Eine einfache und effiziente Methode, um Nuclear Factor Aktivierung in menschlichen Neutrophilen Erkennen von Durchflusszytometrie

Dieses Experiment verwendet die Durchflusszytometrie, um kernständige Proteine in isolierten und immunmarkierten Kernen von Neutrophilen nach deren Reinigung aus menschlichem peripherem Blut nachzuweisen und zu quantifizieren. Entfernen Sie die roten Blutkörperchen mit Dextrin, gefolgt von einer Dichtegradientenzentrifugation des Plasmas. Anschließend stimulieren Sie die gereinigten Neutrophilen mittels Anti-Rezeptor-Antikörper über Integrine oder FC-Rezeptoren.

Führen Sie die Isolierung der Kerne durch und fixieren Sie die Proben für die Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern gegen den gewünschten NU-Kernfaktor. Beispielsweise NF kappa B, anschließend analysieren Sie die Kerne mittels Durchflusszytometrie, um geringfügige Veränderungen in der Aktivierung des Kernfaktors nachzuweisen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Stimulation von Neutrophilen über ihre Integrine zu einer Erhöhung der nukleären Konzentration des Transkriptionsfaktors N von kappa B führt. Signalwege, die zur Aktivierung von Kernfaktoren führen, werden üblicherweise mittels Reporter-Gen-Assays oder Elektrophoretischer Mobilitätsverschiebe-Assays in primären Zellen untersucht.

Häufig sind diese Methoden nicht geeignet. Die Durchflusszytometrie ermöglicht eine schnelle Detektion und Quantifizierung von nukleären Proteinen in isolierten Kernen. Beginnen Sie mit 10 Millilitern frisch gewonnenem Blut von gesunden erwachsenen Probanden.

Pipettieren Sie zwei Milliliter einer 6 %igen Dextrin T 500-Lösung in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie anschließend 10 Milliliter Blut hinzu, mischen Sie durch zweimaliges oder dreimaliges Umstülpen des Röhrchens und lassen Sie 45 Minuten lang die Erythrozytensedimentation durch Schwerkraft in einem frischen kegelförmigen 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen erfolgen. Geben Sie fünf Milliliter FI-Fialpack hinein.

Sammlen Sie das leukozytenreiche Plasma, das sich oberhalb der sedimentierten Erythrozyten gebildet hat. Schichten Sie es vorsichtig auf dem Fial-Pack auf, um zwei Phasen zu bilden, und zentrifugieren Sie 20 Minuten bei 516 G und vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und lösen Sie das Zellpellet auf, indem Sie das Gefäß gegen das Rack klopfen.

Suspenderen Sie die Zellen anschließend in 10 Milliliter kaltem PBS. Überführen Sie die Zellsuspension in ein kegelförmiges 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 290 G und vier Grad Celsius. Lösen Sie den Zellenpellet wie zuvor auf und geben Sie 10 Milliliter kalte hypotone Lösung hinzu, um die Erythrozyten zu lysieren.

Mischen Sie durch vorsichtiges Schwenken des Reagenzglases genau eine Minute lang. Geben Sie anschließend 10 Milliliter kalte hypertonische Lösung hinzu und lagern Sie die Probe auf Eis. Zählen Sie nun die Zellen nach Pelletierung der Neutrophilen durch Zentrifugation.

Wir suspendieren die PMN bei 10^7 Zellen pro Milliliter. Die Zellen werden in kaltem PBS auf Eis gehalten. Aliquotieren Sie 100 Mikroliter der PMN-Suspension in 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen.

Anschießend die entsprechende monoklonale Antikörperlösung in einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen und 15 Minuten auf Eis inkubieren. Zum Waschen der Zellen ein Milliliter kalte PBS hinzufügen, zentrifugieren und den Überstand absaugen. Dann das Zellpellet vorsichtig aufbrechen und die Zellen zweimal erneut mit PBS waschen.

Um nicht gebundene Antikörper zu entfernen, resuspendieren Sie die gewaschenen PMN in dem gleichen anfänglichen Volumen warmem PBS, das 60 Mikrogramm pro Milliliter Ziegen-Anti-Maus-IgG enthält, und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für eine bis zwanzig Minuten, abhängig vom gewünschten nukleären Faktor. Geben Sie nun ein Milliliter kaltes PBS hinzu. Nachdem die Zellen durch Zentrifugation pelletiert wurden, entfernen Sie den Überstand und frieren Sie die Zellpellets unverzüglich in einem Trockeneis-Ethanol-Bad ein. Entfernen Sie für jede Probe das Röhrchen aus dem Trockeneis-Ethanol-Bad, wischen Sie es sauber ab und resuspendieren Sie es erneut.

Suspendieren Sie die gefrorenen PMN-Pellets in 100 Mikrolitern kalter hypotonischer Lösung. Stellen Sie alle Proben auf Eis, um die Integrität der Zellkerne zu überwachen. Färben Sie ein Eloqua der Kernsuspension mit Trypanblau.

Wenn die Kernsuspension viele intakte Zellen oder Zelltrümmer enthält, ist es besser, die Zubereitung zu verwerfen und das Verfahren mit einer anderen Probe zu beginnen. Nachdem die Kerne durch Zentrifugation pelletiert wurden, das Überstandsvolumen sehr vorsichtig entfernen, dann die Kerne in 100 Mikrolitern kalter, 4 %iger Paraformaldehydlösung fixieren und die Kerne auf Eis inkubieren. Nachdem die Kerne vorsichtig pelletiert wurden, den Überstand in 100 Mikrolitern kaltem Permeabilisierungspuffer entfernen und die Proben 10 Minuten lang auf Eis inkubieren.

Anschießend die permeabilisierten Zellkerne durch Zentrifugation gewinnen. An diesem Punkt haften die Nukleipellets nicht gut am Boden des Gefäßes. Es wird empfohlen, erneut zu zentrifugieren.

Wenn sich das Pellet löst, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, suspendieren wir die Kerne in 500 µL kaltem PBS mit 4 % fetalem Rinderserum und inkubieren die Probe 20 Minuten auf Eis. Pellettieren Sie die Kerne durch Zentrifugation, dann resuspendieren Sie die Kerne in 100 µL kaltem PBS mit 4 % FBS und 2,5 Mikrogramm pro Milliliter des monoklonalen Antikörpers gegen den nukleären Faktor der Untersuchung. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten auf Eis, nachdem Sie die Proben zweimal mit jeweils 500 µL kaltem PBS mit 4 % FBS gewaschen haben. Suspendieren Sie die Kerne anschließend in 100 µL kaltem PBS mit 4 % FBS und 10 Mikrogramm pro Milliliter des entsprechenden mit FZ markierten sekundären Antikörpers, und inkubieren Sie 20 Minuten auf Eis. Nach zwei weiteren Wäschen resuspendieren Sie die Kerne in 400 µL kaltem PBS mit 4 % Paraldehyd.

Analysieren Sie die immunmarkierten Kerne in einem Durchflusszytometer, wie beispielsweise einem FACS-Scan oder einem ähnlichen Gerät. Stellen Sie die Erfassungseinstellungen so ein, dass FSC im logarithmischen Maßstab bei 10 hoch minus eins und SSC im logarithmischen Maßstab bei 196 liegt, und definieren Sie ein Gatter für die Kerne in einem Dot-Plot. Erfassen Sie 10.000 Kerne pro Probe.

Danach analysieren Sie die Fluoreszenz der fitsy-gefärbten Kerne über den FL1-Kanal, der auf logarithmischer Skala bei 400 eingestellt ist. Diese PMN-Reinigungsmethode liefert in der Regel unstimulierte Neutrophile mit einer Reinheit von über 95 %. Die aus PMN isolierten Kerne weisen hohe Ausbeuten auf und können im Durchflusszytometer anhand eines Dotplots nach Stimulation leicht als separate Population von intakten PMN erkannt werden. Durch die Vernetzung von Beta-1-Integrinen wird NF-kappa B in den Zellkern transloziert, und dieser Anstieg an nukleärem NF-kappa B wird als Zunahme der Fluoreszenz detektiert.

Auf ähnliche Weise führt die Stimulierung von PMN durch Quervernetzung der Beta-2-Integrine ebenfalls zu einer Aktivierung von NF-kappa B, was durch einen Anstieg der Fluoreszenz angezeigt wird. Die Empfindlichkeit dieser Methode ermöglicht den Nachweis geringer Änderungen der Nukleofaktor-Konzentrationen, wie belegt durch die Tatsache, dass Beta-1-Integrine, die an extrazelluläre Matrixproteine wie Fibronectin binden, eine stärkere NF-kappa-B-Aktivierung hervorrufen als Beta-2-Integrine, die an Adhäsionsmoleküle auf anderen Zellen binden. Diese Methode bietet eine große Flexibilität, da zahlreiche verschiedene Fluorochrome verwendet werden können und die Herstellung von Kernen aus verschiedenen Zelltypen ermöglicht wird; nutzen Sie diesen einfachen und kostengünstigen Ansatz für Signaltransduktionsstudien, die Veränderungen der Proteinkonzentrationen im Zellkern einer Vielzahl von Zelltypen beinhalten.