Eine schnelle und effiziente Methode zur Beurteilung der Pathogenität von Ustilago-Maydis auf Mais- und Teosintenlinien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Inokulation durch Nadelinjektion, eine USTA Lago Maus Zellsuspensionskultur, und die Durchführung eines Krankheitsresistenzreaktions-Screenings von Maze Tête und Maze Teosinte Cross Intres Lines. Dies wird erreicht, indem zunächst Pflanzenlinien für die Inokulation und das Screening ausgewählt werden. Als nächstes wird das Saatgut für experimentelle und Kontrollnadelinjektions-Impfexperimente gepflanzt.

10 Tage später wird die von U hergestellte Zellsuspension in den Stamm jeder Pflanze injiziert. Abschließend werden die Resistenzreaktionen der Versuchs- und Kontrollanlagen verglichen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine erfolgreiche Nadelinjektionsimpfung zeigen, indem der Phänotyp der mit Ihnen geimpften Pflanze visualisiert wird. Mais.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie den Erreger direkt zwischen die Blätter bringt. Dadurch wird das Problem des Eindringens von Krankheitserregern beseitigt. Um mit der Auswahl von Pflanzenlinien für die Inokulation und das Screening zu beginnen, wie hier gezeigt, wurden zwei Labyrinthlinien, fünf Teosinte-Linien und 40 Labyrinth-Teosinte-Kreuzlinien mit nicht charakterisierter Resistenz gegen U Mais für diese Studie für experimentelle und Kontrollnadelinjektions-Impfexperimente verwendet.

Pflanzen Sie vier Samen jeder Pflanzenlinie in kleinen Flächen, indem Sie die Samen mit einem Finger etwa einen halben Zentimeter in die Erde schieben und leicht mit Erde bedecken. Legen Sie dann die Pflanzen in eine Wachstumskammer und gießen Sie die Samen, bis sie durchnässt sind, wobei Sie darauf achten müssen, dass sie nach dem Gießen unter der Erde bleiben. Bauen Sie die Pflanzen in Tag- und Nachtumgebungen mit 28 und 20 Grad Celsius und 14 bzw. 10 Stunden Licht- und Dunkelzyklen an.

Und etwa 500 Mikromolare pro Quadratmeter pro Sekunde photosynthetisch aktive Strahlung an der Spitze des Kronendachs. Halte die relative Luftfeuchtigkeit tagsüber und nachts bei etwa 70 % bzw. 90 % und halte alle Pflanzen in derselben Wachstumskammer, um eine Wachstumsumgebung zu erhalten, die über das gesamte Experiment hinweg kongruent ist. Acht Tage nach dem Pflanzen der Samen verwenden Sie eine sterile Schlaufe, um Huis aus einer gefrorenen Glycerinbrühe auf Kartoffel-Dextrose-Agar- oder PDA-Platten zu streichen, zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius zu inkubieren und regelmäßig zu überwachen, um sicherzustellen, dass sie unter einer Laminar-Flow-Haube gut wachsen.

Verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher, um eine einzelne Kolonie für jeden Stamm auszuwählen und geben Sie sie in drei Milliliter Röhrchen mit PD-Brühe. Inkubieren Sie die Kulturen zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius und 200 U/min und überprüfen Sie sie regelmäßig auf Wachstum. Messen Sie als Nächstes den OD 600 der Kulturen, um sicherzustellen, dass sie auf einen OD von 1,0 gezüchtet wurden.

Bringen Sie die Kulturen mit Wasser auf eine Endkonzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter in einem Endvolumen von 30 Millilitern. Diese Konzentration an pathogener Zellsuspension führt durchweg zu einer guten Infektion der Pflanzen. Mische dann vor der Inokulation gleiche Volumina der beiden, die Du als Stämme hergestellt hast.

Bevor Sie eine Drei-Milliliter-Spritze mit der Zellsuspension füllen, füllen Sie die Kontrollspritze mit Wasser, um es mit minimalem Schaden für die Pflanze zu injizieren. Das Gewebe befestigt die Injektionsnadel mit einem Nullpunkt von 457 Millimetern x 1,3 Zentimetern am Ende jeder Spritze. Nehmen Sie die Pflanzen aus der Wachstumskammer und injizieren Sie sie in einem 90-Grad-Winkel knapp über der Erdlinie.

Führen Sie die Nadel der U maus vorsichtig in den Stiel einer Versuchspflanze ein, bis sie sich in der Mitte des Stiels befindet. Injizieren Sie etwa 100 Mikroliter der Zellsuspension. Er schiebt sich durch den Stängel und ist sichtbar, wenn er sich in den Strudel der Pflanze bewegt.

Fahren Sie mit der Injektion weiterer Versuchspflanzen fort, bis die Spritzen leer sind. Füllen Sie sie dann mit Wasser, um die Nadel von Pflanzengewebe zu reinigen, und füllen Sie die Spritze wieder auf, bis alle Pflanzen injiziert sind. Verwenden Sie die Wasserspritze, um die Kontrollpflanzen auf ähnliche Weise zu injizieren.

Wenn die Injektionen abgeschlossen sind. Setzen Sie die Pflanzen täglich wieder in die Wachstumskammer ein. Gießen Sie nur den Boden und prüfen Sie, ob sich Krankheitserreger entwickeln und Pflanzenresistenzreaktionen vorliegen.

Mit einer Bewertung von Resistenzreaktionen von eins bis fünf können Sie die Resistenzreaktionen für jede Pflanze 7, 10, 14 und 21 Tage nach der Inokulation oder DPI skalieren, bewerten und aufzeichnen. Die Zahlenwerte auf der Ratingskala steigen mit zunehmender Schwere der Erkrankung. Zum Beispiel zeigt eine A1C-, eine oder zwei Resistenzreaktionen einen Widerstand an.

Eine Reaktion von drei, vier oder fünf Resistenzen deutet auf eine Anfälligkeit hin. Vergleichen Sie die Resistenzreaktionen der Versuchs- und Kontrollanlagen und wählen Sie Versuchspflanzen mit A1C eins, a oder zwei Resistenzreaktionen aus. Diese Pflanzen gelten als resistent gegen Matis.

In diesem Experiment war die Mehrzahl der Pflanzen, die mit Humus beimpft wurden, anfällig für Infektionen. Die Pflanzen zeigten eine schwere Krankheitsentwicklung, die sich in der Stängel- und Basalgallenbildung mit schwarzen Telio-Sporen zeigte. Mehrere Pflanzen waren nach der Inokulation aufgrund der Schwere der Krankheit tot.

Im Gegensatz dazu waren die Kontrollpflanzen sehr sauber und zeigten an keinem Teil der Pflanze eine Erregerentwicklung, was darauf hindeutet, dass die Erregerentwicklung an den Versuchspflanzen auf die Nadelinjektionsimpfung mit U Mais zurückzuführen war. Es wurden drei Mais Teosinte-Kreuzaggressionslinien identifiziert, die gegen U Mais resistent waren, und eine erfolgreiche Inokulation wurde durch leichte Sklerose bestätigt. Cyan in der Produktion oder geringe Blattgallenbildung. Diese Technik kann auf hocheffiziente Weise mit Reproduzierbarkeit durchgeführt werden. Dies hilft bei der Inokulation und Phänotypisierung einer großen Anzahl von Pflanzen.