On-Chip-Endothelial Entzündliche Phänotypisierung

Das Ziel dieses Videos ist es, eine Lab-on-a-Chip-Technik zur Charakterisierung des Entzündungszustands von Endothelzellen zu demonstrieren. Zu Beginn werden humane Aorten-Endothelzellen so gezüchtet, dass sie auf einem Gewebekultursubstrat zusammenfließen, und dann in ein Conan-Plattenschergerät eingesetzt. Die Zellen werden mit dem proinflammatorischen Zytokin TNF alpha behandelt und gleichzeitig vier Stunden lang unterschiedlichen Scherspannungsbedingungen ausgesetzt, indem die Rotation des Kegels über dem Substrat präzise gesteuert wird. Die Scherspannung moduliert eine gut charakterisierte Entzündungsreaktion auf das Zytokin.

Dazu gehört auch die Hochregulierung von Adhäsionsmolekülen wie VCA one und ICAM one. Das Substrat wird auf einen Mikroskoptisch übertragen, wo das mikrofluidische Gerät A-P-D-M-S direkt mit der Monoschicht vakuumversiegelt wird, wodurch Strömungskanäle entstehen. Aktivierte monozytäre THP-1-Zellen werden über das vorkonditionierte hs geflogen, wo sie proportional zum Grad der Zelladhäsionsmolekülexpression binden.

Der Entzündungszustand des Endothels wird durch Quantifizierung der Gesamtzahl der THP one Zellen bestimmt, die fest verriegelt sind. Hallo, mein Name ist D Diverse, und ich bin Greg Foster. Und ich bin Keith Bailey.

Wir sind in den Laboren der Professoren, des Pastors und Simons im Department of Biomedical Engineering der University of California in Davis. Heute werden wir die Verwendung eines Lab-on-a-Chip-basierten Ansatzes zur quantitativen Untersuchung von endothelialer Dysfunktion und Entzündung beschreiben. Diese Werkzeuge bieten uns eine Plattform, um Studien durchzuführen, die sich mit der Überlagerung von metabolischem Stress mit hydrodynamischen Faktoren und der Regulation des endothelialen entzündlichen Phänotyps und der Anfälligkeit für Atherosklerose befassen.

Daher bezeichnen wir unsere Geräte als vaskuläre mimetische, mikrofluidische Kammern oder vmmc. Diese Geräte ermöglichen es uns, entzündliche Ergebnisse in Endothelzellen und Monozyten unter Bedingungen zu quantifizieren, die denen in atherogenen Gefäßen ähneln. Das VMMC ermöglicht die Verwendung kleiner Mengen an Reagenzien oder Materialien, die möglicherweise nur begrenzt verfügbar sind.

Sie können auch in einer Reihe von anpassbaren Layouts und Geometrien konstruiert werden, wodurch sie sich sehr gut für eine Vielzahl von Anwendungen eignen. Heute demonstrieren wir ein repräsentatives Experiment mit unserem Lab-on-a-Chip-Ansatz. Humane endotheliale Monoschichten werden der Zytokinaktivierung unter genau definierten Scherspannungen ausgesetzt.

Wir werden die Verwendung von VMC zur Quantifizierung der Rekrutierung menschlicher monozytärer Zellen in die Monoschicht in Echtzeit demonstrieren, indem eine funktionelle Auslesung der Endothelaktivierung mit einer Drehmaschine durchgeführt wird: Drei Zoll große kreisförmige Substrate werden aus 100-Millimeter-Gewebekulturschalen gefräst. Die drei Zoll großen Substrate werden mit destilliertem Wasser gewaschen und dann durch Einweichen in 70% Ethanol sterilisiert. Sterile Substrate werden in 100 Millimeter große Petrischalen gegeben und trocknen gelassen.

Sie werden dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit Kollagen Typ 1 in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter inkubiert und mit PBS gewaschen. Humane Aorten-Endothelzellen oder HA werden in einer Konzentration von 650.000 Zellen pro Milliliter suspendiert. Ein Milliliter Zellsuspension wird in Tröpfchen auf ein getrocknetes, mit Kollagen überzogenes Substrat gegeben und in eine gleichmäßige Suspension verteilt.

Sitzende Substrate werden dann in einen 37 Grad heißen 5%CO2-Inkubator gelegt und an der Substratoberfläche befestigt. Nach einer Stunde werden neun Milliliter E GM zwei Wachstum, Medium hinzugefügt und die Zellen werden zu Monoschichten mit etwa 90% Co-Fluenz heranwachsen gelassen. Vaskuläre mimetische mikrofluidische Kammern werden konstruiert, indem die A-P-D-M-S-Form über eine Urform gegossen wird, die den gewünschten Kanal umfasst. Geometrie.

Die Silikonbasis wird in ein Kunststoffschiffchen gegossen, gefolgt von dem Silikonhärtungsmittel in einem Verhältnis von 10 zu eins nach Gewicht. Das PDMS-Gel wird dann gut vermischt, wobei darauf geachtet wird, dass die Seiten des Wegbootes nicht abkratzen und dadurch Kunststoffspäne in die Mischung gelangen. Fotolack-Master werden mit Hexan gereinigt und für die Formgebung des VMMC vorbereitet.

Die PDMS-Mischung wird dann über die Masterform gegossen und dann in eine Vakuumkammer gegeben. In der Kammer. Luft wird aus dem PDMS-Gemisch entfernt und steigt nach 15 Minuten an die Oberfläche.

Die Form wird aus der Kammer entnommen und die Luft wird sanft über die PDMS-Oberfläche geblasen, um die verbleibenden Luftblasen aus der Form zu entfernen. Die Form wird dann abgedeckt und für eine Stunde in einen 37-Grad-Ofen gestellt, wo das PMS aushärten kann. Nehmen Sie das erstarrte PDMS-Gel aus dem Ofen und machen Sie mit einem kleinen Skalpell kreisförmige Schnitte um die Kammer.

Es ist wichtig, dies schrittweise zu tun, um den Kontakt mit dem Fotolackmaterial zu vermeiden, da dies die Urform beschädigt. Entfernen Sie die mikrofluidische Kammer aus den Einlass- und Auslassöffnungen der Formstanze für jeden Kanal mit einer 19-Gauge-Köderverschlussnadel. Stanzen Sie zusätzlich Löcher für die Vakuumröhren weg von den Kanälen.

Die Vorbereitung für die VMMC ist nun abgeschlossen. Pipettieren Sie das entzündungsfördernde Zytokin TNF alpha in sechs Milliliter L 15-Medien, um eine Endkonzentration von 0,5 Nanogramm pro Milliliter zu erreichen. Als Scherflüssigkeit wird hier L 15 als Scherflüssigkeit verwendet, da es einen pH-Puffer von 5 % CO2 aufweist.

Das Medium wird dann in eine sterile 10 Milliliter Spritze gezogen, die zum Beladen der Schervorrichtung verwendet wird. Die Confluent-Monoschicht wird dann auf die Zellschervorrichtung übertragen, die mit Ethanol nivelliert und die Kegelspalthöhe eingestellt wurde. Das Substrat wird aus der Petrischale entnommen und zentriert auf den Glasmessblock gelegt und vorsichtig in den Boden der Gehäusekammer eingeführt, so dass sich der Konus direkt über den Zellen befindet.

Die Sicherung des Substrats erfolgt durch gleichmäßig anziehende Edelstahlschrauben um den Endmaß. Das Schermedium wird dann in die Kammer geladen, wobei darauf geachtet wird, dass keine Luftblasen entstehen. Als nächstes wird ein Computer verwendet, um das gewünschte Schubspannungsprogramm einzugeben, und der Mikro-separate Motor wird eingeschaltet.

Hier verwenden wir eine oszillatorische Scherung von null plus oder minus fünf Diens pro Quadratzentimeter. Nach vier Stunden wird das Scherprogramm gestoppt. Der Messblock wird entfernt und das Substrat vorsichtig wieder in die Petrischale eingesetzt.

Die Zellen sind nun bereit für den Monozyten-Adhäsionsassay. Unmittelbar nach dem Scheren werden die HA-Monoschichten zur Mikroskopstation transportiert, wo sie am VMMC montiert werden. Das VMMC wird am Vakuumschlauch befestigt und in DI-Wasser getaucht, um alle in den Kanälen eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen.

Wenn das Vakuumventil zunächst ausgeschaltet ist, wird die Kammer vorsichtig auf die Monoschicht gedrückt und das Vakuumventil eingeschaltet. Dabei ist darauf zu achten, dass keine Luftblasen in den Kanälen der Kammer eingeschlossen sind. Nun werden 80 Mikroliter HBSS mit Kalzium und Magnesium in ein Reservoir pipettiert, das durch Abschneiden der Spitze eines 19-Gauge-Köders hergestellt wird. Lock-Nadelflüssigkeit wird aus der Spitze gedrückt, indem die Oberseite des Reservoirs fest gedrückt wird, die dann in die Einlassöffnung des VMMC eingeführt wird.

Die gesamte Baugruppe wird auf den Mikroskoptisch gestellt und die Mikroskopkamera und der Videomonitor werden eingeschaltet. Eine 10-Milliliter-Glasspritze wird auf die Spritzenpumpe geladen. Als nächstes wird der Spritzenschlauch mit dem Auslassanschluss des VMMC verbunden.

Die Durchflussrate ist so eingestellt, dass sie eine reine Spannung von einem Zentimeter pro Quadratzentimeter innerhalb des Kanals induziert und dann im Nachfüllmodus läuft, so dass die Spritze Flüssigkeit aus dem Reservoir durch den Kanal zieht. Th P one Zellen, die mit SDF one stimuliert werden, werden in einer Konzentration von 2 Millionen Zellen pro Milliliter suspendiert. Innerhalb von zwei Minuten nach der Aktivierung des Durchflusses werden 50 Mikroliter Zellsuspension in das Reservoir gegeben.

Auch hier ist darauf zu achten, dass keine Luftblasen entstehen, wenn sich die Strömung vollständig entwickelt. Das Video wird mit drei Bildern pro Sekunde aufgenommen und die Daten werden mit der Image J-Software aufgezählt. Anhänger. THP one Zellen sind definiert als Flüssigkeiten, die sich in 10 Sekunden nicht mehr als einen halben Zelldurchmesser bewegen.

Hier zeigen wir Daten, die die Adhäsion von THP one an ha-Monoschichten darstellen, die mit TNF alpha stimuliert und entweder unter einer konstant hohen Wandscherspannung von 15 Dies pro Quadratzentimeter oder einer oszillatorischen Scherspannung von null plus oder minus fünf Diens pro Quadratzentimeter konditioniert wurden, dass Ha-Monoschichten, die mit oszillatorischer Scherspannung konditioniert wurden, eine dreimal höhere TP-Ein-Zell-Rekrutierung aufwiesen als Monolayer, die eine hohe Scherspannung erfuhren. Heute demonstrieren wir den Einsatz von anpassbaren in vitro Techniken, die kombiniert werden können, um wichtige Einblicke in frühe Entzündungsereignisse zu erhalten, die Atherosklerose zugrunde liegen. Insbesondere quantifizieren wir Ergebnisse, die mit endothelialer Dysfunktion und Zellen verbunden sind, die Entzündungsreizen unter genau definierten hydrodynamischen Bedingungen ausgesetzt sind.

Der Einsatz von VMM CS ermöglicht es uns, spezifische Mechanismen zu untersuchen, die den Wechselwirkungen zwischen Endothel und Leukozytenadhäsion zugrunde liegen. Diese Geräte haben auch den Vorteil, dass sie flexibel und kostengünstig sind und die Verwendung von Materialien erleichtern, deren Angebot begrenzt sein kann, wie z. B. aus Serum gewonnene Komponenten von menschlichen Probanden. Unsere Studien mit diesen Geräten umfassten Untersuchungen von Zytokin-, Lipid- und Wut-induzierten Entzündungen in Endothelzellen.

Wir haben auch On-Chip-Assays entwickelt, die die Adhäsionsmechanismen in mehreren Leukozytentypen sowie im Vollblut untersuchen. Letztendlich stellen wir uns vor, dass diese Technologie zu Ex-vivo-Ansätzen zur Bewertung des individuellen Risikos für entzündungsvermittelte Herz-Kreislauf-Erkrankungen führen wird.