Name: Eine einfache und effiziente Methode, um Nuclear Factor Aktivierung in menschlichen Neutrophilen Erkennen von Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Quantifizierung nukleärer Proteine in menschlichen Neutrophilen mittels Durchflusszytometrie. Diese Technik ermöglicht die Analyse der NF-kappa-B-Aktivierung in isolierten Zellkernen.

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Die Autoren bedanken sich bei Nancy Mora für ihre technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde durch Forschungsgelder 48.573-M und 168098 vom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Mexiko und durch Zuschüsse IN212308 und IN205311-2 von Dirección General de Asuntos del Personal Academico, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Mexico finanziert.

Ein. Isolation von Neutrophilen (PMN) aus menschlichem Blut <ol><li> Verwenden etwa 20 ml Humanblut mit Heparin (10 U / ml) als Antikoagulans. Blut wurde von gesunden erwachsenen Freiwilligen durch intravenösen gesammelt. UNAM - Alle Experimente wurden unter Zustimmung des Bioethik-Ausschusses am Instituto de Investigaciones Biomédicas getan. </li><li> Geben Sie 2 ml 6% Dextran T500 in PBS in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen und 10 ml Blut. Mix durch Invertieren des Röhrchens zwei oder drei Mal und lassen Sie es für 45 Minuten sitzen, um für Blutsenkungsgeschwindigkeit ermöglichen. </li><li> In einem frischen 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen legte 5 ml Ficoll-Paque. </li><li> Nehmen Sie die Leukozyten-reiche Plasma, das über sedimentiert Erythrozyten gebildet und sorgfältige Pipettierung es oben auf der Ficoll-Paque Bildung einer zweiten Schicht. Stellen Sie sicher, gibt es zwei Phasen. </li><li> Zentrifuge bei 516 × g für 20 min bei 4 ° C. Nach der Zentrifugation an der Interphase von Plasma und Ficoll-Paque befindet sich eine Schicht von mononukleären Zellen. Neutrophils sind am Boden des Röhrchens. </li><li> Beseitigen Sie den Überstand, brechen das Zellpellet indem das Rohr gegen ein Rack und die Zellen resuspendieren durch Zugabe von 10 ml kaltem (4 ° C) PBS. Hinweis: Resuspendieren der Zellen durch Auf-und Abpipettieren wird nicht empfohlen, da dies zu schädlich für die Zellen. </li><li> Übertragen der Zellsuspension in ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 290 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Brechen Sie das Zellpellet nach wie vor und mit 10 ml kaltem (4 ° C) hypotone Lösung (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4), um Erythrozyten zu lysieren. Mix durch Verwirbelung das Rohr vorsichtig von Hand genau eine Minute. </li><li> 10 ml kaltem (4 ° C) hypertonischen Lösung (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4), mischen und zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometer (in der Regel&gt; 95% PMN). Hinweis: Bewahren Sie den Schlauch mit der Zellsuspension auf Eis beim Zählen der Zellen. </li><li> Zentrifuge nach vor und resuspendieren PMN bei 107 Zellen / ml in kaltem (4 ° C) PBS. Halten Sie auf dem Eis. Hinweis: Neutrophile lebensfähig bleiben und funktionelle bei 4 ° C für etwa 6 bis 8 Stunden. </li></ol> 2. Aktivieren PMN <ol><li> Legen Sie 100 ul PMN Suspension (1 x 10 7 Zellen / ml) in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Hinweis: Probengefäss sollte mindestens in Doppelbestimmung durchgeführt werden. Übliche negative Kontrollen sollten erste Antikörper nur, und sekundären Antikörper nur die. </li><li> Fügen Sie die entsprechenden Anti-Integrin oder anti-Fc-Rezeptor monoklonaler Antikörper (mAb) mit 10 ug / ml und Inkubation auf Eis für 15 min. </li><li> Waschen PMN durch Zugabe von 1 ml kaltem (4 ° C) PBS, Zentrifugation bei 1.743 xg (4.500 rpm) in einer Mikrozentrifuge und Absaugen des Überstandes. </li><li> Brechen Sie das Zellpellet durch Antippen der Unterseite des Rohrs gegen ein Rack, 1 ml kaltem PBS, und waschen Sie noch zwei weitere Male, wie im vorherigen Schritt. Hinweis: Diese wäscht Entfernung ungebundener Antikörper. </li><li> Resuspendieren PMN in der gleichen (initial) Volumen von warmem (37 ° C) PBS, enthaltend 60 ug / ml F (ab &#39;) 2 Ziegen anti-Maus-IgG. Anmerkung: Die sekundären anti-Maus-IgG-Antikörper wird an den ersten anti-Rezeptor-Antikörper zu binden und Vernetzung des Rezeptors verursachen. </li><li> Bei 37 ° C während 1 bis 20 min, je nach Kernfaktor von Interesse. Für NF-KB üblicherweise 15 min und für Elk-1 üblicherweise 5 min. Hinweis: Die Inkubation der Zellen bei 37 ° C induziert Rezeptor-Vernetzung, die nicht stattfinden kann bei 4 ° C. </li><li> 1 ml kaltem PBS und zentrifugieren 3 min bei 1.743 xg in Mikrozentrifuge. </li><li> Überstand entfernen </li><li> Frieren PMN sofort dry-ice/ethanol Bad und halten sie dort für 10 min. </li></ol> 3. Isolation und Fixierung der Kerne <ol><li> Resuspendieren gefrorenen PMN Pellet in 100 ul kaltem (4 ° C) hypotonischen Puffer (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, und 1 mM frisch-added DL-Dithiothreitol [DTT], PH = 7,9). Es wird empfohlen, die Rohre nehmen aus dem dry-ice/ethanol Bad eins nach dem anderen, und Wischen Sie die Unterseite des Rohres vor der Zugabe der hypotonen Puffer. </li><li> Auf Eis, und überprüfen Kerne Integrität durch Färbung einen aliquoten Teil der Kerne Suspension mit Trypanblau. Kerne umsehen und blau. PMN intakten nicht angefärbt, erhalten und Zelltrümmer erscheint als blaue Teilchen von unregelmäßiger Form. Hinweis: Wenn Kerne Suspension enthält viele intakte Zellen oder Schmutz, ist es besser, die Vorbereitung zu verwerfen und wiederholen Sie den Vorgang mit einer anderen Probe. </li><li> Zentrifuge Kerne bei 775 xg (3.000 rpm) in Mikrozentrifuge für 10 min in einem kalten Raum. An diesem Punkt Kerne sehr zerbrechlich und besondere Sorgfalt sollte im Einklang die Proben kalt und nicht Zentrifugieren bei übermäßigen Kräften getroffen werden. </li><li> Überstand entfernen, indem Sie sehr vorsichtig Pipettieren. </li><li> Je 100 ul kaltem 4% Paraformaldehyd in PBS auf Kerne zu fixieren. Hinweis: Das Pellet wird sehr locker eind Zugabe des Puffers ausreicht, um die Kerne zu resuspendieren. Und Abpipettieren sollte vermieden werden. </li><li> Inkubieren auf Eis für 20 min. </li><li> Immunolabel Kerne für die Durchflusszytometrie oder halten sie für bis zu 24 Stunden bei 4 ° C. </li></ol> 4. Kerne Immunmarkierung für die Durchflusszytometrie-Analyse <ol><li> Zentrifuge Kerne bei 1.743 xg (4.500 rpm) in Mikrozentrifuge für 1 min, und entfernen Sie Überstand durch sehr vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Je 100 ul kaltem (4 ° C) 0,1% Triton X-100, 4% Paraformaldehyd in PBS auf Kerne permeabilisieren. Inkubieren auf Eis für 10 min. </li><li> Centrifuge permeabilisiert Kerne bei 1.743 xg in Mikrozentrifuge und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. An diesem Punkt Kerne Pellets nicht gut befestigen am Boden des Röhrchens. Es wird empfohlen, wieder zentrifugiert, wenn das Pellet wird locker. </li><li> Resuspendieren Kerne in 500 ul kaltem 4% fötales Rinderserum (FBS) in PBS unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, und Inkubieren auf Eis für 20 min. ZentrifugierenKerne bei 1.743 xg für 3 min in Mikrozentrifuge und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. </li><li> Resuspendieren Kerne in 100 ul kaltem PBS mit 4% FBS und 2,5 ug / ml des mAb gegen den nuclear factor von Interesse. Inkubieren auf Eis für 20 min. Hinweis: Übliche negative Kontrollen sollten Anti-Atomkraft-Antikörper nur beinhalten, und FITC-markierten sekundären Antikörper nur. </li><li> Zweimal waschen mit 500 ul kaltem PBS mit 4% FBS und Zentrifugation bei 1743 xg für 3 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand sehr vorsichtig resuspendieren Kerne in 100 ul kaltem PBS mit 4% FBS und 10 ug / ml des entsprechenden FITC-markierten sekundären Antikörper und Inkubation auf Eis für 20 min. </li><li> Waschen Kerne zweimal mit 500 &amp;mgr; l kaltem PBS mit 4% FBS wie in den vorangegangenen Schritt. </li><li> Resuspendieren Kerne in 400 &amp;mgr; l kaltem 4% Paraformaldehyd in PBS. Anmerkung: Die Zellkerne werden in Paraformaldehyd platziert, damit die Probe für mehrere Tage gelagert werden ohne KontaminationProbleme, die in der Gegenwart von Serum auftreten kann. </li><li> Analysieren sofort durch Durchflusszytometrie oder dunkel lagern bei 4 ° C bis zu drei Tage. </li></ol> 5. Durchflusszytometrie-Analyse <ol><li> Analysieren immunmarkierten Kerne in einem Durchflußzytometer wie einem FACScan (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ) oder einer ähnlichen Vorrichtung. </li><li> Passen Akquisition Einstellungen: FSC bei log-Skala auf 10-1, SSC bei log-Skala bei 196 und Gate-Kerne in einem Dot-Plot. </li><li> Erwerben zehntausend Kerne pro Probe. </li><li> Analysieren Fluoreszenz von FITC-gefärbten Zellkernen durch die FL-1-Kanal (506 nm) bei log-Skala auf 400 eingestellt. </li></ol>

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<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+neutrophil+apoptosis+by+type+1+IFN+depends+on+cross-talk+between+phosphoinositol+3-kinase%2C+protein+kinase+C-d%2C+and+NF-%CE%BAB+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways.</a> J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).</li>
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<li>Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc%CE%B3RIIA+and+Fc%CE%B3RIIIB+mediate+nuclear+factor+activation+through+separate+signaling+pathways+in+human+neuthophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils.</a> J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die Reinigung hier beschriebene Methode ermöglicht die Isolierung von unstimulierten Neutrophilen (PMN) mit einer Reinheit größer als 95% (bestimmt durch mikroskopische Beobachtung), in einer kurzen Zeit. Manchmal kann durch Neutrophile Erythrozyten kontaminiert werden, wenn letztere nicht vollständig lysiert werden. Dies bedeutet in der Regel nicht auf die Technik, da Erythrozyten und PMN kann leicht als deutliche Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie unterschieden werden. Isoliert PMN kann dann durch Vernetzun...

Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im peripheren Blut ein. Während Entzündungen und Infektionen Neutrophile sind die ersten Zellen, die an der betroffenen Stelle erscheinen, wo sie als erste Verteidigungslinie 2 handeln. Neutrophile besitzen mehrere antimikrobielle Mechanismen 3 einschließlich Phagozytose, die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, die Freisetzung von lytischen Enzymen durch Degranulation und Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen 4,5. Neutrophile sind kurzlebige Zellen, die sich schnell durch Signalisierung von verschiedenen Rezeptoren auf der Zelloberfläche werden aktiviert. Obwohl Neutrophilen wurden berücksichtigt terminalen Zellen aufgrund ihrer kurzen Lebensdauer und weil sie Apoptose, wenn während des entzündlichen Prozesses 6 aktiviert unterziehen, ist es nun klar, dass sie auch ändern ihren Phänotyp, indem Sie die Ebene der Transkription bestimmter Gene. Die Produktion von Cytokinen 5 und der Hemmung der Apoptose 7,8 sind zwei iW ichtig aktivierungsabhängige Zellfunktionen auf der Ebene der Transkription in Neutrophilen reguliert. Nuclear factor kappaB (NF-kB) beteiligt sich an der transkriptionalen Kontrolle Zytokinproduktion 4 und bei der Regulation der Apoptose und Überleben der Zellen 9-11 in verschiedenen Zelltypen. Die Signalwege, die nuclear factor-Aktivierung führen, sind in der Regel durch Reportergen-Assays oder durch elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (EMSA) untersucht. Da jedoch Neutrophilen kurzlebigen Zellen sind, kann die Untersuchung von transkriptionell reguliert Reaktionen in diesen Zellen nicht mit Reportergen-Assays durchgeführt werden, da es keine effiziente Methoden zur Transfektion sind Neutrophilen. EMSA-Assays wurden in Neutrophilen verwendet worden, um nuclear factor-Aktivierung 12,13 erkunden, allerdings ist diese Methode aufwendig und teuer, da es die Verwendung von radioaktivem Material beinhaltet. Nukleofektion ist eine weitere Technik, die verwendet wurde successfully zu transfizieren Monozyten 14. Somit zumindest theoretisch könnte Kernfaktor Aktivierung der neutrophilen Granulozyten durch Transfektion detektiert werden (trotz niedriger Effizienz). Jedoch würde diese Technik teurer sein, zeitaufwendig und wahrscheinlich weniger quantitativ. Mikroskopische Analyse immunogefärbten Zellen könnten auch verwendet werden, um atomaren Faktoren im Kern zu erfassen. Tatsächlich haben wir NF-KB-Translokation in den Zellkern 15 auf diese Weise detektiert. Leider ist diese Technik auch zeitaufwendig, weniger quantitative und vorbehaltlich des Betrachters Bias. Hier stellen wir eine einfache und effiziente Methode, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren isoliert und immunmarkierten Kerne mittels Durchflusszytometrie erlaubt. Wir beschreiben Techniken an Neutrophile aus humanen peripheren Blut zu isolieren, diese Zellen zu stimulieren über Integrine oder Fc-Rezeptoren mit anti-Rezeptor-Antikörpern, zu isolieren und immunolabel Kerne und analysieren Kerne durch Durchflusszytometrie (FBBILDUNG 1). Die Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um NF-kappaB 15 und Elk-1 16 Kernfaktoren in neutrophilen Kerne zu erkennen. Die Empfindlichkeit dieses Verfahren ermöglicht den Nachweis von kleinen Änderungen in nuclear factor Ebenen im Zellkern. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um das Niveau von Transkriptionsfaktoren in Kernen von anderen Zellarten zu analysieren.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Heparin </td><td>PiSA (Mexiko)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Pharmacosmos A/S (Holbaek, Dänemark)</td><td>T1-Dextran T500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Pharmacia</td><td>17-0320-01</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid </td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Cohn-Fraktion V</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>wasserfreies Magnesiumchlorid </td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DL- Dithiothreitol (DTT) </td><td>Sigma</td><td>D9163</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau (0,4 % ige Lösung)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td></td><td>Sigma P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 </td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler Antikörper IV.3</td><td>Medarex (Annandale, NJ)</td><td>025-1</td><td>Humanspezifischer monoklonaler anti-FcRII (CD32) </td></tr><tr><td>Antikörper 3G8</td><td>Medarex (Annandale, NJ)</td><td>028-2</td><td>humanspezifischer anti-FcRIII (CD16) </td></tr><tr><td>monoklonaler Antikörper TS2/16</td><td>Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)</td><td>Gespendet von Dr. Martin Hemler</td><td>Humanspezifischer Anti-&#946; 1 Integrin (CD29)</td></tr><tr><td>Monoklonaler Antikörper IB4</td><td>University of California, San Francisco</td><td>Gespendet von Dr. Eric J. Brown</td><td>Humanspezifisches Anti-&#946; 2 Integrin (CD18)</td></tr><tr><td>F(ab')2 Ziegen Anti-Maus IgG </td><td>Cappel (Aurora, OH)</td><td>55468</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjugiert F(ab')2 Ziegen Anti-Maus IgG</td><td>Cappel (Aurora, OH)</td><td>55522</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjugiert F(ab')2 Ziegen Anti-Kaninchen IgG</td><td>Cappel (Aurora, OH)</td><td>55665</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NF-&#954; B p50</td><td>Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td><td>sc-114</td><td>Polyklonaler Kaninchen-Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-NF-&#954; B p65</td><td>Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td><td>sc-109</td><td>Kaninchen polyklonaler Antikörper</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>15-ml-Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50-ml-Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge, Sorvall Tischgerät</td><td>Dupont Instruments</td><td>RT 6000D</td><td></td></tr><tr><td>pH-Meter</td><td>Corning</td><td>340</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman Pipette P-20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman Pipette P-200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman Pipette P-1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad-Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>2IS-M</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5414C</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)</td><td>FACScalibur</td><td></td></tr></tbody></table>

eine einfache und effiziente methode, um nuclear factor aktivierung in menschlichen neutrophilen erkennen von durchflusszytometrie

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im peripheren Blut. Diese Zellen sind die ersten, an den Standorten der Entzündung und Infektion auftreten und somit als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroorganismen. Neutrophile besitzen wichtige Funktionen wie antimikrobielle Phagozytose, Freisetzung von lytische Enzyme, und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies. Zusätzlich zu diesen wichtigen Abwehrmechanismus funktioniert, führen Neutrophilen andere Aufgaben in Reaktion auf eine Infektion wie die Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen und Hemmung der Apoptose. Zytokine rekrutieren andere Leukozyten, die klar die Infektion zu helfen, und die Hemmung der Apoptose ermöglicht die Neutrophilen, länger zu leben am Ort der Infektion. Diese Funktionen werden auf der Ebene der Transkription reguliert. Da jedoch Neutrophilen kurzlebigen Zellen sind, kann die Untersuchung von transkriptionell reguliert Reaktionen in diesen Zellen nicht mit herkömmlichen Reportergen Verfahren durchgeführt werden, da es keine effiziente sindziente Techniken für neutrophilen Transfektion. Hier stellen wir eine einfache und effiziente Methode, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren isoliert und immunmarkierten Kerne mittels Durchflusszytometrie erlaubt. Wir beschreiben Methoden zur reinen Neutrophilen aus humanen peripheren Blut zu isolieren, diese Zellen zu stimulieren mit anti-Rezeptor-Antikörpern, zu isolieren und immunolabel Kerne und analysieren Kerne durch Durchflusszytometrie. Die Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um NF-kappaB und Elk-1 Kernfaktoren in Kernen von Neutrophilen und anderen Zelltypen erkennen. Somit stellt diese Methode eine Option zum Analysieren Aktivierung von Transkriptionsfaktoren an isolierten Kernen aus einer Vielzahl von Zelltypen.

Die Reinigung hier beschriebene Methode der Regel bietet unstimulierten Neutrophilen (PMN) mit einer Reinheit von mehr als 95% (Abbildung 1A). Isoliert PMN kann dann durch Vernetzung insbesondere Rezeptoren mit spezifischen monoklonalen Antikörpern stimuliert werden. Wir haben PMN durch Fc-Rezeptoren und Integrine (1B) stimuliert. Einmal stimuliert, PMN lysiert und Kerne mit hohen Ausbeuten isoliert. Kerne werden dann für eine bestimmte nuclear factor, wie die Kernfaktor kappaB (NF-kB),...

Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im Blut. Neutrophile besitzen transkriptionell reguliert Funktionen wie Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen und Hemmung der Apoptose. Diese Funktionen können mit dem hier vorgestellten Verfahren, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren können mittels Durchflusszytometrie in isolierten Zellkernen untersucht werden

Eine einfache und effiziente Methode, um Nuclear Factor Aktivierung in menschlichen Neutrophilen Erkennen von Durchflusszytometrie

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Dieses Experiment verwendet die Durchflusszytometrie, um kernständige Proteine in isolierten und immunmarkierten Kernen von Neutrophilen nach deren Reinigung aus menschlichem peripherem Blut nachzuweisen und zu quantifizieren. Entfernen Sie die roten Blutkörperchen mit Dextrin, gefolgt von einer Dichtegradientenzentrifugation des Plasmas. Anschließend stimulieren Sie die gereinigten Neutrophilen mittels Anti-Rezeptor-Antikörper über Integrine oder FC-Rezeptoren.Führen Sie die Isolierung der Kerne durch und fixieren Sie die Proben für die Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern gegen den gewünschten NU-Kernfaktor. Beispielsweise NF kappa B, anschließend analysieren Sie die Kerne mittels Durchflusszytometrie, um geringfügige Veränderungen in der Aktivierung des Kernfaktors nachzuweisen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Stimulation von Neutrophilen über ihre Integrine zu einer Erhöhung der nukleären Konzentration des Transkriptionsfaktors N von kappa B führt. Signalwege, die zur Aktivierung von Kernfaktoren führen, werden üblicherweise mittels Reporter-Gen-Assays oder Elektrophoretischer Mobilitätsverschiebe-Assays in primären Zellen untersucht.Häufig sind diese Methoden nicht gee

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Verfahren zum Quantifizieren von Adhäsion von Neutrophilen berichtet. Dieses Verfahren erzeugt eine dynamische Fließumgebung ähnlich der in einem Blutgefäß auftreten. Es erlaubt die Untersuchung der Adhäsion von Neutrophilen an entweder gereinigte Adhäsionsmoleküle (Ligand) oder Endothelzell-Substrat (HUVEC) in einem Rahmen ähnlich der in vivo Umgebung mit Scherbeanspruchung.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Es werden Hochdurchsatz-Assays vorgestellt, die in Kombination hervorragende Werkzeuge zur Quantifizierung der NET-Freisetzung von menschlichen Neutrophilen bieten.

Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen<em&gt; In Vitro</em

Eine einfache und zuverlässige Methode wird hier beschrieben eine Reihe von NK-Zellfunktionen wie Degranulierung, Zytokin und Chemokin-Produktion in verschiedenen NK-Zelluntergruppen zu analysieren.

Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind Netzwerke von DNA, Histone und Neutrophilen-Proteine. Obwohl eine Komponente der angeborenen Immunantwort sind NETs in Autoimmun- und Thrombose beteiligt. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Verfahren zur Hunde- Neutrophilen Isolierung und Quantifizierung von NETs Mikrotiterplatten-Fluoreszenztest verwendet wird.

Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz

Dieser Artikel liefert die detaillierte Methode zur Durchführung eines schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Assays durch Integration der On-Chip-Neutrophilen-Isolation aus Vollblut und dem Chemotaxis-Test auf einem einzigen mikrofluidischen Chip.

Ein All-on-Chip-Verfahren zur schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Analyse direkt aus einem Blutstropfen

Eine Flow Cytometry basierende Methode quantitativ bestimmen die zytotoxische Aktivität des menschlichen natürliche Killerzellen wird hier angezeigt.

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das Vorhandensein der Neutrophilen behoben/permeabilized Histologie Abschnitte erkennen und bewerten den Aktivierungsstatus der live gereinigten Neutrophilen. Vor allem bindet MUB40 Peptid Lactoferrin in Neutrophilen-spezifischen und tertiären Granulat vorhanden. Exposition der Granulat-Inhalte durch Permeabilisierung oder Neutrophilen Aktivierung ermöglicht die Kennzeichnung von Neutrophilen.

Das MUB40 Peptid für den Einsatz bei der Aufdeckung von Neutrophilen-vermittelte Entzündung Veranstaltungen

Dieses Protokoll beschreibt einen hochempfindliche und hohen Durchsatz Neutrophilenzahl extrazelluläre Falle (NET) Assay für die halbautomatische Quantifizierung von ex-Vivo NET Bildung durch Immunfluoreszenz dreidimensionale konfokalen Mikroskopie. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um NET Bildung und Abbau nach verschiedenen Reize zu bewerten und kann verwendet werden, um mögliche NET gezielte Therapien zu studieren.

Ein High-Throughput-Assay zu beurteilen und zu quantifizieren Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung

Dieses Protokoll umfasst eine Reihe von funktionellen Neutrophilen-Assays, die als Screening-Methode verwendet werden, um Funktionen aus verschiedenen Signalwegen abzudecken. Das Protokoll beinhaltet eine erste und einfache Bewertung der Zelllebensfähigkeit, Reinheit, Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, Echtzeitmigration, Phagozytose und einen vorläufigen Vorschlag für neutrophile extrazelluläre Fallen.

Eine Reihe von Screening-Techniken für einen schnellen Überblick über die Funktion der Neutrophilen

Wir präsentieren eine automatisierte Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) unter Verwendung des Lebendzellanalysesystems, gekoppelt mit einem membranpermeabilitätsabhängigen Dual-Farbstoff-Ansatz.

Echtzeit-Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Bildung extrazellulärer Neutrophilenfallen in menschlichen Neutrophilen

Dieses definierte Protokoll beschreibt einen Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopie-Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung der Freisetzung von extrazellulären Traps (NET) bei humanen Neutrophilen in vitro. Die reproduzierbare Methode ermöglicht die Untersuchung der Eigenschaften und Kinetik der NET-Freisetzung nach Stimulation mit unterschiedlichen NETosis-Induktoren und ermöglicht die Beurteilung der Pharmakologie von NETosis-Antagonisten.

Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopische Quantifizierung der Freisetzung extrazellulärer Fallen bei humanen Neutrophilen und Bewertung der Pharmakologie von Antagonisten

Lernen Sie eine Methode zur Quantifizierung nukleärer Proteine in menschlichen Neutrophilen mittels Durchflusszytometrie. Diese Technik ermöglicht die Analyse der NF-kappa-B-Aktivierung in isolierten Zellkernen.

Eine einfache und effiziente Methode, um Nuclear Factor Aktivierung in menschlichen Neutrophilen Erkennen von Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal

Eine einfache und effiziente Methode, um Nuclear Factor Aktivierung in menschlichen Neutrophilen Erkennen von Durchflusszytometrie

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