Eine einfache und effiziente Methode, um Nuclear Factor Aktivierung in menschlichen Neutrophilen Erkennen von Durchflusszytometrie

Dieses Experiment verwendet die Durchflusszytometrie zum Nachweis und zur Quantifizierung von Kernproteinen in isolierten und immunmarkierten Zellkernen von Neutrophilen, um die Neutrophilen aus dem peripheren Blut des Menschen zu reinigen. Entfernen Sie die roten Blutkörperchen mit Dextrin, gefolgt von einer Dichtegradientenzentrifugation des Plasmas. Stimulieren Sie dann mit Antirezeptor-Antikörpern die gereinigten Neutrophilen über Integrine oder FC-Rezeptoren.

Fahren Sie mit der Isolierung der Zellkerne fort und fixieren Sie die Proben für die Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern gegen den interessierenden NU-Kernfaktor. Zum Beispiel analysiert NF kappa B schließlich die Zellkerne mittels Durchflusszytometrie, um kleine Veränderungen in der Aktivierung des Kernfaktors zu erkennen. Es werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass die Stimulation von Neutrophilen über ihre Integrine zu einer Erhöhung der Kernkonzentration des Transkriptionsfaktors N von Kappa B führt. Signalwege, die zur Aktivierung des Kernfaktors führen, werden in der Regel durch Reportergen-Assays oder durch elektrophoretische Mobilitätsverschiebungs-Assays in Primärzellen untersucht.

Oft sind diese Methoden nicht geeignet. Die Durchflusszytometrie ermöglicht den schnellen Nachweis und die Quantifizierung von Kernproteinen in isolierten Zellkernen. Beginnen Sie mit 10 Millilitern frisch entnommenem Blut von gesunden erwachsenen Freiwilligen.

Pipettieren Sie zwei Milliliter 6%ige Dextrin T 500-Lösung in ein konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie dann 10 Milliliter Blut hinzu, indem Sie das Röhrchen zwei- oder dreimal umdrehen, und lassen Sie 45 Minuten lang die Erythrozytensedimentation durch die Schwerkraft in einem frischen konischen 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen einwirken. Legen Sie fünf Milliliter FI fial pack.

Entnehmen Sie das leukozytenreiche Plasma, das sich über den sedimentierten Erythrozyten gebildet hat. Schichten Sie es vorsichtig auf die Fial-Packung, um zwei Phasen zu bilden, zentrifugieren Sie es 20 Minuten lang bei 516 g bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und brechen Sie das Küvettenpellet, indem Sie das Rohr gegen das Gestell klopfen.

Dann resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern kaltem PBS. Die Zellsuspension wird in ein konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 290 g zentrifugiert. Brechen Sie das Zellpellet wie zuvor auf und geben Sie 10 Milliliter kalte hypotone Lösung zu den Erythrozyten

Mischen Sie, indem Sie die Tube genau eine Minute lang vorsichtig schwenken. Als nächstes 10 Milliliter kalte hypertonische Lösungsmischung hinzufügen und auf Eis lagern. Zählen Sie nun die Zellen auf, nachdem Sie die Neutrophilen durch Zentrifugation pelletiert haben.

Wir suspendieren das PMN bei 10 bis sieben Zellen pro Milliliter. Bei kaltem PBS halten Sie die Zellen auf Eis. Aliquotieren Sie 100 Mikroliter PMN-Suspension in 1,5-Milliliter-Einorröhrchen.

Dann den entsprechenden monoklonalen Antikörper mit 10 Mikrogramm pro Milliliter zugeben und 15 Minuten auf Eis inkubieren. Um die Zellen zu waschen, fügen Sie einen Milliliter kalte PBS-Zentrifuge hinzu und aspirieren Sie den Überstand. Brechen Sie dann das Zellpellet vorsichtig auf und waschen Sie es noch zweimal mit PBS.

Um ungebundene Antikörper zu entfernen, suspendieren Sie das gewaschene PMN erneut in demselben Anfangsvolumen von warmem PBS, das 60 Mikrogramm pro Milliliter go anti muse IgG enthält, inkubieren Sie je nach interessierendem Kernfaktor eine bis 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie nun einen Milliliter kaltes PBS hinzu Nach dem Pelletieren der Zellen durch Zentrifugation entfernen Sie die Snat und frieren die Zellpellets sofort in einem Trockeneis-Ethanolbad ein. Entfernen Sie für jede Probe das Röhrchen aus dem Trockeneisset, dem Ethanolbad, dem Wischtuch und der Wiederbelebung.

Suspendieren Sie die gefrorenen PMN-Pellets in 100 Mikrolitern kalter hypotonischer Lösung. Legen Sie alle Proben auf Eis, um die Unversehrtheit der Proben zu überwachen. Färben Sie ein Eloqua der Zellkernsuspension mit Trianblau.

Wenn die Zellkernsuspension viele intakte Zellen oder Trümmer enthält, ist es besser, das Präparat zu verwerfen und das Verfahren mit einer anderen Probe zu beginnen. Nach dem Pelletieren der Kerne durch Zentrifugation entfernen Sie den Überstand sehr vorsichtig, um die Kerne bei 100 Mikrolitern kalter, 4%iger Paraform-Aldehydlösung zu fixieren und die Kerne auf Eis zu inkubieren. Nach dem Pelletieren der Zellkerne die Schlinge bei 100 Mikrolitern Kaltpermeationspuffer vorsichtig entfernen und die Proben 10 Minuten lang auf Eis inkubieren.

Anschließend werden die Perme-Kerne durch Zentrifugation entnommen. Zu diesem Zeitpunkt haften die Kernkügelchen nicht gut am Boden des Röhrchens. Es wird empfohlen, die Zukunft wieder zu zentrieren.

Wenn sich das Pellet löst Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, suspendieren wir die Zellkerne in 500 Mikrolitern kaltem, 4%igem fötalem Rinderserum in PBS und inkubieren 20 Minuten lang auf Eis. Pelletieren Sie die Zellkerne durch Zentrifugation und resuspendieren Sie dann die Zellkerne und 100 Mikroliter kaltes PBS mit 4 % FBS und 2,5 Mikrogramm pro Milliliter des monoklonalen Antikörpers gegen den interessierenden Kernfaktor. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten lang auf Eis, nachdem Sie die Proben zweimal mit 500 Mikrolitern kaltem PBS mit 4 % FBS gewaschen haben, wir suspendieren die Zellkerne in 100 Mikrolitern kaltem PBS mit 4 % FBS und 10 Mikrogramm Milliliter des entsprechenden FZ-markierten Sekundärantikörpers, inkubieren nach zwei Wäschen 20 Minuten lang auf Eis, suspendieren Sie die Kerne erneut in 400 Mikrolitern kaltem 4 % Paraldehyd in PBS.

Analysieren Sie die immunmarkierten Zellkerne in einem Durchflusszytometer, z. B. einem Faktenscan oder einem ähnlichen Gerät. Passen Sie die Aufnahmeeinstellungen an: zwei FSC auf logarithmischer Skala bei 10 auf den negativen SSC auf logarithmischen Maßstab bei 196 und Gate-Kerne im Adopt-Plot. Erfassen Sie 10.000 Kerne pro Probe.

Analysieren Sie dann die Fluoreszenz von Fitsy-Färbekeimen durch den FL-Einkanal, der auf eine logarithmische Skala bei 400 eingestellt ist. Diese PMN-Aufreinigungsmethode liefert in der Regel unstimulierte Neutrophile mit einer Reinheit von mehr als 95% aus PMN-Kernen, die mit hohen Ausbeuten isoliert werden, isoliert zu Zellkernen, die im Durchflusszytometer mit einem Punktdiagramm bei der Stimulation leicht als eine andere Population als intaktes PMN identifiziert werden können. Durch die Vernetzung von Beta-1-Integrinen wird NF kappa B in den Zellkern translatiert und dieses Zuwachs an nukleärem NF kappa B wird als Zunahme der Fluoreszenz nachgewiesen.

In ähnlicher Weise induziert die Stimulation von PMN durch Vernetzung von Beta-2-Integrinen auch die Aktivierung von NF kappa B, was durch eine Erhöhung der Fluoreszenz angezeigt wird. Die Sensitivität dieser Methode ermöglicht den Nachweis kleiner Veränderungen der Kernfaktorspiegel, was durch die Tatsache belegt wird, dass Beta-1-Integrine, die extrazelluläre Matrixproteine wie Fibronektin binden, eine stärkere NF-Kappa-B-Aktivierung induzieren als Beta-2-Integrine, die an Adhäsionsmoleküle auf anderen Zellen binden. Diese Methode bietet eine große Flexibilität, da viele verschiedene Fluorochrome verwendet werden können und da sie die Präparation von Zellkernen aus verschiedenen Zelltypen ermöglicht. Dieser einfache und kostengünstige Ansatz wird für Signaltransduktionsstudien verwendet, bei denen sich die Proteinspiegel im Zellkern einer Vielzahl von Zelltypen ändern.