Intramyokardiale Transplantation von MSC-Loading injizierbaren Hydrogelen nach Myokardinfarkt in einem Murine-Modell

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselprobleme in der aktuellen verschlimmerten Herztherapie zu lösen, wie z. B. die geringe Anwendbarkeit bei geringer Retention und Überleben von transplantierten Zellen in infarktierten Herzen. Um dieses Problem zu lösen, kann diese Methode eine zuverlässige Technik zur Untersuchung der intramyokardialen Transplantation mit Stammzellen unter Verwendung von injizierbaren Hydrogelen in einem Mausmodell darstellen, was eine hervorragende Plattform für die Untersuchung der Reparatur und Regeneration von Herzgewebe nach einer Myokardverletzung darstellt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine praktikable Methode handelt, um die Retention und das Überleben transplantierter Stammzellen nach intramyokardialer Transplantation unter Verwendung von injizierbaren In-situ-Hydrogelen mit Vernetzungsabdeckung zu verbessern.

Diese Hydrogele bieten vielfältige Möglichkeiten für das kardiale Tissue Engineering, wie z. B. die Verabreichung nicht nur von Stammzellen, sondern auch von Wachstumsfaktoren, genetischem Material und Medikamenten, um ihre therapeutische Wirkung in infarktiertem Herzgewebe zu maximieren. Das Verfahren für das In-vitro-Experiment wird von Eunmi Lee, einer Forschungstechnologin aus meinem Labor, demonstriert. Die Forschungstechnologen Eun-Hye Park und Eunhwa Seong werden das Verfahren für In-vivo-Experimente demonstrieren.

Züchten Sie mesenchymale Stammzellen (MSCs) in einer 100-Millimeter-Kulturschale bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen, spülen Sie das Geschirr zweimal mit DPBS ab und inkubieren Sie sie drei Minuten lang mit einem Milliliter Trypsinersatz bei 37 Grad Celsius. Geben Sie dann neun Milliliter Nährmedium zu den Zellen und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei 500 mal G.

Den entstandenen Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter PBS und halten Sie die Zellsuspension auf Eis. Verdünnen Sie 10 Mikroliter Zellsuspension mit 10 Mikrolitern Trypanblau und bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem automatisierten Zellzähler.

Resuspendieren Sie die MSCs auf eine Dichte von eins mal 10 zu den siebten Zellen pro Milliliter und übertragen Sie sie in ein Milliliterröhrchen. Bereiten Sie eine konjugierte Lösung mit 6,25 % GH in PBS vor und trennen Sie sie in zwei Fläschchen. Mischen Sie anschließend die GH-Lösungen entweder mit sechs Mikrogramm pro Milliliter HRP oder 0,07 % Wasserstoffperoxid.

Die Zellsuspension wird kurz bei 1000-fachem G zentrifugiert und der resultierende Überstand vorsichtig abgesaugt. Mischen Sie dann das Zellpellet mit GH-Lösung A.Laden Sie die MSCs in GH-Lösung A und GH-Lösung B auf beide Seiten einer Doppelspritze. 300 Mikroliter der kombinierten GH-Lösungen mit MSCs bei einer Enddichte von 5 Millionen Zellen pro Milliliter werden auf einen Objektträger mit acht Vertiefungen aufgefüllt.

Nach der In-situ-Hydrogelbildung und der anschließenden MSC-Verkapselung durch enzymatische Vernetzung werden 700 Mikroliter DMEM mit 10 % FBS und 1 % antibiotischer antimykotischer Lösung zugegeben. Inkubieren Sie den Objektträger bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und tauschen Sie das Nährmedium alle zwei bis drei Tage aus. Vor der Operation die Brust der Maus mit Haarentfernungscreme depolieren und die Haut mit Jod sterilisieren.

Legen Sie die Maus auf einen Operationstisch und intubieren Sie sie, indem Sie einen Katheter in die Luftröhre einführen, um zusätzlichen Sauerstoff über eine mechanische Beatmung bereitzustellen. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere vorsichtig durch die Haut. Dringen Sie dann mit einer Mikroschere in die Interkostalmuskulatur ein.

Trennen Sie die zweite und dritte linke Rippe mit einer 5-O-Seidennaht, um eine offene Brusthöhle zu erhalten. Ligatur der linken vorderen absteigenden Koronararterie vorsichtig mit einem Nadelhalter mit einem 8-0 Polypropylen-Naht und schneiden Sie die Naht mit Elektrokauter. Beobachten Sie eine unmittelbare Farbveränderung in der vorderen linken Ventrikelwand.

Nach Induktion des Myokardinfarkts injizieren Sie 10 Mikroliter der MSC-geladenen GH-Lösungen an zwei verschiedene Punkte in der Infarktgrenzzone. Stellen Sie die geöffnete Brusthöhle wieder her und schließen Sie die Muskeln und die Haut mit 5-0-Nähten. Entfernen Sie den Trachealtubus und legen Sie die Maus während der Bergung in einen Käfig unter einer Infrarotlampe.

Führen Sie eine Echokardiographie durch und messen Sie die entsprechenden Linien für die LV-Vorderwand, die LV-Innenwand und die LV-Hinterwand, um die Dicke der Herzwand, die Kammerabmessungen und die fraktionelle Verkürzung zu erhalten. Vor der in vivo-Transplantation wurden die Proliferation und das Überleben von MSCs in GH-Hydrageln durch einen 3D-In-vitro-Färbetest an lebenden toten Zellen bestätigt. Repräsentative Bilder zeigten eine ausreichende MSC-Proliferation und zeigten verzweigte Netzwerke innerhalb von GH-Hydrogelen.

An Tag 14 wurde deutlich eine ausgedehnte multizelluläre 3D-Struktur von MSCs beobachtet, was darauf hindeutet, dass GH-Hydrogele eine geeignete Mikroumgebung für die verkapselten Zellen bieten könnten. Nach der Induktion eines Myokardinfarkts wurden MSC-beladene GH-Hydrogele intramyokardil in die Periinfarktbereiche transplantiert. Die MSCs und das Gel wurden in der infarktierten Region angemessen aufrechterhalten.

MSCs waren gut in GH-Hydrogele integriert. Um die therapeutischen Effekte der MSC-beladenen GH-Hydrogele zu verifizieren, wurden die Veränderungen der Herzfunktion und -struktur mittels Echokardiographie und histologischer Analyse am Tag 28 nach der Transplantation bewertet und zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen verglichen. Die repräsentative Echokardiographie zeigte verbesserte kardiale Funktionen, einschließlich fraktionierter Verkürzung, Ejektionsfraktion und endsystolischem Volumen in der mit MSC-Gel behandelten Gruppe.

Darüber hinaus zeigte die histologische Analyse in der mit MSC-Gel behandelten Gruppe weniger Fibrose, dickere Infarktwände und eine kleinere Infarktgröße als in den anderen Gruppen, was darauf hindeutet, dass dieses Protokoll den LV-Umbau signifikant abschwächte. Mit dieser Technik erreichten wir eine langfristige Stammzellein- und -proliferation und führten zu einer signifikanten Verbesserung der kardialen Struktur und Funktion nach einem Myokardinfarkt im Mausmodell. Diese Technik kann für den Einsatz bei Großtieren und in die klinische Translation als neue Strategie zur Prävention einer Herzinsuffizienz nach einem Infarkt erweitert werden, indem sie die Reparatur und Regeneration des Herzgewebes ermöglicht.