin, gefolgt von einer Dichtegradientenzentrifugation des Plasmas. Stimulieren Sie dann mit Antirezeptor-Antikörpern die gereinigten Neutrophilen über Integrine oder FC-Rezeptoren.
Fahren Sie mit der Isolierung der Zellkerne fort und fixieren Sie die Proben für die Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern gegen den interessierenden NU-Kernfaktor. Zum Beispiel analysiert NF kappa B schließlich die Zellkerne mittels Durchflusszytometrie, um kleine Veränderungen in der Aktivierung des Kernfaktors zu erkennen. Es werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass die Stimulation von Neutrophilen über ihre Integrine zu einer Erhöhung der Kernkonzentration des Transkriptionsfaktors N von Kappa B führt. Signalwege, die zur Aktivierung des Kernfaktors führen, werden in der Regel durch Reportergen-Assays oder durch elektrophoretische Mobilitätsverschiebungs-Assays in Primärzellen untersucht.
Oft sind diese Methoden nicht geeignet. Die Durchflusszytometrie ermöglicht den schnellen Nachweis und die Quantifizierung von Kernproteinen in isolierten Zellkernen. Beginnen Sie mit 10 Millilitern frisch entnommenem Blut von gesunden erwachsenen Freiwilligen.
Pipettieren Sie zwei Milliliter 6%ige Dextrin T 500-Lösung in ein konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie dann 10 Milliliter Blut hinzu, indem Sie das Röhrchen zwei- oder dreimal umdrehen, und lassen Sie 45 Minuten lang die Erythrozytensedimentation durch die Schwerkraft in einem frischen konischen 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen einwirken. Legen Sie fünf Milliliter FI fial pack.
Entnehmen Sie das leukozytenreiche Plasma, das sich über den sedimentierten Erythrozyten gebildet hat. Schichten Sie es vorsichtig auf die Fial-Packung, um zwei Phasen zu bilden, zentrifugieren Sie es 20 Minuten lang bei 516 g bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und brechen Sie das Küvettenpellet, indem Sie das Rohr gegen das Gestell klopfen.
Dann resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern kaltem PBS. Die Zellsuspension wird in ein konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 290 g zentrifugiert. Brechen Sie das Zellpellet wie zuvor auf und geben Sie 10 Milliliter kalte hypotone Lösung zu den Erythrozyten
.Mischen Sie, indem Sie die Tube genau eine Minute lang vorsichtig schwenken. Als nächstes 10 Milliliter kalte hypertonische Lösungsmischung hinzufügen und auf Eis lagern. Zählen Sie nun die Zellen auf, nachdem Sie die Neutrophilen durch Zentrifugation pelletiert haben.
Wir suspendieren das PMN bei 10 bis sieben Zellen pro Milliliter. Bei kaltem PBS halten Sie die Zellen auf Eis. Aliquotieren Sie 100 Mikroliter PMN-Suspension in 1,5-Milliliter-Einorröhrchen.
Dann den entsprechenden monoklonalen Antikörper mit 10 Mikrogramm pro Milliliter zugeben und 15 Minuten auf Eis inkubieren. Um die Zellen zu waschen, fügen Sie einen Milliliter kalte PBS-Zentrifuge hinzu und aspirieren Sie den Überstand. Brechen Sie dann das Zellpellet vorsichtig auf und waschen Sie es noch zweimal mit PBS.
Um ungebundene Antikörper zu entfernen, suspendieren Sie das gewaschene PMN erneut in demselben Anfangsvolumen von warmem PBS, das 60 Mikrogramm pro Milliliter go anti muse IgG enthält, inkubieren Sie je nach interessierendem Kernfaktor eine bis 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie nun einen Milliliter kaltes PBS hinzu Nach dem Pelletieren der Zellen durch Zentrifugation entfernen Sie die Snat und frieren die Zellpellets sofort in einem Trockeneis-Ethanolbad ein. Entfernen Sie für jede Probe das Röhrchen aus dem Trockeneisset, dem Ethanolbad, dem Wischtuch und der Wiederbelebung.
Suspendieren Sie die gefrorenen PMN-Pellets in 100 Mikrolitern kalter hypotonischer Lösung. Legen Sie alle Proben auf Eis, um die Unversehrtheit der Proben zu überwachen. Färben Sie ein Eloqua der Zellkernsuspension mit Trianblau.
Wenn die Zellkernsuspension viele intakte Zellen oder Trümmer enthält, ist es besser, das Präparat zu verwerfen und das Verfahren mit einer anderen Probe zu beginnen. Nach dem Pelletieren der Kerne durch Zentrifugation entfernen Sie den Überstand sehr vorsichtig, um die Kerne bei 100 Mikrolitern kalter, 4%iger Paraform-Aldehydlösung zu fixieren und die Kerne auf Eis zu inkubieren. Nach dem Pelletieren der Zellkerne die Schlinge bei 100 Mikrolitern Kaltpermeationspuffer vorsichtig entfernen und die Proben 10 Minuten lang auf Eis inkubieren.
Anschließend werden die Perme-Kerne durch Zentrifugation entnommen. Zu diesem Zeitpunkt haften die Kernkügelchen nicht gut am Boden des Röhrchens. Es wird empfohlen, die Zukunft wieder zu zentrieren.
Wenn sich das Pellet löst Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, suspendieren wir die Zellkerne in 500 Mikrolitern kaltem, 4%igem fötalem Rinderserum in PBS und inkubieren 20 Minuten lang auf Eis. Pelletieren Sie die Zellkerne durch Zentrifugation und resuspendieren Sie dann die Zellkerne und 100 Mikroliter kaltes PBS mit 4 % FBS und 2,5 Mikrogramm pro Milliliter des monoklonalen Antikörpers gegen den interessierenden Kernfaktor. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten lang auf Eis, nachdem Sie die Proben zweimal mit 500 Mikrolitern kaltem PBS mit 4 % FBS gewaschen haben, wir suspendieren die Zellkerne in 100 Mikrolitern kaltem PBS mit 4 % FBS und 10 Mikrogramm Milliliter des entsprechenden FZ-markierten Sekundärantikörpers, inkubieren nach zwei Wäschen 20 Minuten lang auf Eis, suspendieren Sie die Kerne erneut in 400 Mikrolitern kaltem 4 % Paraldehyd in PBS.
Analysieren Sie die immunmarkierten Zellkerne in einem Durchflusszytometer, z. B. einem Faktenscan oder einem ähnlichen Gerät. Passen Sie die Aufnahmeeinstellungen an: zwei FSC auf logarithmischer Skala bei 10 auf den negativen SSC auf logarithmischen Maßstab bei 196 und Gate-Kerne im Adopt-Plot. Erfassen Sie 10.000 Kerne pro Probe.
Analysieren Sie dann die Fluoreszenz von Fitsy-Färbekeimen durch den FL-Einkanal, der auf eine logarithmische Skala bei 400 eingestellt ist. Diese PMN-Aufreinigungsmethode liefert in der Regel unstimulierte Neutrophile mit einer Reinheit von mehr als 95% aus PMN-Kernen, die mit hohen Ausbeuten isoliert werden, isoliert zu Zellkernen, die im Durchflusszytometer mit einem Punktdiagramm bei der Stimulation leicht als eine andere Population als intaktes PMN identifiziert werden können. Durch die Vernetzung von Beta-1-Integrinen wird NF kappa B in den Zellkern translatiert und dieses Zuwachs an nukleärem NF kappa B wird als Zunahme der Fluoreszenz nachgewiesen.
In ähnlicher Weise induziert die Stimulation von PMN durch Vernetzung von Beta-2-Integrinen auch die Aktivierung von NF kappa B, was durch eine Erhöhung der Fluoreszenz angezeigt wird. Die Sensitivität dieser Methode ermöglicht den Nachweis kleiner Veränderungen der Kernfaktorspiegel, was durch die Tatsache belegt wird, dass Beta-1-Integrine, die extrazelluläre Matrixproteine wie Fibronektin binden, eine stärkere NF-Kappa-B-Aktivierung induzieren als Beta-2-Integrine, die an Adhäsionsmoleküle auf anderen Zellen binden. Diese Methode bietet eine große Flexibilität, da viele verschiedene Fluorochrome verwendet werden können und da sie die Präparation von Zellkernen aus verschiedenen Zelltypen ermöglicht. Dieser einfache und kostengünstige Ansatz wird für Signaltransduktionsstudien verwendet, bei denen sich die Proteinspiegel im Zellkern einer Vielzahl von Zelltypen ändern.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur Erkennung und Quantifizierung von nuklearen Proteinen in Neutrophilen mittels Durchflusszytometrie vor. Der Ansatz ermöglicht es Forschern, die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren, wie NF Kappa B, in isolierten Zellkernen zu analysieren.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Immunologie
- Zellbiologie
- Durchflusszytometrie
Hintergrund
- Neutrophile sind die häufigste Art von Leukozyten im Blut.
- Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort durch die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen.
- Das Verständnis ihrer nuklearen Funktionen ist wesentlich für Einblicke in die Immunregulation.
- Die Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Analyse zellulärer Komponenten.
Zweck der Studie
- Neutrophile aus menschlichem peripherem Blut zu reinigen.
- Die Aktivierung von nuklearen Faktoren als Reaktion auf Stimulation zu untersuchen.
- Eine detaillierte Methodik zur Quantifizierung nuklearer Proteinspiegel bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut mittels Dextrin und Dichtegradientenzentrifugation.
- Stimulation von Neutrophilen mit Anti-Rezeptor-Antikörpern, die auf Integrine oder FC-Rezeptoren abzielen.
- Isolierung und Fixierung von Zellkernen für die Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern.
- Analyse der Zellkerne mittels Durchflusszytometrie zur Erkennung von Veränderungen in der nuklearen Faktoraktivierung.
Hauptergebnisse
- Die Stimulation von Neutrophilen über Integrine führt zu einer erhöhten nuklearen Konzentration von NF Kappa B.
- Die Durchflusszytometrie erkennt effektiv kleine Veränderungen in der nuklearen Faktoraktivierung.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis von Signalwegen in Neutrophilen bei.
- Die Methodik kann angewendet werden, um verschiedene nukleare Faktoren in primären Zellen zu untersuchen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen zuverlässigen Ansatz zur Untersuchung der nuklearen Faktoraktivierung in Neutrophilen.
- Die Durchflusszytometrie ist eine wertvolle Technik zur Analyse von Immunzellfunktionen.
- Weitere Forschung kann zusätzliche Signalwege und deren Auswirkungen untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Detecting nuclear factor activation in primary human neutrophils enables mechanistic de-risking of inflammatory signaling pathways in drug discovery. This flow cytometry-based method provides quantitative, reproducible readouts of transcription factor dynamics, supporting target validation and assay development in immunology-focused programs. By overcoming transfection limitations in short-lived primary cells, it offers a scalable solution for early-stage biomarker alignment and predictive confidence in lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of NF-κB and Elk-1 activation in primary human neutrophils to clarify proinflammatory signaling mechanisms.
- Operational Value: Provides a transfection-independent method for studying transcriptionally regulated responses in difficult-to-transduce primary immune cells.
- Predictive Value: Supports functional target validation by linking receptor stimulation (e.g., integrins, Fc receptors) to nuclear translocation of key inflammatory mediators.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates isolated, immunolabeled neutrophil nuclei suitable for high-throughput flow cytometric screening of modulators of nuclear factor activation.
- Quantitative Output: Enables detection of small changes in nuclear protein concentration, facilitating dose-response and IC50 determination in compound screening.
- Reproducibility: Standardized neutrophil isolation and nuclear preparation workflows yield consistent fluorescence readouts across replicates and donors.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to studying neutrophil-driven inflammatory pathways in models of infection, autoimmunity, and tissue injury.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanism elucidation with preclinical validation by providing a primary human cell-based readout of target engagement.
- Mechanistic De-risking: Reduces reliance on surrogate systems by enabling direct measurement of transcription factor activation in the therapeutically relevant cell type.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in immunology and enabling progression from target engagement assays to functional validation in primary human neutrophils before lead optimization.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by quantifying nuclear translocation of transcription factors downstream of receptor stimulation (e.g., β1/β2 integrins, Fc receptors).
- Screening: Delivers assay-ready nuclei with quantitative fluorescence outputs suitable for screening compound libraries for modulators of NF-κB or Elk-1 activation.
- Analytics: Provides single-nucleus resolution and fluorescence intensity measurements enabling statistical comparison of stimulated vs. basal conditions.
- Translational Research: Uses primary human neutrophils to enhance clinical relevance of mechanistic findings, supporting biomarker alignment in inflammatory disease models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple nuclear factors and fluorophores, allowing reuse across projects targeting different signaling pathways in neutrophils or other primary cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing direct, quantitative evidence of nuclear factor activation in primary human immune cells.
- Operational Value: Delivers a standardized, scalable workflow for neutrophil isolation, nuclear preparation, and flow cytometric analysis with minimal specialized equipment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in early-stage immunomodulator programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on target pathway modulation in a disease-relevant primary cell system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human blood processing, neutrophil isolation, and flow cytometry compensation and gating.
- Dependent on access to flow cytometers capable of fluorescence detection in the appropriate channels (e.g., FL1 for FITC-labeled antibodies).
- Necessitates standardization of stimulation conditions, antibody titers, and nuclear fixation/permeabilization protocols across users and sites.
- Adaptation to other cell types requires optimization of hypotonic/hypertonic lysis conditions and validation of nuclear integrity.
- Practical limitations include neutrophil donor variability and the short ex vivo lifespan of primary neutrophils, necessitating same-day experimentation.
