Optimierung der hochwertigen Gliom-Zellkultur von chirurgischen Proben für den Einsatz in klinisch relevanten Tiermodellen und 3D-Immunchemie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Entwicklung der routinemäßigen Neurosphäre, die Kultivierung hochgradiger Astrozytome und die großflächige Expansion von tumorogenen Zellen für präklinische Studien. Dazu werden zunächst frische Tumorproben akut dissoziiert und die einzelnen Zellen von den roten Blutkörperchen und Trümmern getrennt. Im zweiten Schritt werden die Tumorzellen in der Neurosphäre, einem mit Wachstumsfaktoren ergänzten Medium, kultiviert, bis Neurosphären beobachtet werden.

Neurosphären können für in vivo Experimente und molekulare Charakterisierung kultiviert oder formal und fixiert und in Paraffin eingebettet für die immunologische Charakterisierung verwendet werden. Letztendlich können die langfristige Selbsterneuerung der orthotopen Tumorbildung und das molekulare Profiling der Neurosphärenkulturen evaluiert werden. Der Hauptvorteil gegenüber bestehenden Methoden wie 10%FBS-Langzeit-Serumkulturen besteht darin, dass bei dieser Technik die molekularen und genetischen Eigenschaften des ursprünglichen Tumors erhalten bleiben.

Diese Methode ermöglicht den Aufbau einer lebenden Tumorbank zur Generierung von patientenspezifischen Glioblastom-Zellkulturen und Tiermodellen für klinisch relevante Forschung. Die Implikationen dieses Modells für die therapeutische Testung von Patienten mit malignen Gliomen liegen auf der Hand. Das Modell repräsentiert den Primärtumor am ehesten und ermöglicht die therapeutische Erprobung in einem präklinischen Umfeld.

Obwohl diese Methode Einblicke in hochgradige Gliome geben kann, kann sie auch auf andere menschliche und tierische Tumoren angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie angemessene sterile Techniken und Pflege sowie mehrere Schritte erfordert, um die langfristige Lebensfähigkeit der Zellen zu begünstigen. Wir hatten die Idee für die 3D-Histologie-Methode aufgrund der überlegenen subzellulären Lokalisierung der markierten Proteine und der Schnitte im Vergleich zu den gebräuchlicheren Methoden der Markierung und Abbildung der gesamten Neurosphären oder der Dissoziation der Zellen.

visuelle Demonstration dieser Histologiemethode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zum Fixieren, Löschen, Verarbeiten und Einbetten schwer zu erlernen sind. Es muss darauf geachtet werden, dass alle Neurosphären den Reagenzien angemessen ausgesetzt und gleichmäßig verarbeitet werden, um das beste verfügbare Pellet für die Morphologie und Immunhistochemie zu erhalten. Beginnen Sie mit 200 bis 500 Milligramm Tumorprobe, verwenden Sie eine Skalpellklinge, um das Gewebe zu zerkleinern.

Übertragen Sie die Stücke in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern Medium und invertieren Sie dann die Suspension mehrmals, um die Gewebelösung zu mischen. Lassen Sie die Tumorstücke durch die Schwerkraft sedimentieren und entfernen Sie dann das Medium. Waschen Sie die Trümmer von den Tumorstücken weiter, bis das Medium nicht mehr tur ist.

Entfernen Sie anschließend das Medium. Geben Sie zwei Milliliter enzymatische Dissoziationslösung pro 0,5 Gramm gemischter Tumorprobe hinzu und mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Inversion. Inkubieren Sie die Gewebelösung bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator unter Rotation.

Nach 30 Minuten wird die Suspension mit einer Zwei-Milliliter-Pipette tri bewertet. Wenn der Tumor zu einer meist einzelzelligen Suspension verdaut ist, stoppen Sie die Enzyme mit zwei Volumina Stopplösung und mischen Sie die Zellsuspension mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette. Filtern Sie nun das unverdaute Material durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb heraus und pelletieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 800-facher G-Temperatur und Raumtemperatur.

Nach drei Wäschen in 10 Millilitern Medium reanimation und suspendieren Sie das endgültige Zellpellet in fünf Millilitern Medien. Schichten Sie diese Zellsuspension langsam über fünf Milliliter Lympholicht M und trennen Sie die Zellpopulationen dann 20 Minuten lang bei 1300 mal G und Raumtemperatur. Sammeln Sie nun die Grenzschicht, die die kernhaltigen Zellen enthält, in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern Medium.

Dann resuspendieren Sie die Zellen in Neurossphärenmedium, das mit Wachstumsfaktoren ergänzt ist, und plattieren Sie sie mit weniger als 10 mal 10 Zellen pro Milliliter. In unregelmäßigem T 25 Gewebekulturkolben bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. In einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator.

Übertragen Sie die schwebenden Neurosphären, die sich im Laufe von ein bis drei Wochen bilden, in einen frischen Kolben, um sie von den anhaftenden Zellen und Trümmern zu trennen. Um die Neurosphären mit Hilfe der Immunhistochemie zu analysieren, pelletieren Sie zuerst die Neurosphären und achten Sie dann darauf, dass das Pellet nicht gestört wird. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 10 Milliliter DPBS in das Röhrchen.

Entfernen Sie dann das DPBS, suspendieren Sie das Pellet erneut in einem 10%igen neutral gepufferten Formin und inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Steroide wieder pelletiert haben, suspendieren Sie sie in einer Reihe von Ethanol-Inkubationen. Nach der zweiten 95%igen Ethanol-Inkubation resuspendieren Sie die PHE mit absolutem Ethanol, bis die Zellen hell, weiß und kondensiert sind.

Als nächstes machst du einen kleinen Kegel aus Linsenpapier. Geben Sie es in einen kleinen Trichter in einem Becherglas und befeuchten Sie das Linsenpapier mit absolutem Alkohol. Lockern Sie das Pellet leicht mit frischem 100%igem Ethanol auf und gießen Sie dann überschüssigen Alkohol ab.

Gießen Sie die Kugeln durch den Linsenpapierkegel, achten Sie darauf, dass sie bis zur Spitze gehen, und spülen Sie die Tube mit zusätzlichem absolutem Ethanol aus. Gießen Sie das restliche Steroid durch den Linsenpapierkegel und entfernen Sie dann den Kegel aus dem Trichter. Falten Sie dann das Linsenpapier zu einem Quadrat, achten Sie darauf, dass die Steroide so sicher wie möglich eingeschlossen sind, und übertragen Sie die Neurosphären der Verpackung auf eine Kassette.

Legen Sie nun die Kassette in einen automatischen Taschentuchprozessor und lassen Sie den Prozessor laufen. Entfernen Sie dann die Kassette und legen Sie sie auf den beheizten Teil eines Paraffineinbettsystems. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Oberfläche frei von Fragmenten, Staub oder anderen Ablagerungen ist, saugen Sie das gesamte Paraffin aus der Pinzette in den Erwärmungsbrunnen ab.

Erwärmen Sie dann eine saubere paraffinfreie Pinzette und geben Sie eine kleine Menge Paraffin in eine erwärmte Basisform. Nehmen Sie nun das Päckchen aus der Kassette und legen Sie es auf den beheizten Teil des Einbettsystems. Öffnen Sie das Papier vorsichtig, bis die Spritzer sichtbar sind.

Verwenden Sie die vorwarme Pinzette, um so viel Material wie möglich zu sammeln, und übertragen Sie dann die Sphäroide in das flüssige Paraffin in der Grundform. Brechen Sie vorsichtig alle Klumpen auf und bewegen Sie das Steroid von den Ecken weg in eine gleichmäßige zentrale Schicht. Bewegen Sie die Basisform in den Kühlbereich, um das Steroid an Ort und Stelle zu halten.

Zum Schluss setzen Sie die Kassette ein und füllen sie langsam mit Paraffin. Sobald die Kassette vollständig abgekühlt ist, kann der Paraffinblock der Neurosphäre immunhistochemisch geschnitten werden, wie in der Tabelle beschrieben. Die Effizienz dieses Protokolls für die Etablierung langfristiger Neurosphärenkulturen von insgesamt 88 neu diagnostizierten und 37 rezidivierenden Tumoren betrug 41,6 %, ähnlich sowohl für neu diagnostizierte Tumoren als auch für rezidivierende Tumoren.

Bei einigen der Glioblastom-Proben bildeten sich innerhalb der ersten Tage Neurosphären, während bei anderen eine längere Kultivierungszeit erforderlich war. Die Effizienz der Bildung der Neurosphäre hing nicht ausschließlich vom Grad der Nekrose im Gewebe ab, wie die Ergebnisse eines neu diagnostizierten Tumors mit hoher Zelldichte und eines rezidivierenden und nekrotischen Tumors zeigen, die beide wie gerade gezeigt wurden und Neurosphären lieferten, die das tumorogene Potenzial jeder Neurosphäre testeten. Die Kultur an immungeschwächten Mäusen ist eine entscheidende Bestätigung dieses Ansatzes für die Anreicherung von Krebsstammzellen.

In diesem Experiment wurden zwei verschiedene Glioblastom-Neurosphärenkulturen in die Gehirne immungeschwächter Mäuse implantiert. Die Xenotransplantat-Tumoren wiesen morphologische Merkmale von Glioblastomen auf, wie z. B. Invasion in das Gehirn, Parenchym und Nekrose. In diesem Experiment wurden Zellen, die keine Neurosphären bildeten, in Neurosphärenmedium kultiviert, das mit 2%FBS ergänzt wurde, der Tumorbildung dieser alternativen Medienzellen.

Im Vergleich zum Glioblastom wurde das Xenotransplantat von Neurosphären in Nacktmausempfänger untersucht. Keine Unterschiede im Überleben. Die Dynamik des Tumorwachstums bzw. die Morphologie wurde zwischen den beiden Vorkulturmethoden beobachtet.

Während neurale Stammzellmarker, einschließlich SOX zwei, in den meisten primären Glioblastomzellen herunterreguliert sind, kultiviert in 10%FBS-Glioblastomzellen, die in Neurosphärenmedium gezüchtet wurden, behalten die mit 2%FBS ergänzten 2%-Zellen die SOX-2-Expression nach der Verarbeitung bei, wie gerade gezeigt. Und in diesem Experiment wurden Neurosphären mit h und e Antiox, zwei Antikörpern zum Nachweis der Kernlokalisation und epidermalen Wachstumsfaktor-Antikörpern zur Veranschaulichung der Zellmembranlokalisation markiert. Wie die resultierenden Bilder veranschaulichen, optimiert die demonstrierte Methode die Analyse der Proteinexpression und posttranslationaler Modifikationen, während die 3D-Architektur der Neurosphären beibehalten wird. Einmal gemeistert, kann diese Gewebedissoziationstechnik in etwa zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch des Eingriffs ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Zeitintervall zwischen Operation und Assoziation, sowie die heterogene molekulare Zusammensetzung hochgradiger Gliome kann das Ergebnis nach diesem Verfahren beeinflussen.

Andere Methoden wie die intrakranielle Implantation können durchgeführt werden, um den ursprünglichen Tumor im Tiermodell zu rekapitulieren. Diese Technik revolutioniert die Neuroonkologie und ermöglicht präklinische Tests in einem klinisch relevanten Umfeld. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man langfristige Neurosphären entwickelt und erhält und wie man formale und fixierte paraffineingebettete Neurosphären für die molekulare Analyse herstellt.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Gewebe äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie persönlicher Schutz, verträgliche und potenziell gefährliche Mittel verwendet werden sollten.