Nachweis abnormaler Prionenproteine im Hirngewebe mittels Immunhistochemie

Machen Sie einen Dia mit einem fixierten Säugetierhirnschnitt, der fehlgefaltete Prionproteinaggregate aufweist.

Behandeln Sie den Abschnitt mit Ameisensäure, um die Infektiosität der Prionenaggregate zu verringern.

Mit einem sauren Puffer in einer hydratisierten Druckkammer behandeln. Eine hohe Hitze und ein saurer pH-Wert brechen fixierungsinduzierte Proteinvernetzungen und entlarven die antigenen Epitope.

Tauchen Sie in Wasserstoffperoxid ein, um die endogene Peroxidase zu inaktivieren und unerwünschte Hintergrundfärbungen zu verhindern.

Legen Sie den Objektträger in eine Abdeckplatte und fügen Sie einen Puffer hinzu, um die Hydratation des Gewebes aufrechtzuerhalten.

Führen Sie eine Blockierungslösung ein, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Fügen Sie einen primären Antikörper hinzu, der spezifisch für die Prionenaggregate ist.

Entfernen Sie die ungebundenen Antikörpermoleküle. Führen Sie einen biotinylierten Sekundärantikörper ein, der an den Primärantikörper bindet.

Entfernen Sie die ungebundenen Antikörpermoleküle. Fügen Sie ein biotinyliertes Peroxidase-Enzym hinzu, das mit Avidin komplexiert ist und an Biotin auf dem Sekundärantikörper bindet.

Fügen Sie ein chromogenes Substrat hinzu, das die Peroxidase zu einem farbigen Produkt oxidiert.

Beobachten Sie die verfärbten Aggregate mit einem Mikroskop.

Tauchen Sie die Gewebeschnitte vorsichtig 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 98%ige Ameisensäure. Spülen Sie die Abschnitte 5 Minuten lang mit Leitungswasser ab und spülen Sie sie anschließend zweimal mit destilliertem Wasser ab. Verwenden Sie einen Färbebehälter aus Edelstahl in der Druckkammer, der mit 500 Millilitern destilliertem Wasser gefüllt ist, um 10 Millimolar Citrat Puffer bei 98 Grad Celsius für 20 Minuten vorzubehandeln.

Legen Sie zu Qualitätskontrollzwecken ein Stück selbstklebendes Autoklav-Anzeigeband auf den Korb, um die Temperatur und den Druck zu überwachen. Sobald der Alarm anzeigt, dass das Gerät die Programmzeit und -temperatur erreicht hat, tauchen Sie den Korb mit Rutschen ein. Starten Sie als Nächstes das Programm in der Druckkammer, um den zweiten Punkt einzustellen, und zeichnen Sie den Anfangs- und Enddruck dieses Programms auf.

Für die Inaktivierung der endogenen Peroxidase tauchen Sie den Objektträgerkorb mit den Probenschnitten 30 Minuten lang in ein Bad mit 3%igem Wasserstoffperoxid in Methanol. Spülen Sie die Abschnitte 5 Minuten lang unter fließendem Wasser ab. Tauchen Sie die Abschnitte nach dem Abtropfen für weitere 5 Minuten in mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung. Für die Immundetektion legen Sie jeden Objektträger auf einen handelsüblichen Abdeckplattenhalter, der mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung vorbefeuchtet ist.

Wenn die Taschentuchseite zum Halter zeigt und die Gleitkanten mit den beiden unteren Punkten des Halters übereinstimmen, achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden. Halten Sie die Schieberhalterung zwischen Daumen und Zeigefinger. Halten Sie einen Finger auf dem Objektträger und den anderen auf der Unterseite des Halters. Platzieren Sie dann die Baugruppe in der Galerie des Systems.

Um sicherzustellen, dass das Set gut zusammengebaut ist, füllen Sie die Vertiefung zwischen dem Objektträger und dem Halter mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, ohne dass sie überläuft. Achten Sie ab diesem Zeitpunkt darauf, dass ca. 80 Mikroliter Tris-gepufferte Kochsalzlösung zwischen dem Halter und dem Objektträger aufbewahrt werden müssen. Lassen Sie die Abschnitte nicht trocknen.

Verringern Sie die Hintergrundfärbung vor der Behandlung mit dem primären Antikörper, indem Sie die Objektträgerproben 30 Minuten lang mit 20 % normalem Serum von derselben Spezies wie der sekundäre Antikörperwirt in Tris-gepufferter Kochsalzlösung vorinkubieren. Ohne die Schnitte zu waschen, werden 200 Mikroliter der Primärantikörperlösung direkt in jede Vertiefung des Objektträgerhalter-Sets gegeben und 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.

Um die Abschnitte zu waschen, füllen Sie die Vertiefungen mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung und warten Sie 5 Minuten. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal. Als nächstes verdünnen Sie den biotinylierten Sekundärantikörper in einer Konzentration von 1 bis 200 in trisgepufferter Kochsalzlösung mit 10 % Pferdeserum.

Reparieren Sie das erforderliche Volumen, abhängig von der Anzahl der zu behandelnden Abschnitte. Tragen Sie 200 Mikroliter Sekundärantikörperlösung auf jede Vertiefung des Objektträgerhalter-Sets auf. Wiederholen Sie nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur die Waschung mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung.

Für die Inkubation mit Avidin-Biotin-Komplexperoxidase bereiten Sie das Reagenz 30 Minuten vor Gebrauch vor und tragen Sie 200 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung des Objektträgerhalters auf. Wenn Sie fertig sind, inkubieren Sie den Tellerhalter 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.