Intramyokardiale Zell Lieferung: Beobachtungen im Herzen Murine

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine bestimmte Menge an Zellen in das linksventrikuläre Myokard eines Mausherzens zu bringen und in der Lage zu sein, die injizierten Zellen eine Woche nach der Injektion sichtbar zu machen. Der erste Schritt besteht darin, die ausgewählten Zellen vorzubereiten, indem sie zwei Stunden lang mit DPI inkubiert werden. Als nächstes wird eine Thorakotomie durch den linken vierten Interkostalraum durchgeführt, um das Herz freizulegen.

Die Zellen werden dann in eine Spritze geladen, die mit einer kleinen Kunststoffkanüle ausgestattet ist, um eine Perforation der Ventrikelwand zu vermeiden. Der letzte Schritt besteht darin, die richtige Menge an Zellen in die Wand des linken Ventrikels zu injizieren. Letztendlich werden histologische und rasterelektronenmikroskopische Bilder verwendet, um das Vorhandensein der injizierten Zellen im linken Myokard eine Woche nach der Injektion zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass Sie die Injektion der Zellen in die linke Ventrikelhöhle vermeiden und dass Sie die Zellen durch Färben mit DAPI verfolgen können. Die HC 2 93-Zellen, die zur Demonstration dieses Verfahrens verwendet werden, werden in DMM-Medien gezüchtet und alle zwei Tage mit frischem Medium versorgt. Um die Zellverfolgung zu erleichtern, inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang mit DPI, bevor Sie immundepletierte Zellen injizieren. Die Mäuse werden vor jeder Operation in einem temperaturkontrollierten Isolator mit sterilen Futterpellets und Wasser gehalten.

Um mit der Positionierung eines Heizkissens im Arbeitsbereich zu beginnen, um die richtige Körpertemperatur zu halten Während der Operation wird der Arbeitsbereich unter einer Laminar-Flow-Haube eingerichtet und mit 70% Ethanol gereinigt. Ordnen Sie die für den Eingriff benötigten sterilisierten chirurgischen Instrumente im Autoklaven an. Bereiten Sie als Nächstes den Auffangkäfig vor, indem Sie einen sauberen Autoklavkäfig auf ein Heizkissen stellen.

Wenn Sie fertig sind, transportieren Sie die Mäuse in ihren Originalkäfigen vom Isolator in einen sterilen autoklavierten Beutel in den Operationssaal. Nach der Verabreichung eines Anästhetikums bestätigen Sie die Sedierung durch das Fehlen des Rückzugsreflexes der Hintergliedmaßen. Verwenden Sie Haarentfernungscreme, um das Fell von der linken Seite der Brust und des Halsbereichs zu entfernen.

Platzieren Sie anschließend die Maus in Rückenlage auf der OP-Platte. Bedecken Sie nach der subkutanen Injektion einer analgetischen Lösung den rasierten Bereich mit der aseptischen Lösung. Während Sie den Bereich unter einem Mikroskop betrachten, machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie etwas unterhalb des Zirikoidknorpels.

Durchbrechen Sie das Bindegewebe, um die Speicheldrüsen sichtbar zu machen. Spalte die Speicheldrüsen an ihrer natürlichen Mittellinie, indem du sie mit einer Pinzette auseinanderziehst. Setzen Sie anschließend zwei Brusthaken ein.

Um die Luftröhre freizulegen, legen Sie den Kehlkopf frei, indem Sie die Zunge vorsichtig zur Seite ziehen, und schieben Sie dann einen 22-Gauge-Intubationsschlauch aus Metall vorsichtig in die Luftröhre. Wenn sie richtig eingeführt ist, sollte die Schlauchspitze durch die Luftröhre sichtbar sein. Stellen Sie das Hubvolumen auf 200 Mikroliter und den Hub pro Minute ein.

Bei 130 wird das Atemzugvolumen und die Atemfrequenz in Abhängigkeit vom Gewicht des Tieres angepasst. Als nächstes machen Sie einen Schnitt über dem linken Brustbereich. Trennen Sie vorsichtig durch das Bindegewebe und den Musculus pectoralis major und minor.

Um den Brustkorb sichtbar zu machen, perforieren Sie die Interkostalmuskelschicht zwischen der dritten und vierten Rippe mit einer kleinen abgerundeten Pinzette und führen Sie einen Brustretraktor ein. Um die Brusthöhle zu öffnen. Stellen Sie sich den oberen und mittleren Teil der linken Herzkammer mit dem darüber liegenden Vorhof vor.

Zu diesem Zeitpunkt sollten die für die Injektion benötigten Zellen in einer Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel vorbereitet werden, um zu verhindern, dass die Nadel die linksventrikuläre Wand perforiert, band eine kleine Kunststoffkanüle über die Knienadel, so dass nur ein Millimeter freiliegt. Visualisieren Sie mit Hilfe eines Fünf-fach-Objektivs die linke Herzkammer und injizieren Sie die Zellen in die Herzkammerwand. Ziehen Sie die Nadel langsam zurück, um eine Rückspülung der Zellen zu verhindern.

Injizieren Sie Zellen an fünf verschiedenen Stellen. Wenn die Injektion erfolgreich ist, ist an der Injektionsstelle ein weißer Bereich sichtbar. Entfernen Sie nach der Injektion der Zellen den Retraktor und verschließen Sie die Brustwand mit zwei Seidennähten.

Berühren Sie die Brustmuskulatur und die Haut mit einer Wattestäbchen, die mit PBS getränkt ist, und bringen Sie die Muskeln mit einer Pinzette sanft wieder in die ursprüngliche Position. Als nächstes verschließen Sie jede der Schnittstellen mit Seidennähten. Sobald die Wunden verschlossen sind, injizieren Sie Anti-Sedan, um die anästhetische Wirkung rückgängig zu machen.

Wenn die Maus anfängt, selbstständig zu atmen, entfernen Sie den Schlauch aus der Luftröhre und legen Sie die Maus auf die rechte Seite. Wenn das Tier gehfähig ist, setzen Sie es in einen warmen Auffangkäfig und überwachen Sie, bis es sich vollständig erholt hat. Eine Woche nach der Transplantation wurden Herzproben für die Hämat-, Toin- und Eoin-Färbung aufbereitet.

Um zu bestätigen, dass hec 2 9 3 Zellen in der Ventrikelwand vorhanden waren, zeigen Trichrom-gefärbte Gewebe, dass die Zellen in demselben Bereich gruppiert waren, in dem sie kontrolliert injiziert wurden. Scheinoperierte Mäuse zeigten keine Schädigung des gesamten Herzens und der Integrität des Gewebes. Die DPI-Markierung der Zellen vor der Injektion half dabei, weiter zwischen den injizierten Zellen und dem Wirtsgewebe zu unterscheiden.

Die injizierten Zellen waren von einer dünnen Schicht aus fibrotischem Gewebe umgeben, die als blauer Bereich im Trichrom erschien. Die färbenden Zellen waren nicht mit dem Myokardgewebe des Wirts verbunden, wie die Energiedispersionsspektrometrie zeigte, wahrscheinlich aufgrund ihrer nicht kontraktilen Funktion und ihrer unterschiedlichen Zellstruktur. Die Pfeile zeigen auf kleine Schadensstellen, an denen die Nadel injiziert wurde.

Die injizierten Zellen, die durch den grünen Pfeil gekennzeichnet sind, befanden sich in der Nähe des verletzten Bereichs, der durch schwarze Pfeile markiert ist. Darüber hinaus waren DPI-positive Zellen entlang der Injektionsstelle sichtbar. Der Tunnelassay zeigte keine vermehrten apoptotischen Zellen an der Verletzungsstelle, was darauf hindeutet, dass nach der Injektion eher eine Nekrose als eine Apoptose aufgetreten war.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man erfolgreich Zellen in das Myokard einer anästhesierten Maus injiziert, ohne in die Ventrikelhöhle zu stechen.