Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Dieses Protokoll hilft uns zu bestimmen, wie Veränderungen in der lokalen Biomechanik, Gewebearchitektur, parakrinen Umgebungen und Juxtacrin-Wechselwirkungen den zellulären Phänotyp beeinflussen. Diese Technik ermöglicht es uns, klassische Paradigmen und experimentelle Embryologie zu erforschen, ohne die groß angelegten Gewebebeleidigungen zu verursachen, die normalerweise in traditionellen Graphikexperimenten auftreten. Um den richtigen Injektionsdruck zu finden, ist es hilfreich, bei einem niedrigeren Injektionsdruck zu beginnen und schrittweise zu erhöhen, bis ein stetiger Zellfluss erreicht ist.

Die Visualisierung dieser Technik hilft, ein direktes Verständnis dafür zu erreichen, wie die Injektionsgeräte in Bezug auf das Zielgewebe positioniert werden müssen. Demonstrierend wird das Verfahren zwei Mitglieder meines Labors sein, Trevor Henley und Kandace Thomas. 24 Stunden vor der Implantation Glaskapillaren auf einem Mikropipettenzieher nach Standardprotokollen ziehen und die Kapillaren in Siliziumisierungsmittel tauchen, um die äußeren Oberflächen der Nadeln zu beschichten.

Als nächstes 5 bis 10 Mikroliter Siliziumisierungsmittel in eine Mikroinjektionspipettenspitze laden und die Spitze in das breite Ende einer extern beschichteten Glaskapillare legen. Positionieren Sie die Pipettenspitze so nah wie möglich an der Glasnadelspitze und werfen Sie das Siliziummittel aus, während Sie die Ladepipette langsam zurückziehen, um Luftblasen innerhalb der Nadel zu minimieren. Lassen Sie das Siliziummittel 10 Minuten in der Glasnadel, bevor Sie eine neue Ladepipette verwenden, um die Lösung zu aspirieren.

Dann trocknen Sie die Nadeln in einer Rauchhaube über Nacht. Für die Vorbereitung von Wirtsembryonen fruchtbare Hühnereier in horizontaler Ausrichtung in einem befeuchteten Inkubator bei 38 Grad Celsius inkubieren und mit abgewinkelten Zangen eine Punktion von mehr als einem Millimeter Durchmesser im Boden des flachen Endes jedes Eis entlang des Eiäquators vornehmen. Legen Sie eine 18-Meter-Nadel, die an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist, in die Punktion ein, um etwa fünf Milliliter Albumen zu entfernen.

Und tragen Sie transparentes Klebeband auf die Oberseite der Eierschale auf. Bewerten Sie den verklebten Bereich entlang der Oberseite des Eis mit abgewinkelten Zangen und verwenden Sie eine gekrümmte Tenotomieschere, um ein etwa 2,5 Zentimeter großes Fenster im verklebten Teil des Eis zu schneiden. Inspizieren und inszenieren Sie den Embryo auf der Grundlage der von Hamburger und Hamilton festgelegten Kriterien und verwenden Sie eine ein Millimeter Spritze, die mit einer 32-Spur-Nadel ausgestattet ist, um etwa 200 Mikroliter einer ein bis fünf Verdünnung der Indischen Tinte in HBSS unter dem Embryo zu injizieren.

Dann versiegeln Sie die Punktion mit transparentem Klebeband und fügen Sie einen Milliliter HBSS tropfenweise auf die embryonale Scheibe, bevor Sie die Fensterschale mit Paraffinfolie versiegeln, um das Ei wieder in den befeuchteten Inkubator zu legen. Wenn die Embryonen das Stadium 19 der Hamburger und Hamilton erreichen, spülen Sie die silikonbeschichteten Glaskapillaren mit entionisiertem Wasser ab und lassen Sie die Kapillaren drei bis vier Stunden bei Raumtemperatur trocknen. In der Zwischenzeit einen Embryo von einem Ei in eine 100 mal 15 Millimeter lange Petrischale mit steriler Raumtemperatur HBSS übertragen und die Schale unter ein Stereomikroskop stellen.

Mit Zangen, Tenotomiescheren und einem Mikrospachtel isolieren Sie das gesamte embryonale Herz vom Embryo und isolieren Die Vorhöfe vom Herzen. Legen Sie das Vorhofgewebe in ein steriles 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr, das einen Milliliter HBSS enthält, auf Eis. Wenn das gesamte Spendergewebe gesammelt wurde, pellet das Gewebe durch Zentrifugation in einer fixierten abgewinkelten Mikrozentrifuge.

Für die Vergärung des Spendergewebes setzen Sie die Pellets in einem Milliliter vorgewärmter 05%trypsin EDTA für eine 15-minütige Inkubation in einem schüttelnden Wärmeblock bei 300 Umdrehungen pro Minute wieder auf. Am Ende der Inkubation, Pipette die Verdauungslösung mehrmals, um das restliche Gewebe aufzubrechen und pellet das Herzlysat durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Trypsin-Neutralisationslösung für eine weitere Zentrifugation wieder auf, gefolgt von einer erneuten Suspension in 400 Mikrolitern roter Fluoreszenzfarbstofflösung.

Nach 20 Minuten bei 37 Grad Celsius pellet die Zellen durch Zentrifugation für ein bis drei Waschungen in einem Milliliter HBSS pro Waschgang. Dann setzen Sie die beschrifteten Zellen bei fünf mal zehn bis vier Zellen pro Mikroliterkonzentration in frischen HBSS wieder aus. Zur In-vivo-Injektion der Spenderzellen die Zellsuspension wie demonstriert in eine trockene, silikonbehandelte Glaskapillarpipette zurückladen und die Pipette in das Druckmikroinjektorgerät montieren.

Übertragen Sie jeden Wirtsembryon, der aus dem befeuchteten Inkubator in einen Eihalter unter einem fluoreszierenden Stereo-Sezierendes Mikroskop injiziert wird. Und verwenden Sie sterile feine Zangen, um die Vitelline-Membran zu öffnen. Machen Sie einen 5 bis 1 Millimeter Schnitt im Perikard und positionieren Sie den Mikroinjektor so, dass die Spitze der Mikroinjektionsnadel in das Zielgewebe eindringt.

Stellen Sie den Mikroinjektor so ein, dass einzelne Impulse von 5 Sekunden Dauer und im Bereich von 100 bis 400 Hektopascal im Druck angewendet werden. Und druckinjizieren die Zellen. Es ist wichtig, eine erfolgreiche Zellimplantation zu überprüfen, indem das fluoreszierende Signal vor der erneuten Versiegelung der Eizelle geographiert wird.

Der Embryo kann auch fotografiert werden, um dieses Verfahren zu dokumentieren. Wenn alle Zellen injiziert wurden, ziehen Sie den Mikroinjektorapparat zurück und entfernen Sie das Ei aus dem Halter. Dann fügen Sie einen Milliliter warme HBSS tropfenweise auf den Embryo.

Versiegeln Sie das Ei mit transparentem Packband und geben Sie das Ei für 24 Stunden nach der Implantation an den befeuchteten Inkubator zurück. Hier wird das Herz und das umgebende Gewebe eines embryonalen Wirtsnachas nach der Vorhofmyozytenimplantation des Spenders gezeigt. In diesem repräsentativen Experiment wurden die Spenderzellen mikroinjiziert in das Proepikardeines eines Wirtsembryons in einem ähnlichen Stadium.

Optische Schnitte mit einem konfokalen Mikroskop ergaben, dass die einzigen Herzmuskelmarker-positiven Zellen innerhalb des Proepikardieums die fokal implantierten fluoreszierenden roten positiven Zellen waren. Achten Sie darauf, den Empfängerembryon nicht zu übermanipulieren, da Brüche im Herzen und lokale Vaskulatur, die durch die Injektionsnadel verursacht wird, zu einer verminderten Lebensfähigkeit führen können. Nach diesem Verfahren können eine Vielzahl von nachgelagerten Assays durchgeführt werden, einschließlich Immunhistochemie, In-situ-Hybridisierung und Zellsortierung.

Das Siliziummittel ist extrem entzündlich und akut giftig. Es sollte immer mit Sorgfalt und der richtigen persönlichen Schutzausrüstung in einer Dunstabzugshaube behandelt werden.