On-Chip-Endothelial Entzündliche Phänotypisierung

Das Ziel dieses Videos ist es, eine Lab-auf-einem-Chip-Technik zur Charakterisierung des inflammatorischen Zustands von endothelialen Zellen zu demonstrieren. Zunächst werden humane aortale endotheliale Zellen bis zur Konfluenz auf einem Gewebekultur-Substrat kultiviert und anschließend in eine Scher-Vorrichtung mit Conan-Platte eingesetzt. Die Zellen werden mit dem proinflammatorischen Zytokin TNF alpha behandelt und gleichzeitig vier Stunden lang differenziellen Scherbelastungsbedingungen ausgesetzt, die durch exakte Steuerung der Rotation des über dem Substrat befindlichen Kegels erzeugt werden. Die Scherbelastung moduliert eine gut charakterisierte inflammatorische Antwort auf das Zytokin.

Dazu gehört die Hochregulation von Adhäsionsmolekülen wie VCAM-1 und ICAM-1. Das Substrat wird auf eine Mikroskopbühne übertragen, wo die A-P-D-M-S-Mikrofluidik-Vorrichtung unter Vakuum direkt mit der Monoschicht abgedichtet wird, wodurch Strömungskanäle entstehen. Aktivierte monozytäre THP-1-Zellen werden über die vorbehandelte hs geleitet, wo sie in Abhängigkeit vom Ausmaß der Expression von Adhäsionsmolekülen an die Zellen binden.

Der entzündliche Zustand des Endothels wird durch die Quantifizierung der Gesamtanzahl der fest angehefteten THP-1-Zellen bestimmt. Hallo, mein Name ist She D Diverse, und ich bin Greg Foster. Und ich bin Keith Bailey.

Wir befinden uns in den Laboren der Professoren Pastor und Simon in der Abteilung für Biomedizinische Technik an der University of California in Davis. Heute werden wir die Anwendung eines Lab-on-a-Chip-basierten Ansatzes beschreiben, um endotheliale Dysfunktion und Entzündungen quantitativ zu untersuchen. Diese Werkzeuge bieten eine Plattform, um Studien durchzuführen, die sich mit der Überlagerung metabolischer Stressfaktoren mit hydrodynamischen Einflüssen sowie mit der Regulation des endothelialen entzündlichen Phänotyps und der Anfälligkeit für Atherosklerose befassen.

Wir bezeichnen unsere Geräte daher als vaskuläre, mikrofluidische Kammern oder VMMC. Diese Geräte ermöglichen es uns, entzündliche Reaktionen in endothelialen Zellen und Monozyten unter Bedingungen zu quantifizieren, die denen in atherogenen Gefäßen ähneln. Die VMMC erlaubt die Verwendung geringer Mengen an Reagenzien oder Materialien, die möglicherweise nur begrenzt verfügbar sind.

Sie können auch in einer Vielzahl anpassbarer Anordnungen und Geometrien hergestellt werden, was sie für ein breites Spektrum an Anwendungen besonders geeignet macht. Heute werden wir ein repräsentatives Experiment mithilfe unseres Lab-on-a-Chip-Ansatzes demonstrieren. Menschliche endotheliale Monolayer werden definierten Scherkräften und einer Zytokinaktivierung ausgesetzt.

Wir werden die Anwendung der VMC demonstrieren, um die Rekrutierung menschlicher monozytärer Zellen in die Monoschicht in Echtzeit als funktionellen Nachweis der endothelialen Aktivierung zu quantifizieren, wobei dreizöllige kreisförmige Substrate verwendet werden, die aus 100-Millimeter-Zellkulturschalen gefräst sind. Die dreizölligen Substrate werden mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend durch Einweichen in 70 %igen Ethanol sterilisiert. Die sterilen Substrate werden in 100-Millimeter-Petri-Schalen platziert und zum Trocknen ausgelegt.

Sie werden anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur mit Typ-I-Kollagen in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter inkubiert und mit PBS gewaschen. Menschliche aortale Endothelzellen oder HA werden in einer Konzentration von 650.000 Zellen pro Milliliter suspendiert. Ein Milliliter der Zellsuspension wird in Tropfen auf ein getrocknetes, kollagenbeschichtetes Substrat gegeben und zu einer gleichmäßigen Suspension verteilt.

Die beschichteten Substrate werden anschließend in einen 37-Grad-5-%-CO₂-Inkubator gegeben und an der Substratoberfläche anheften lassen. Nach einer Stunde werden neun Milliliter EGM-2-Wachstumsmedium zugegeben, und die Zellen dürfen sich zu Monolagen entwickeln, bis sie etwa 90 % Konfluenz erreichen. Die Monolagen sind dann bereit, für nachfolgende Scherexperimente verwendet zu werden. Vaskuläre mimetische mikrofluidische Kammern werden hergestellt, indem PDMS-Masse über eine Negativform gegossen wird, die die gewünschte Kanalgeometrie enthält.

Silikonbasis wird in ein Kunststoffrinnchen gegeben, gefolgt vom Silikon-Härter im Gewichtsverhältnis 10:1. Das PDMS-Gel wird anschließend gründlich vermischt, wobei darauf geachtet wird, die Ränder des Rinnchens nicht abzukratzen, um keine Kunststoffpartikel in die Mischung einzubringen. Photolack-Formen werden mit Hexan gereinigt und zur Formung der VMMC vorbereitet.

Die PDMS-Mischung wird anschließend über die Negativform gegossen und dann in eine Vakuumkammer gegeben. In der Kammer wird die Luft aus der PDMS-Mischung entfernt und steigt nach 15 Minuten an die Oberfläche.

Die Form wird aus der Kammer entfernt, und Luft wird sanft über die PDMS-Oberfläche geblasen, um verbleibende Luftblasen aus der Form zu entfernen. Danach wird die Form abgedeckt und für eine Stunde in einen 37-Grad-Ofen gestellt, in dem das PDMS aushärten kann. Entnehmen Sie das erstarrte PDMS-Gel aus dem Ofen und führen Sie kreisförmige Einschnitte um die Kammer herum mit einem kleinen Skalpell durch.

Es ist entscheidend, dies schrittweise durchzuführen, um Berührungen mit dem Photoresist-Material zu vermeiden, da dies die Urform beschädigen würde. Entnehmen Sie die mikrofluidische Kammer aus der Form, indem Sie für jeden Kanal mit einer Luer-Stop-Nadel der Größe 19 die Einlass- und Auslassöffnungen ausstechen. Zusätzlich werden Löcher für die Vakuumschläuche außerhalb der Kanäle ausgestochen.

Die Vorbereitung für die VMMC ist nun abgeschlossen. Geben Sie mittels Pipette das proinflammatorische Zytokin TNF alpha in sechs Milliliter L 15-Medium, um eine Endkonzentration von 0,5 Nanogramm pro Milliliter zu erreichen. L 15-Medium wird hier als Scherflüssigkeit verwendet, da es eine pH-Pufferkapazität in Abwesenheit von 5 % CO2 aufweist.

Das Medium wird anschließend in eine sterile 10-Milliliter-Spritze aufgezogen, mit der das Schergerät befüllt wird. Die konfluente Zellschicht wird dann auf das Zellschergerät übertragen, das zuvor mit Ethanol sterilisiert, ausgerichtet und auf eine definierte Spalthöhe des Kegels eingestellt wurde. Der Träger wird aus der Petrischale entfernt, auf dem Glasnormal zentriert platziert und vorsichtig in den unteren Teil der Messkammer eingesetzt, sodass sich der Kegel direkt über den Zellen befindet.

Das Substrat wird durch gleichmäßiges Anziehen von Edelstahlschrauben rund um den Einstellblock fixiert. Anschließend wird das Schermaterial in die Kammer eingefüllt, wobei darauf geachtet wird, keine Luftblasen einzuschleusen. Danach wird über einen Computer das gewünschte Scherbelastungsprogramm eingegeben und der Mikrotrennmotor eingeschaltet.

Hier nutzen wir eine oszillatorische Scherbelastung von null plus/minus fünf Dyn pro Quadratzentimeter. Nach vier Stunden wird das Scherprogramm angehalten. Der Messblock wird entfernt und das Substrat vorsichtig wieder in die Petrischale zurückgelegt.

Die Zellen sind nun bereit für den Monozytenadhäsionsassay. Unmittelbar nach der Scherbelastung werden die HA-Monolagen zur Mikroskopierstation transportiert, um die VMMC zusammenzubauen. Die VMMC wird an den Vakuumschlauch angeschlossen und in entionisiertes Wasser getaucht, um Luftblasen, die in den Kanälen eingeschlossen sein könnten, zu entfernen.

Bei ausgeschalteter Vakuumsperre wird die Kammer vorsichtig auf die Monoschicht aufgesetzt und die Vakuumsperre eingeschaltet. Es ist entscheidend, sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen in den Kanälen der Kammer eingeschlossen haben. Nun werden 80 Mikroliter HBSS mit Calcium und Magnesium mit einer Pipette in ein Reservoir gegeben, das durch Abschneiden der Spitze einer 19-Gauge-Lure-Lock-Nadel hergestellt wurde. Die Flüssigkeit wird durch festes Andrücken der Oberseite des Reservoirs aus der Spitze herausgedrückt und anschließend in den Eingangsstutzen des VMMC eingeführt.

Die gesamte Vorrichtung wird auf die Mikroskopbühne gestellt, und die Mikroskopkamera sowie der Videomonitor werden eingeschaltet. Eine 10-Milliliter-Glaskolbenproette wird auf die Spritzenpumpe aufgesetzt. Anschließend wird die Schlauchleitung der Spritze mit dem Auslassstutzen des VMMC verbunden.

Die Durchflussrate wird so eingestellt, dass eine Scherspannung von einem Dyn pro Quadratzentimeter innerhalb des Kanals erzeugt wird, und anschließend im Nachfüllmodus betrieben, sodass die Spritze die Flüssigkeit über den Kanal aus dem Reservoir ansaugt. Die mit SDF-1 stimulierten T1-Zellen werden in einer Konzentration von zwei Millionen Zellen pro Milliliter suspendiert. Innerhalb von zwei Minuten nach Aktivierung des Durchflusses werden 50 Mikroliter der Zellsuspension dem Reservoir zugegeben.

Auch hier darauf achten, beim Erreichen einer vollständig ausgebildeten Strömung keine Luftblasen einzuführen. Das Video wird mit drei Bildern pro Sekunde aufgezeichnet, und die Daten werden mit der Image-J-Software erfasst. Adhärente THP-1-Zellen werden definiert als Zellen, die sich innerhalb von 10 Sekunden nicht weiter als eine halbe Zelldurchmesser bewegen.

Hier zeigen wir Daten, die die Adhäsion von THP-1-Zellen an HA-Mono-Schichten darstellen, die mit TNF-alpha stimuliert und entweder unter einer konstant hohen Wandschubspannung von 15 Dyn/cm² oder einer oszillierenden Schubspannung von 0 ± 5 Dyn/cm² konditioniert wurden. HA-Mono-Schichten, die mit oszillierender Schubspannung konditioniert wurden, wiesen eine um das Dreifache stärkere Rekrutierung von THP-1-Zellen auf im Vergleich zu Mono-Schichten, die einer hohen Schubspannung ausgesetzt waren. Heute demonstrieren wir die Anwendung anpassbarer In-vitro-Techniken, die kombiniert wichtige Einblicke in frühe entzündliche Vorgänge liefern können, die der Atherosklerose zugrunde liegen. Insbesondere quantifizieren wir Ergebnisse, die mit endothelialer Dysfunktion und Zellen assoziiert sind, die unter genau definierten hydrodynamischen Bedingungen entzündlichen Stimuli ausgesetzt wurden.

Die Verwendung von VMM-CS-Geräten ermöglicht es uns, spezifische Mechanismen der Interaktionen zwischen Endothelzellen und Leukozyten zu untersuchen. Diese Geräte bieten zudem den Vorteil, flexibel und kostengünstig zu sein, und erleichtern den Einsatz von Materialien, die möglicherweise nur in begrenzter Menge verfügbar sind, wie beispielsweise aus menschlichem Serum gewonnene Bestandteile. Unsere Untersuchungen mit diesen Geräten umfassten Analysen der durch Zytokine, Lipide und RAGE induzierten Entzündungsreaktionen in Endothelzellen.

Wir haben außerdem On-Chip-Assays entwickelt, die Adhäsionsmechanismen in mehreren Leukozyten-Typen sowie in Vollblut untersuchen. Letztendlich erwarten wir, dass diese Technologie zu ex-vivo-Ansätzen zur Beurteilung des Risikos eines Einzelnen für entzündungsbedingte kardiovaskuläre Erkrankungen führen wird.