Verfahren zur Identifizierung von Infektions Prionen Nach Passage durch das Verdauungssystem von eine Vogelart

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Passage von infektiösem PreOn-Material durch das Verdauungssystem von Amerikanischen Krähen zu dokumentieren. Dies wird erreicht, indem die Krähen zunächst mit infektiösem PreOn-Material gemessen werden. Der zweite Schritt besteht darin, den Krähenkot vier Stunden nach der Sonde zu sammeln und für die Injektion in Mäuse vorzubereiten.

Als nächstes werden die Mäuse intraperitoneal mit einem Milliliter Krähenkothomogenat inokuliert. Der letzte Schritt besteht darin, die Mäuse täglich zu überwachen, bis sie klinische Anzeichen von Mauskratzen zeigen. Letztendlich wird die Western-Blot-Analyse verwendet, um das Vorhandensein von infektiösem PreOn im Mausmodell zu bestätigen und die Krankheitsübertragung zu verifizieren.

Die Idee, dass Krähen transportieren könnten. CWD kam eines Wintertages zu uns, als wir nach der Fahrt zu einer Elchanlage in Gefangenschaft, wo wir einige Nachforschungen anstellten, und sahen, wie Elche von Krähen gefüttert wurden, und später an diesem Tag Krähen, die aus dem Nichts aus dem Himmel kamen, in diesen Futtertrögen landeten, direkt neben dem Elch fraßen, auf das Getreide koteten, das die Elche fraßen, zusätzlich zu der Beobachtung aus der Literatur, dass viele der Elche Krähen in diesem Sommer in Colorado, Wyoming, überwintern in einem konzentrierten Gebiet in New Mexico, es ist einfach so, dass dieses Gebiet in New Mexico das ist, wo etwas CABD aufgetaucht ist, und es ist hundert, eine Meile, Hunderte von Meilen vom Epizentrum der Crack-Wasting-Krankheit entfernt. Diese beiden Beobachtungen brachten uns zu der Annahme, dass Krähen möglicherweise eine Rolle beim Transport von CWD in der Landschaft spielen könnten.

Eine visuelle Demonstration dieser Techniken ist von entscheidender Bedeutung, da falsche intraperitoneale und orale Sondentechniken zum Tod der Versuchstiere führen können. Geben Sie zu Beginn vier Tropfen blauen Farbstoff zu einem Rührei und mischen Sie es gut. Ziehen Sie dann fünf Milliliter der Farb- und Eimischung in eine zwei Zoll große Sondennadel, wobei eine Person die Krähe vorsichtig zurückhält.

Öffne den Schnabel der Krähe weit genug, um in ihren Rachen zu sehen, und führe die Sondennadel vorsichtig in ihre Speiseröhre ein. Wenn eine veränderte Atmung festgestellt wird, entfernen Sie die Spritze und versuchen Sie es erneut, da sie möglicherweise in die Luftröhre eingesetzt wurde. Sobald Sie sicher sind, dass sich die Sondennadel in der Speiseröhre befindet, drücken Sie den Inhalt der Spritze langsam aus.

Kontrollieren Sie die Krähe alle 30 Minuten, bis der blau-grün fleckige Kot nicht mehr ausgeschieden wird. Die Testkrähen brauchten etwa vier Stunden, um aufzuhören, blau gefärbten Kot auszuscheiden. Als nächstes fügen Sie einen Teil nicht infiziertes C 57 schwarzes Sechs-Mäuse-Gehirn zu vier Teilen sterilem PBS und einige Glasperlen in einen Bullet Mixer hinzu.

Mit dem Homogenisator wird die Probe ein bis fünf Minuten lang homogenisiert, bis die glatte Konsistenz erreicht ist. Wiederholen Sie den Vorgang mit unheilbar kranken R ML Chandler Stamm infizierten C 57 schwarz sechs Mausgehirnen. Anschließend zentrifugieren Sie das Homogene bei 3000 mal G für eine Minute.

Um den größeren Feinstaub zu entfernen. Entfernen Sie dann den Überstand und verdünnen Sie ihn mit einem gleichen Volumen sterilem XPBS, um ein Gewicht von 10 % pro Volumen Gehirnsubstanz zu erzeugen. Lagern Sie die Proben in PBS bei minus 80 Grad Celsius, bis sie 17 Stunden vor der Entnahme benötigt werden.

Entferne das Futter, aber nicht das Wasser aus den Krähenställen. Ordnen Sie die Krähen nach dem Zufallsprinzip in Behandlungsgruppen ein und ordnen Sie jede Krähe mit fünf Millilitern frisch aufgetautem, normalem oder infiziertem Mausgehirn-Homogenat mit einer zwei Zoll großen Sondennadel oral ein. Anschließend werden die Krähen in einzelne Käfige umgesiedelt.

Sammeln und sammeln Sie alle Fäkalien in jedem Käfig vier Stunden nach der Sonde. Als nächstes wird der gesammelte Kot für jede Krähe in einem blauen Homogenisator mit Glasperlen homogenisiert, bis eine gleichmäßige Textur erreicht ist. Nehmen Sie dann 500 Mikroliter der Mischung und verdünnen Sie sie 15 Minuten lang mit 9,5 Millilitern steriler PBS-Zentrifuge, dem verdünnten Stuhlhomogenat.

Fügen Sie 1, 300 mal G hinzu und geben Sie dann den Überstand in ein frisches Röhrchen. Um die Gefahr einer sekundären mikrobiellen Infektion zu minimieren, fügen Sie eine Einheit Penicillin und ein Mikrogramm Streptomycin pro Milliliter Homogenat hinzu. Dann beschallen Sie die Proben in einem 3000-MP-Ator bei einer Leistungseinstellung von 70 für 30 Sekunden, um die Membran der verbleibenden Mikroben zu zerstören.

Zuerst ordnest du die Mäuse nach dem Zufallsprinzip einer der vier hier gezeigten Gruppen zu. Gruppe eins erhält infizierten Krähenkot. Gruppe zwei erhält nicht infizierten Krähenkot.

Gruppe drei erhält infiziertes Mäusegehirn und Gruppe vier erhält normales Mäusegehirn. Ziehen Sie dann für die MN-Gruppen eins und zwei einen Milliliter des kratzigen positiven oder kratzigen negativen Krähenkots auf. Homogenisieren Sie mit einer 25-Gauge-Nadel entsprechend der Gruppennummer der Maus.

Ziehen Sie dann die Maus an ihrem dorsalen Halsfell auseinander und drehen Sie sie mit Daumen und Zeigefinger vorsichtig, um die Bauchseite freizulegen. Heben Sie das hintere Ende der Maus an, so dass der Kopf etwas tiefer liegt.

Führen Sie die Nadel einen Zentimeter durch die Haut, einen Zentimeter lateral der Mittellinie und ein bis zwei Zentimeter vor dem Iliosakralgelenk ein. Ziehen Sie sich dann leicht zurück und injizieren Sie das Homogene langsam in die Körperhöhle der Maus. Als nächstes bereiten Sie das gefrorene Homogenat des Mausgehirns mit und ohne Scrappy für die Injektion in die Tiere der Gruppen drei und vier vor.

Indem zuerst die Haws Stoffmischungen eins bis 10 mit sterilem PBS verdünnt werden. Injizieren Sie dann einen Milliliter des verdünnten kratzigen positiven Gehirnhomogenats in Mäuse der Gruppe drei und einen Milliliter des verdünnten kratzigen negativen Gehirnhomogenats in die Mäuse. In Gruppe vier.

Überwachen Sie die Mäuse täglich, bis sie klinische Anzeichen von Mauskratzen zeigen. Klinische Symptome können Kyphose, Ataxie, steifer Schwanz, mangelnde Fellpflege, Abmagerung und Lethargie sein. Bewerten Sie meine tägliche Bewertung für jedes der sechs klinischen Anzeichen.

Wenn sichtbare Zeichen erkennbar sind. Null bedeutet keine sichtbaren Zeichen. Eins ist gleich mäßig und zwei entspricht einem schweren Grad eines Zeichens.

Euthanasieren Sie Mäuse, wenn die täglichen Gesamtwerte für jedes Anzeichen an einem Tag größer oder gleich acht oder gleich sechs kontinuierlich für drei Tage oder nach 365 Tagen größer oder gleich acht erreichen. Entnehmen Sie nach der Impfung unmittelbar nach der Euthanasie Gehirne und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Entsorgen Sie dann die Kadaver ordnungsgemäß, um eine unklare Diagnose zu bestätigen.

Tauen Sie die gefrorenen Mäusegehirne auf und homogenisieren Sie sie einzeln in einem Blue Bullet Homogenisator mit Glasperlen, bis eine gleichmäßige Textur erreicht ist. Bereiten Sie als nächstes 125 Mikroliter einer Proteinase-K-Aufschlusslösung her, indem Sie 109,39 Mikroliter PBS mit 12,5 Mikrolitern 500 Millimolar EDTA bei pH acht und 3,1 Mikrolitern einer 50 Mikrogramm pro Milliliter Proteinase K-Lösung kombinieren. Geben Sie dann drei Mikroliter der Verdauungslösung auf 17 Mikroliter des Gehirns. Homogenisieren.

Inkubieren Sie die Proben bei 45 Grad Celsius auf einem Schüttelheizblock für 30 Minuten. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, inaktivieren Sie die Aufschlusslösung durch Zugabe von acht Mikrolitern SDS-Seitenladepuffer und inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Laden Sie dann die Beispiele auf eine 12%-SDS-Seite.

Gelelektrophorese der Proteine und Übertragung des Gels auf eine IMON PVDF-Membran Nach dem Transfer blockieren Sie die PVDF-Membran mit 5 % fettfreier Milch in PBS mit 0,2 % zwischen 20 und einem Gestein für eine Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird die Membran mit Borrow 224 und monoklonalem IPRP-Antikörper untersucht, der an Meerrettichperoxidase konjugiert ist, verdünnt um eins auf 20.000 in Superblock und Gestein für eine Stunde bei Raumtemperatur nach der Inkubation. Spülen Sie die Membran eine Stunde lang in PBS mit 0,2% zwischen 20.

Visualisieren Sie die Proteine, indem Sie die Membran fünf Minuten lang mit chemilumineszierendem Substrat inkubieren. Anschließend wird die Membran auf einem G-Box-Gel-Dokumentationssystem abgebildet. Erkrankte Mäuse wurden durch die Manifestation klinischer kratziger Maussymptome identifiziert und die Krankheitsbestätigung wurde durch westliche Blutanalyse abgeschlossen.

Normales Mausgehirn homogen ohne Kratzer, hier links zwei Fahrspuren mit und ohne Zuhilfenahme der Protease K dargestellt Ohne Protease K sind drei Kurven zu sehen. Da das normale Protein jedoch anfällig für Proteinasen ist, sind die Biegungen in der zweiten Spur nicht zu sehen. Spur drei zeigt eine proteaseverdaute kratzige Positivkontrollprobe.

Die Proteasen verursachen eine Verschiebung der drei ursprünglichen Banden aufgrund des Verlusts der n- und c-Termini der Proteine. Die infizierten Proteine können jedoch nicht vollständig verdaut werden, wie es in der normalen Gehirnprobe der Fall war. Das mit Proteinase K verdaute Gehirn einer Maus, die mit dem Kot einer geimpften Krähe geimpft wurde, ist rechts dargestellt und bestätigt das Vorhandensein von Prionen in der Probe, da die Banden nicht verdaut werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie Sie die Passage von infektiösem Prionenmaterial durch das Verdauungssystem von Krähen dokumentieren können. Überprüfen Sie dann die Infektiosität mit einem interperitonealen Maus-Bioassay.