Name: Intramyokardiale Zell Lieferung: Beobachtungen im Herzen Murine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Erfahren Sie die intramyokardiale Zelllieferung in murinen Herzen zur Untersuchung kardiovaskulärer Zelltherapien. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung injizierter Zellen eine Woche nach der Transplantation.

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Wir danken der Magdi Yacoub Institute (MYI) zum Tragen mikroskopische Analyse und die Projekte mit Herz Reparatur, die Techniker und die Manager der unsere Tieranlage. Diese Arbeit wurde von der British Heart Foundation (BHF), Projekt PG/10/019 Zuschuss unterstützt. MPS wird von der BHF MYI und unterstützt. TP ist ein BHF-Research Excellence Fellow. NR eine NH &amp; MRC Australien Fellow.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit internationalen (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments) und nationale (UK Home Office, Act 1986) Bestimmungen durchgeführt. Die hier beschriebenen Verfahren sind Teil unseres Arbeitsplan nach britischem Lizenz Behörden und wurden nicht zum Zwecke der Aufnahme durchgeführt. 1. Herstellung von Zellen Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer bestimmten Zelllinie (Human Embryonic Kidney, HEK293-Zellen) zu Demonstrationszwecken. Zell-spezifische Protokolle müssen für wachsende und schließlich differen pluripotente oder adulte Stammzellen in spezifische Zelllinien verwendet werden. <ol><li> Wachsen Zellen in DMEM-Medium (hohe Glucose, 4,500 mg / l) mit 1% Natriumpyruvat, 2 mM Glutamin, 1% Antibiotikum Pen / Strep und 10% fötalem Rinderserum (FBS). Ein 10-cm-Platte sollte in der Regel 01.03 aufgeteilt und Medien ergänzt Frisch alle zwei Tage. </li><li> Gönnen Zellen leicht mit trypsin 1x und resuspendieren in DMEM-Medium, wie in einem 1:1 beschrieben. </li><li> Zählen von Zellen in einem Hämozytometer-Kammer und sammeln 3 x 10 6 Zellen in ein separates Röhrchen. </li><li> Zentrifuge in einem Ausschwingrotor bei 100 g für 5 min. </li><li> Überstand verwerfen und waschen das Zellpellet mit sterilem Phosphatpuffer 2x. </li><li> Resuspendieren in PBS 1x in einer Konzentration von 10 6/50 &amp;mgr; l zur Injektion in den linken Ventrikel des immunodepleted Mäusen. </li></ol> 2. Prächirurgische AGB <ol><li> Aufrechterhaltung immunodepleted Mäusen (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) mit sterilem Futterpellets und Wasser in einem temperaturgeregelten Isolator (22 ° C; Tabelle 1) vor jeder Operation. </li><li> Führen Chirurgie immunodepleted Mäuse unter einer Steril. Reinigen Sie die Arbeitsfläche mit 70% Ethanol und Autoklavieren chirurgische Werkzeuge (Zange und Schere). </li><li> Schalten Sie Heizkissen für die Chirurgie und für die Wiederherstellung. Heizkissen sind wichtigum die Abnahme der Körpertemperatur auftreten, während und nach der Operation zu blockieren. </li><li> Einen sauberen und autoklaviertem Käfig auf die Rückgewinnung-Heizkissen. </li><li> Transportieren Sie die Mäuse in ihrem ursprünglichen Käfige aus dem Isolator zu dem Operationssaal in einen sterilen Beutel autoklaviert. </li><li> Wiegen Sie die Maus und nach dem Körpergewicht inject subkutan (sc) eine Lösung, Medetomidin und Ketamin-Hydrochlorid in 0,9% steriler Kochsalzlösung verdünnt, um die Maus zu betäuben enthält, sowie auf die Muskeln entspannen (Medetomidin 1 mg / kg Ketamin-Hydrochlorid 75 mg / kg). </li><li> Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig, wenn sie vollständig betäubt (innerhalb von 1-2 min, keine Zehen Prise Reflex nach Stimulation) </li><li> Bewerben Enthaarungscreme auf der linken Seite der Brust und den Hals-Bereich. Nach einer angemessenen Zeit (ca. 2-5 min), wischt die losen Haare mit einem mit Wasser nass Gewebe. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem OP-Panel in Rückenlage. AusSicht des Chirurgen eine vertikale Position erreicht, Schwanz-Kopf nach unten. </li><li> Spritzen Sie Analgetikum Lösung bei 0,1-0,2 g / g in steriler Kochsalzlösung (Buprenorphin) verdünnt in die hinteren Gliedmaßen subkutan und decken den rasierten Bereich mit der aseptischen Lösung Povidoniod mit einem Wattestäbchen. </li><li> Fokus des Mikroskops (2,5 fach Objektiv) auf den Hals-Bereich. </li></ol> 3. Chirurgische AGB <ol><li> Mit stumpfen Schere einen ventralen Mittellinie Hautschnitt von etwa 0,5 bis 1 cm Länge, die etwas unterhalb des Ringknorpels. Trennen Sie die Haut von Bindegewebe um die Speicheldrüsen zu visualisieren. </li><li> Teilen Sie die Speicheldrüsen auf ihren natürlichen Mittellinie Division durch gleichzeitiges Ziehen jedes Teil seitlich mit Pinzette und Magnet Brust Retraktor und setzen die Luftröhre. </li><li> Ziehen Sie die Zunge sanft zur Seite, um den Kehlkopf aus. Schieben Sie die Intubationstubus vorsichtig in die Luftröhre. Die Rohrspitze ist durch die angezeigte l sichtbararynx und Luftröhre. Wichtiger ist, wenn das Rohr in, aber nicht deutlich sichtbar ist, ist es in der Speiseröhre. Entfernen Sie es und ändern Sie die Position der Rohrspitze. </li><li> Schließen Sie den Schlauch an den Lüftungs Maschine. Stellen Sie das Schlagvolumen bei 200 ul und 150 Hub / min. Befestigen Sie die Lüftungsschlauch auf dem OP-Panel mit einer Band. </li><li> Mit stumpfen Schere und Pinzette, machen Sie eine vertikale Schwanz zum Kopf 1 - bis 1,5 cm langen Hautschnitt über der linken Thoraxbereich. </li><li> Lösen Sie die Haut vor den Bindegewebs-/ Muskelschichten und die großen und kleinen Brustmuskeln ohne Einschnitte. </li><li> Führen Thorakotomie zwischen der dritten und vierten Rippen sich wie folgt: <ol><li> Perforieren die Zwischenrippenmuskelschicht durch Kneifen und Kratzen mit kleinen, abgerundeten Pinzette. </li><li> Sobald die Zwischenrippenmuskelschicht ist perforiert, legen Sie die Brust Retraktor bis maximal öffnen Sie die Brusthöhle. Die oberen und mittleren Teile des linken Ventrikels (LV) mit darüberliegenden Vorhof (Atrium) sindjetzt sichtbar. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine Präzisionsspritze mit Zellen. Die Spritze ist in der Lage, eine Menge an Volumen von 10 ul für jede Injektion zu liefern. Werfen Sie einen 30 G Nadel an der Spitze der Spritze. </li><li> Fix mit Band eine kleine Kunststoffkanüle (von einem Introcan-W 20 G) an der Nadel, so dass nur 1 mm ausgesetzt, einschließlich der offenen Spitze der Nadel. Dadurch wird die Nadel aus Perforieren des gesamten linken ventrikulären Wand und die Injektion der Zellen in die linke Herzkammer Hohlraum zu verhindern. </li><li> Mit Hilfe eines 5X Ziel, visualisieren bei dieser Vergrößerung der linken Herzkammer und injizieren die Zellen in der linken Herzkammerwand in 5 verschiedenen Standorten (jeweils 10 ul Injektion wird für insgesamt 106 Zellen injiziert liefern). Wenn die Einspritz erfolgreich ist, wird eine weiße Fläche und die Abwesenheit von großen Rückspülung der Zellen sichtbar ist (wenn die Einspritz nicht erfolgreich war, würde das Tier von der funktionalen Analyse ausgeschlossen werden.) </li><li> Entfernen Sie den Aufroller. Schließen Sie die Brustwand by umschließt die beiden getrennten Rippen mit zwei Maschen von 6-0 Seidenfaden. </li><li> Befeuchten Sie die Brustmuskeln und die Haut mit einem Wattestäbchen in PBS 1x durchnässt und legte sanft die Muskeln wieder in die Ausgangsposition mit der Zange. </li><li> Schließen Sie die Haut mit 3-4 Stichen von 6-0 Seidenfaden. Naht der Kehle Schnitt mit 2-3 Stichen, um die Haut zu schließen. </li><li> Inject Atipamezol (1 mg / kg Endkonzentration), um die betäubende Wirkung zurück. </li><li> Sobald die Maus selbstständig zu atmen beginnt, nehmen Sie den Schlauch aus der Luftröhre und setzen Sie die Maus auf die rechte Seite. Die Maus wird erwartet, dass innerhalb von Minuten wiederherstellen. </li><li> Wenn die Maus beginnt sich zu drehen und zu Fuß, legen Sie sie in der warmen Erholungskäfig (kleine IVC-Käfig mit geschlossenen gefilterte oben) für eine Stunde. </li><li> Lassen Sie die Tiere über Nacht in einem geregelten beheizten Feld (37 ° C). </li><li> Füllen Sie eine Schüssel mit Wasser und Pellet Essen zur Erholung während der ersten 2 Tage nach der Operation zu unterstützen. </li></ol> Zehn Herzen mit Zellen und 10 Kontroll nicht gespritzt Herzen injiziert werden histologisch wie folgt analysiert: <ol><li> Führen Analyse der transplantierten Zellen von 1 Woche nach Injektion (Fig. 1 und 3). <ol><li> Nach Euthanasie durch Überdosierung von Isofluran, durchströmen die Herzen mit 20 ml 4% Paraformaldehyd (PFA), um das Gewebe zu beheben. Entwässern der festen Gewebe in steigenden Prozentsätzen von Ethanol (70-100%) und in Paraffinblöcke einbinden. </li><li> § die Herzen in Paraffin mit einem Mikrotom in 5 um und Fleck mit Hämatoxylin und Eosin für die morphologische Analyse. </li><li> Visualisieren Bindegewebe durch die Verwendung Masson Trichrome Fleck. </li><li> Analysieren Sie die Bilder unter einem Dia-Scanner-Mikroskop (1A, 2A, 3A, 3B und 3C) und zu visualisieren, das gesamte Herz in kurzen Achse mit einem digitalen Mikroskop-Dia-Scanner (Figures 1B und 1C). </li></ol></li><li> Nachdem die obigen Analysen entparaffinieren Herzgewebe in Xylol rehydrieren Proben durch Eintauchen in abnehmProzente Ethanol (100% Wasser) und Verfahren für die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wie folgt: <ol><li> Inkubieren entparaffinierten Blöcke mit 1% Gerbsäure in 0,1 M Phosphatpuffer für 1 Stunde. </li><li> Entwässern Proben bei der Erhöhung der Prozentsätze Ethanol (25-100%). </li><li> Trockenproben mit HMDS (Hexamethyldisilazan). </li><li> Montieren Sie die Proben auf Stubbs mit Acheson Silber Dag und überziehen sie mit Gold-Palladium. </li><li> Anwendungsbeispiel in einem analytischen Rasterelektronenmikroskops (Fig. 2B). </li></ol></li></ol>

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<li>Bartunek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+injection+of+CD133-positive+enriched+bone+marrow+progenitor+cells+promotes+cardiac+recovery+after+recent+myocardial+infarction%3A+feasibility+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety.</a> Circulation. 112, 178-183 (2005).</li>
<li>Britten, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infarct+remodeling+after+intracoronary+progenitor+cell+treatment+in+patients+with+acute+myocardial+infarction+%28TOPCARE-AMI%29%3A+mechanistic+insights+from+serial+contrast-enhanced+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Infarct remodeling after intracoronary progenitor cell treatment in patients with acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI): mechanistic insights from serial contrast-enhanced magnetic resonance imaging.</a> Circulation. 108, 2212-2218 (2003).</li>
<li>Smits, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catheter-based+intramyocardial+injection+of+autologous+skeletal+myoblasts+as+a+primary+treatment+of+ischemic+heart+failure%3A+clinical+experience+with+six-month+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 42, 2063-2069 (2003).</li>
<li>Kang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intracoronary+infusion+of+peripheral+blood+stem-cells+mobilised+with+granulocyte-colony+stimulating+factor+on+left+ventricular+systolic+function+and+restenosis+after+coronary+stenting+in+myocardial+infarction%3A+the+MAGIC+cell+randomised+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem-cells mobilised with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarction: the MAGIC cell randomised clinical trial.</a> Lancet. 363, 751-756 (2004).</li>
<li>Fernandez-Aviles, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+clinical+regenerative+capability+of+human+bone+marrow+cells+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction.</a> Circ. Res. 95, 742-748 (2004).</li>
<li>Vulliet, P. R., Greeley, M., Halloran, S. M., MacDonald, K. A., Kittleson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-coronary+arterial+injection+of+mesenchymal+stromal+cells+and+microinfarction+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Intra-coronary arterial injection of mesenchymal stromal cells and microinfarction in dogs.</a> Lancet. 363, 783-784 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In diesem Manuskript haben wir gezeigt, wie man intramyokardialen Injektion von Zellen in murinen Herzen durchzuführen. Als Beweis dieser Methodik haben wir HEK293-Zellen verwendet. Es ist wichtig zu betonen, dass HEK293-Zellen sind nicht in einer Zelltherapie Studie verwendet und damit die Ergebnisse des Manuskripts für die direkte Übersetzung zu einem therapeutischen Ansatz nicht geeignet sind. Die Tatsache, dass HEK293-Zellen nicht kontraktilen Zellen und nicht in anderen Zelltypen zu trans Aufmerksamkeit konzentrier...

Verschiedene Zellabgabe-Protokolle in murinen und Rattenmodellen von kardiovaskulären Erkrankungen, die mit dem Ziel der Umsetzung der Effizienz, Wirksamkeit und Sicherheit dieser experimentellen Verfahren in menschlichen Patienten getestet. In kleinen Nager Herzen, ist intramyokardialen Zellabgabe die praktikabelste Methode der Zellabgabe 1,2, während in der Rattenherzantegrade und retrograde 3 4 intrakoronare Infusion Zelle kann ebenfalls verwendet werden. Beide Methoden haben Grenzen und Vorteile. Zell Lieferung über die intrakoronare Route hat theoretischen Vorteile gegenüber der direkten intramuskuläre Injektion in die Förderung der weltweiten Verbreitung Zelle 3, aber es hat auch die Gefahr, dass Herzkranzembolie 3,5. Einschränkungen bei der Lieferung intramyokardialen sind mit mechanischen Verletzungen, akute Entzündungen und Herzmuskelschäden 6,7 verbunden. Beim Menschen werden die Zellen für die Reparatur von Herz intramyokardiale Injektion durch eine endokardiale oder epikardiale chirurgischen zugenähern oder durch intrakoronare arteriellen Linie 8. Injection von transvaskuläre Routen ist bei Patienten mit akutem Infarkt und Herzmuskel reperfundierten geeignet, kann aber nicht möglich sein, im Falle von Totalverschlüssen oder schlechte Fluss innerhalb der Gefäße des Gebietes erfolgen 9. Direkte Injektion in die Herzkammerwand durch transendokardialen oder transepikardialen Injektion technisch möglich je nach Patient Gesundheitszustand. Tatsächlich hat es sich gezeigt, dass diese Technik sicher 10,11, obwohl für transepikardialen Injektion eine offene Brustchirurgie notwendig ist und für ein elektro transendokardialen nähert Zuordnung für jeden Patienten erforderlich ist, um lebensfähige Stellen von ischämischen oder vernarbten Herzmuskel 9 unterscheiden. Wichtig ist, dass in der Zelltherapie-Studien die Auswahl der besten Zelle zu trans wird noch untersucht. Kurzzeitanalysen (4 Wochen) zeigten, dass die Injektion von Herzstammzellen definiert als cardiospheres <sbis&gt; 12 oder Side Population Zellen aus Knochenmark 13 induziert Herz funktionelle Erholung in Maus und Ratte 14 15 Modelle von Myokardinfarkt durch eine Verringerung der Narbengröße und Zelltod. Die allogene Transplantation von cardiospheres in einem Rattenmodell Myokardinfarkt ohne Immunsuppression wurde festgestellt, um sicher zu sein, förderte Herzregeneration und verbessert die Herzfunktion durch Stimulation der körpereigenen Reparaturmechanismen 15. Lin-/c-kit + adulte Progenitorzellen im Herzen wurde gezeigt, dass selbst erneuernde, klonogenen und multi in vitro und in vivo, und wenn in einem ischämischen Rattenherzen injiziert rekonstituiert große Teile des verletzten Myokard-Wand 16 und hatte die Fähigkeit, leitende und mittelgroße Koronararterien 17 zu bilden. Diese viel versprechenden Daten angeheizt Phase I und II der klinischen Studien am Menschen: Injektion von autologen und allogenen mesenchymalen Stammzellen (MSC) 18, 19 cardiospheresOder c-Kit positive Herzstammzellen (CSC) 20 in ischämischen Herzen der Menschen zeigten jeweils positiven Auswirkungen auf die Herzfunktion in Langzeitstudien. Dennoch umfangreiche Langzeit-Follow-up-und retrospektive Meta-Analyse zeigte, dass die Stammzelltherapie einen wesentlichen Nutzen für einige Patienten, in anderen aber nicht mit einer Reichweite von 21 unvorhersehbare Ergebnisse. Es ist möglich, dass diese Einschränkungen wird das Design von spezifischen Protokollen der Zellabgabe für jeden einzelnen und jede Erkrankung erfordern. In Maus-und Rattenmodellen zeigten Langzeitstudien, dass Zellinjektion nicht weiter Herzfunktion (12 Monate) zu verbessern. Tatsächlich Transplantate von menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten (hES-CM) wurden weitgehend von der Host-Myokard durch eine Schicht von fibrotischen Gewebes 22,23 isoliert. Ähnliche Ergebnisse wurden nach der Transplantation von intramyokardialen Skelettmyoblasten in das Herz des infarzierten Mäusen 24 beobachtet. Furthermore, die langfristige Möglichkeit der allogenen MSCs Funktion in der Infarkt Herzen bewahren durch Übergang von einer immun eine immunogene Zustand nach Differenzierung 25 begrenzt. Unter Berücksichtigung der Herausforderungen und Perspektiven oben dargelegt, zeigen wir hier, wie man Zellen durch intramyokardialen Injektion in Mäusen zu liefern. Wir beobachten, dass Zellen ohne Herzmuskelkontraktionseigenschaften nicht mit dem Host-Myokard verbunden und bilden eine zusammenhängende Masse mit einer dünnen fibrotischen Barriere. Obwohl in einigen Fällen dieses Ergebnis kann vorteilhaft sein, kann die folgende Analyse nützlich sein, um zu verstehen, wie Zelltransplantations kann moduliert werden, um funktionsfähig verbunden myokardialen Strukturen sowie zu erzeugen.

<table><tbody><tr><td>Isolator</td><td>Pfi-Systeme</td><td></td><td>Angebot erforderlich</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Vet Tech Solutions</td><td>HE006</td><td>Für Kleintiere</td></tr><tr><td>Medetomidin</td><td>Nationaler Veterinärdienst</td><td></td><td>Tierärztliche Verschreibung ist erforderlich</td></tr><tr><td>Ketaminhydrochlorid</td><td>Nationaler Veterinärdienst</td><td></td><td>Tierärztliche Verschreibung ist erforderlich</td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Nationaler Veterinärdienst</td><td></td><td>Tierärztliche Verschreibung ist erforderlich</td></tr><tr><td>Haarentfernungscreme</td><td>kommerzielle Geschäfte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>NVS Tierärztliche</td><td></td><td>Verschreibung ist erforderlich</td></tr><tr><td>Leica MZFLIII Mikroskop</td><td>Leica</td><td>Modell S6E</td><td>Mit Schwenkarmstativ TS0</td></tr><tr><td>Hamamatsu Nanozoomer digitaler Diascanner</td><td>Hamamatsu</td><td>RS series</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td></td><td>Jeol JSM-6610</td><td></td></tr><tr><td>Stumpfe Schere</td><td>FST</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Minivent</td><td>Harvard Gerät</td><td>73-0043</td><td>Inklusive kleinem Y-Adapter (73-0027) und Intubationskanüle (73-2844)</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>FST</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Retraktionssystem</td><td>FST</td><td>18200-20</td><td>Kit für Tiere bis 200 g</td></tr><tr><td>30 G 12 mm; &frac12; Zoll</td><td>BBraun</td><td>A210</td><td>Feingelbe</td></tr><tr><td>Mikroliterspritze</td><td>ESSLAB</td><td>81201</td><td>Enthält auch einen Hamilton Repetierspender PB 600-1 Katalognummer 83700</td></tr><tr><td>6-0 Seidennaht</td><td>Ethicon</td><td>W1614T</td><td></td></tr></tbody></table>

intramyokardiale zell lieferung: beobachtungen im herzen murine

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Frühere Studien haben gezeigt, dass Zellabgabe fördert Verbesserung der Herzfunktion durch Freisetzung von Zytokinen und Faktoren, die Herzgewebe Revaskularisation und das Überleben der Zelle zu erhöhen. Darüber hinaus sind weitere Beobachtungen zeigten, dass bestimmte Stammzellen, wie Herzstammzellen, mesenchymale Stammzellen und cardiospheres haben die Fähigkeit, innerhalb der umgebenden Myokard durch Differenzierung in Kardiomyozyten, glatte Muskelzellen und Endothelzellen zu integrieren. Hier präsentieren wir die Materialien und Methoden, um zuverlässig zu liefern noncontractile Zellen in der linken Herzkammerwand der immunodepleted Mäusen. Die wesentlichen Schritte dieser mikrochirurgischen Verfahren beinhalten Anästhesie und Analgesie Injektion, intratracheale Intubation, Schnitt, um die Truhe zu öffnen und setzen das Herz und die Lieferung von Zellen durch eine sterile 30-Gauge-Nadel und einer Präzisionsmikroliter-Spritze. Gewebeverarbeitung, bestehend aus Herz Ernte, embedding, Schneiden und histologische Färbung zeigte, dass intramyokardialer Zellinjektion erzeugt eine kleine Beschädigung in der epikardialen Fläche, als auch in der Herzkammerwand. Noncontractile Zellen in die Wand des Myokards immunsupprimierten Mäusen erhalten und wurden durch eine Schicht aus faserigem Gewebe, wahrscheinlich von Herz Druck und mechanischer Belastung zu schützen, umgeben ist.

Wir injizierten HEK293-Zellen, die unterscheidbar von der Herzzellen durch ihre unterschiedliche Morphologie (Fig. 1) sind, mit einer Kopfsteinform im Vergleich zu den länglichen Kardiomyozyten (Fig. 1A). HEK293-Zellen waren zu Hämatoxylin Farbstoff (blaue Farbe) reaktiven Vergleich zu Kardiomyozyten (rosa Farbe), wahrscheinlich wegen ihrer erhöhten Kerngehalt (Abbildung 1A). Zur weiteren Unterscheidung der injizierten Zellen aus dem Wirtsgewebe wurden HEK293-Zellen mit...

Intramyokardialer Zellabgabe in murinen Modellen von kardiovaskulären Erkrankungen, wie Hypertonie oder Myokardinfarkt, wird häufig verwendet, um das therapeutische Potential von verschiedenen Zelltypen in der Regenerationsstudien getestet. Daher wird eine ausführliche Beschreibung und eine klare Visualisierung dieses chirurgische Verfahren helfen, die Grenzen und Vorteile der Herz-Kreislauf-Zelle therapeutische Analysen in kleinen Nagern zu definieren.

Intramyokardiale Zell Lieferung: Beobachtungen im Herzen Murine

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine definierte Anzahl von Zellen im linken ventrikulären Myokard eines murinen Herzens zu applizieren und die injizierten Zellen eine Woche nach der Injektion sichtbar zu machen. Der erste Schritt besteht darin, die ausgewählten Zellen vorzubereiten, indem sie zwei Stunden mit DPI inkubiert werden. Anschließend wird über den vierten linken Interkostalraum eine Thorakotomie durchgeführt, um das Herz freizulegen.Die Zellen werden anschließend in eine Spritze geladen, die mit einer kleinen Kunststoffkanüle ausgestattet ist, um eine Perforation der Ventrikelwand zu vermeiden. Im letzten Schritt werden die Zellen in die richtigen Mengen in die Wand des linken Ventrikels injiziert. Schließlich werden histologische und Aufnahmen der Rasterelektronenmikroskopie verwendet, um die Anwesenheit der injizierten Zellen im linken Myokard eine Woche nach der Injektion zu zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass Sie vermeiden, die Zellen in den linken Ventrikelhohlraum zu injizieren, und dass Sie die Zellen durch Färbung mit DAPI verfolgen können. Die für die Demonstration dieses Verfahrens verwendeten HC 2 93-Zellen werden in DMM-Medien kultiviert und alle zwei Tage mit frischem Medium versorgt. Um die Zellverfolgung zu erleichtern, inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden vor der Injektion mit DPI, nachdem sie immundefizient gemacht wurden. Die Mäuse werden vor jedem chirurgischen Eingriff in einem temperaturgeregelten Isolator mit sterilen Futterpellets und Wasser gehalten.Platzieren Sie zunächst eine Heizplatte im Arbeitsbereich, um die korrekte Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Während der Operation wird der Arbeitsbereich unter einer laminaren Luftströmungshaube eingerichtet und mit 70 %igem Ethanol gereinigt. Stellen Sie die für den Eingriff benötigten, autoklavierten chirurgischen Instrumente bereit. Bereiten Sie anschließend den Erholungskäfig vor, indem Sie einen sauberen, autoklavierten Käfig auf die Heizplatte stellen.Wenn bereit, transportieren Sie die Mäuse in ihren ursprünglichen Käfigen von dem Isolator in den Operationsraum in einer sterilen, autoklavierten Tüte. Nach der Verabreichung eines Anästhetikums bestätigen Sie die Sedierung durch das Fehlen des Hintergliedmaßen-Zuckreflexes. Verwenden Sie eine Enthaarungscreme, um das Fell von der linken Seite der Brust und dem Halsbereich zu entfernen.Als Nächstes wird die Maus in Rückenlage auf das Operationsfeld gebracht. Nach subkutaner Injektion einer analgetischen Lösung wird der rasierte Bereich mit der antiseptischen Lösung benetzt. Unter mikroskopischer Sicht wird ein medianer Schnitt knapp unterhalb des Ringknorpels durchgeführt.Lösen Sie das Bindegewebe, um die Speicheldrüsen sichtbar zu machen. Teilen Sie die Speicheldrüsen entlang ihrer natürlichen Mittellinie, indem Sie sie mit einer Pinzette auseinanderziehen. Danach setzen Sie zwei Brustretraktoren ein.Um die Luftröhre freizulegen, ziehen Sie die Zunge vorsichtig zur Seite, um den Kehlkopf freizulegen, und schieben Sie dann vorsichtig einen 22-Gauge-Metalintubationsschlauch in die Luftröhre. Bei korrekter Platzierung sollte die Schlauchspitze durch die Luftröhre sichtbar sein. Stellen Sie das Schlagvolumen auf 200 µL und die Schläge pro Minute ein.Stellen Sie bei 130 das Atemzugvolumen und die Atemfrequenz abhängig vom Gewicht des Tieres ein. Anschließend führen Sie einen Schnitt über dem linken Thoraxbereich durch. Trennen Sie vorsichtig durch das Bindegewebe sowie die große und kleine Brustmuskulatur.Um den Rippenkorb sichtbar zu machen, perforieren Sie die Schicht der Interkostalmuskulatur zwischen der dritten und vierten Rippe mit kleinen runden Pinzetten und setzen einen Brustretraktor ein, um die Brusthöhle zu öffnen. Visualisieren Sie den oberen und mittleren Teil des linken Ventrikels mit dem darüberliegenden Vorhof.Zu diesem Zeitpunkt sollten die für die Injektion benötigten Zellen in einer Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel vorbereitet werden, um zu verhindern, dass die Nadel die Wand des linken Ventrikels durchbohrt; befestigen Sie einen kleinen, plastischen Kanülenadapter über der Nadel, wobei nur ein Millimeter freiliegt. Mit Hilfe eines 5x-Objektivs das linke Ventrikel visualisieren und die Zellen in die Ventrikelwand injizieren. Die Nadel langsam zurückziehen, um ein Zurückströmen der Zellen zu vermeiden.Injizieren Sie die Zellen an fünf verschiedenen Stellen. Wenn die Injektion erfolgreich ist, wird ein weißer Bereich an der Injektionsstelle sichtbar sein. Entfernen Sie nach der Zellinjektion den Retraktor und verschließen Sie die Brustwand mit zwei Seidenfäden.Benetzen Sie die Brustmuskulatur und die Haut mit einem mit PBS getränkten Wattestäbchen und bringen Sie die Muskeln vorsichtig mit einer Pinzette in ihre ursprüngliche Position zurück. Schließen Sie anschließend jeden Inzisionsort mit Seidenlitzen. Sobald die Wunden verschlossen sind, injizieren Sie Anti Sedan, um die anästhetischen Effekte rückgängig zu machen.Wenn die Maus eigenständig zu atmen beginnt, entfernen Sie den Schlauch aus der Luftröhre und legen Sie die Maus auf die rechte Seite. Sobald das Tier lauffähig ist, stellen Sie es in einen warmen Erholungskäfig und überwachen Sie es, bis es sich vollständig erholt hat. Eine Woche nach der Transplantation wurden Herzproben zur Hämatoxylin- und Eosin-Färbung aufgearbeitet.Um zu bestätigen, dass sich HEC 2 9 3-Zellen in der Ventrikelseptumwand befanden, zeigen dreifachgefärbte Gewebeschnitte, dass die Zellen in demselben Bereich gruppiert waren, in den sie injiziert wurden. Bei sham-operierten Mäusen zeigte sich im gesamten Herzen kein Gewebeschaden und die Integrität des Gewebes war erhalten. Die Markierung der Zellen mit DPI vor der Injektion ermöglichte eine weitere Unterscheidung zwischen den injizierten Zellen und dem Wirtsgewebe.Die injizierten Zellen waren von einer dünnen Schicht faserigen Gewebes umgeben, die im Trichrom als blauer Bereich erschien. Die Färbung zeigte, dass die Zellen nicht mit dem Wirtsherzmuskelgewebe verbunden waren, wie durch die energiedispersive Röntgenspektroskopie wahrscheinlich aufgrund ihrer nicht kontraktilen Funktion und unterschiedlichen zellulären Struktur nahegelegt wird. Die Pfeile zeigen auf kleine Schadensbereiche, an denen die Nadel eingestochen wurde.Injizierte Zellen, die durch den grünen Pfeil gekennzeichnet sind, befanden sich in der Nähe des durch schwarze Pfeile markierten verletzten Bereichs. Zusätzlich waren DPI-positive Zellen entlang der Injektionsstelle sichtbar. Der TUNEL-Assay zeigte keine erhöhte Anzahl apoptotischer Zellen an der Verletzungsstelle, was darauf hindeutet, dass nach der Injektion eine Nekrose statt einer Apoptose aufgetreten war.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Zellen erfolgreich in das Myokard einer anesthetisierten Maus injiziert werden können, ohne in den Ventrikularkanal zu punktieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video zeigt, wie eine schnelle und zuverlässige Modell nutzen, um pathobiologischen und pathophysiologischen Prozessen der Myokardischämie zu studieren.

LAD-Ligation: einem Mausmodell der Myokardinfarkt

Zahlreiche genetische Manipulationen und / oder intramyokardialen Injektionen von Genen, Proteinen, Zellen und / oder Biomaterialien basieren auf die Dimension der Zeit in Studien zur akuten Ischämie / Reperfusion und chronischer Umbau in Mäusen überlagert. Dieses Video zeigt die mikrochirurgische Verfahren für die Ischämie / Reperfusion, permanent koronare Ligation und intramyokardialen Injektion Studien.

Koronare Ligation und intramyokardialen Injection in einem Mausmodell der Infarkt

Echokardiographie geführten perkutanen intramyokardiale Injektion stellt einen effizienten, zuverlässigen und anzielbare Modalität für die Lieferung von Gentransfermittel oder Zellen in die Maus-Herz. Nach der Schritte in diesem Protokoll dargelegt, kann der Bediener schnell kompetente werden in diesem vielseitigen, minimal-invasive Technik.

Ultraschall-geführte Transthorakale intramyokardiale Injection in Mäuse

Neue therapeutische Strategien in der kardialen regenerativen Medizin erfordern umfangreiche und detaillierte Studien in großen präklinischen Tiermodellen, bevor sie für den Einsatz beim Menschen betrachtet werden können. Hier zeigen wir eine perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektionstechnik bei Kaninchen, die ist wertvoll für Hypothesentests die Wirksamkeit solcher neuartiger Therapien.

Perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektion und Zelle-Lieferung in einem großen präklinischen Modell

Bei dieser Methode sind embryonale Herz Gewebe chirurgisch Microdissected, dissoziiert, Eindringmittel beschriftet und in Host embryonalen Gewebe implantiert. Dies bietet eine Plattform für das Studium der Einzelperson oder Gewebe Ebene Entwicklungen Organisation unter ektopische hämodynamischen Bedingungen und/oder veränderten parakrine/Juxtacrine Umgebungen.

Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Dieses Protokoll stellt eine einfache und kohärente Möglichkeit dar, ein Gen von Interesse mit modRNA nach Myokardinfarkt bei Mäusen vorübergehend zu regulieren.

Lieferung von Modified mRNA in einem Myokardinfarkt-Mausmodell

Stammzellen werden kontinuierlich als mögliche Behandlungen für Personen mit Myokardschäden untersucht, jedoch kann ihre verminderte Lebensfähigkeit und Retention im verletzten Gewebe ihre langfristige Wirksamkeit beeinträchtigen. In diesem Manuskript beschreiben wir eine alternative Methode zur Stammzellabgabe in einem murinen Modell der Ischämie-Reperfusionsverletzung.

Verzögerte intramyokardiale Lieferung von Stammzellen nach Ischämie-Reperfusionsverletzung in einem Murine-Modell

Die Stammzelltherapie hat sich als effiziente Strategie zur Reparatur von verletztem Herzgewebe nach einem Myokardinfarkt herauskristallisiert. Wir bieten eine optimale In-vivo-Anwendung für die Stammzelltransplantation mit gelatinenhydrogelen, die enzymatisch vernetzt werden können.

Intramyokardiale Transplantation von MSC-Loading injizierbaren Hydrogelen nach Myokardinfarkt in einem Murine-Modell

Die ultraschallgesteuerte Zellabgabe um die Stelle des Myokardinfarkts bei Mäusen ist eine sichere, effektive und bequeme Art der Zelltransplantation.

Ultraschallgesteuerte induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten-Implantation bei myokardinfarktierten Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt drei Methoden zur Verabreichung kardioaktiver Therapeutika in einem Schweinemodell. Weibliche Landrassenschweine erhielten die Behandlung entweder: (1) Thorakotomie und transepikardiale Injektion, (2) kathetergestützte transendokardiale Injektion oder (3) intravenöse Infusion über die osmotische Minipumpe der Jugularvene.

Verabreichung kardioaktiver Therapeutika in einem Schweine-Myokardinfarkt-Modell

Diese Methode eliminiert jede größere Invasion während der Zellinjektionen, die durch die Zellsuspensionslösung verursacht wird.

Eine neuartige Zellinjektionsmethode mit minimaler Invasion

Erfahren Sie die intramyokardiale Zelllieferung in murinen Herzen zur Untersuchung kardiovaskulärer Zelltherapien. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung injizierter Zellen eine Woche nach der Transplantation.

Intramyokardiale Zell Lieferung: Beobachtungen im Herzen Murine

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