Ein Orthotopische Glioblastoma Maus-Modell Pflege Gehirn Parenchymale Körperliche Einschränkungen und geeignet für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein orthotopes Glioblastommodell zu generieren, das für die intravitale optische Bildgebung in der Großhirnrinde der Maus geeignet ist. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Schädelfenster über der parietalen Rinde erstellt wird. Der nächste Schritt des Eingriffs ist die Implantation eines Glioblastom-S-Sphäroidtumors in die oberflächlichen Schichten des Gehirns.

Parenchym, das dann den Dator versiegelt und die Injektion verstopft. Track treibt die intraparenchymale Tumorentwicklung hinzu und hält biophysikalische Einschränkungen aufrecht. Der letzte Schritt besteht darin, ein Glasfenster in engem Kontakt mit der Gehirnoberfläche zu versiegeln, um Narbengewebe zu verhindern und so eine optimale Klarheit während der Bildgebung zu gewährleisten.

Letztendlich können die Ergebnisse das Fortschreiten des Glioblastom-Tumors, den Gefäßumbau und die zelluläre Mikroumgebung mit Einzelzellauflösung durch intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie zeigen. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir versuchten, die Selbstsuspension von Selbststeroiden ohne physische Barriere zu transplantieren, um ein Entweichen der Zellen zu vermeiden, und dies führte hauptsächlich zu unphysiologischem, in vitro ähnlichem zusätzlichem Wachstum. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Neuroonkologie beantworten, wie z.B. die Rolle des vaskulären Umbaus und die regulatorischen Effekte zellulärer Interaktionen während des Blato.

Um das Steroid zu implantieren, beginnen Sie damit, die Maus in einer Gaskammer leicht zu sedieren, und betäuben Sie die Maus dann vollständig mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin mit Xylazin. Führen Sie die Operation in einem warmen Raum bei 26 Grad Celsius durch und halten Sie die Maus mit einem steuerbaren Heizkissen warm. Nach dem Auftragen von Augensalben und dem Rasieren der Kopfhaut platzieren Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen mit Ohrstangen und einem Mundstück, wobei das Tier in Position ist.

Reinigen Sie die Haut mit 3% Seife und 10% Jodlösung. Machen Sie nun mit einer Schere einen einen einen Zentimeter langen Schnitt in Längsrichtung in der Mitte der Kopfhaut. Schneiden und entfernen Sie mit einer Skalpellklinge die Haut über den Scheitelknochen, entfernen Sie vorsichtig das Periost über dem Schädel.

Tragen Sie Cyanacrylate großzügig auf den Knochen auf, um eine raue Oberfläche für eine spätere Zementhaftung zu erzeugen. Planen Sie nun unter dem Operationsmikroskop mit einer Skalpellklinge, den Scheitelknochen mindestens einen Millimeter von den Schädelnähten entfernt zu bohren, um Blutungen zu vermeiden, und schließlich den Scheitelknochen über einer Gehirnhälfte während des Bohrens zu entfernen, fügen Sie viel eiskaltes PBS mit Penicillin und Streptomycin hinzu, um eine Überhitzung zu verhindern. Knochenfragmente können etwa jede Minute mit einer Pinzette und nasser Gaze entfernt werden, und dann können alle entfernt werden, wenn die Bohrung abgeschlossen ist.

Als nächstes dann der Knochen an der Grenze der Kraniotomie, wo das Glasfenster verschlossen wird. Bohren Sie, bis das Knochenstück schwach befestigt ist, und meißeln Sie den Knochen schließlich langsam mit einer Pinzette. Letztendlich sollte das Fenster gegen so viel Hirngewebe wie möglich gerichtet sein.

Nachdem der Fensterrahmen fertiggestellt ist, testen Sie ihn mit einem trockenen, alkoholgereinigten, fünf Millimeter dicken runden Glasabdeckglas. Fahren Sie bei Bedarf mit dem Meißeln fort, bis das Gehirn mit leichtem Druck auf den Deckglas flach gedrückt wird. Reinigen Sie dann den Deckbezug erneut und legen Sie ihn beiseite, um die Dura Mater zu öffnen.

Machen Sie mit einer 26-Gauge-Nadel ein Loch in der Mitte der Kraniotomie und vermeiden Sie dabei die Blutgefäße von Maine. Achten Sie darauf, das Hirnparenchym nicht zu beschädigen. Reinigen Sie die Dira Mater vorsichtig mit PBS und decken Sie sie dann mit feuchtem Seidenpapier ab, während Sie das Sphäroid vorbereiten.

Dieses Verfahren erfordert die vorherige Vorbereitung des Sphäroid-Injektionssystems und einer Petrischale. Aspirieren Sie zunächst ein rundes Steroid, das in den Kapillarinnendurchmesser der Petrischale passt. Das Steroid sollte mit etwa fünf Mikrolitern Nährmedium geliefert werden und unter seinem eigenen Gewicht bis zur Spitze der Kapillare fallen.

Entfernen Sie das feuchte Seidenpapier, mit dem die Kraniotomie abgedeckt wurde, und positionieren Sie das Tier unter dem Injektionssystem. Senken Sie die Injektionspipette ab, bis sie das Loch in der Dura mater berührt. Senken Sie es dann wieder um 250 Mikrometer ab und warten Sie 30 Sekunden.

Injizieren Sie das Steroid langsam mit dem Kolben der Mikroliterspritze, zwei bis drei Mikroliter, während Sie die überschüssige Flüssigkeit mit einem dünnen Stück Seidenpapier aufsaugen. Warten Sie 30 Sekunden und heben Sie dann die Injektionspipette vorsichtig um 50 Mikrometer an. Warten Sie dann weitere 30 Sekunden, bevor Sie weitere 50 Mikrometer anheben.

Wiederholen Sie dieses Muster weiter, um die Pipette an die Oberfläche zu bringen. Bestätigen Sie nun das Vorhandensein des Steroids im Gehirn mit einem Fluoreszenzmikroskop in einer Petrischale. Bereiten Sie eine viskose, getränkte Bead-Lösung mit einem Durchmesser von einem bis 300 Mikrometern vor.

Vernetzung von Dexter und Gelkügelchen und PBS. Warten Sie eine Minute und übertragen Sie einige der hydratisierten Kügelchen unter mikroskopischer Kontrolle auf den Knochen neben der Kraniotomie, wählen Sie eine Perle mit einem Durchmesser, der der Größe der Durchmesseröffnung entspricht. Schneiden Sie die Vernetzungen DExT Stranggelperle in zwei Hälften.

Führen Sie mit einer Pinzette vorsichtig eine vernetzte Dextra- und Gel-Hemi-Perle in das Injektionsloch ein, mit einer konvexen Fläche in Richtung des S-Sphäroids. Seien Sie sich der Zerbrechlichkeit des Implantats bewusst und drücken Sie vorsichtig auf die Perle, bis ihre flache Oberfläche mit der Dura mater übereinstimmt. Geben Sie als Nächstes einen Tropfen Cyanacrylatkleber auf einen Objektträger und versiegeln Sie mit einem Zahnstocherkleber die Ränder der DExT-Strangraupe.

Stempele den Kleber schnell und genau herum, sonst kann die Raupe am Zahnstocher kleben. Verwenden Sie nicht zu viel Kleber, sondern genug, um eine Veränderung der Porosität der Raupe zu bewirken. Wie hier an Beispielperlen dargestellt, besteht dieser sehr heikle Schritt zur Gänze.

Versiegeln Sie die Raupe mit dem ter und dem umgebenden Parenchym mit gerade so viel Sack, dass kein Gesäßstoß entsteht, der sonst die Platzierung des Glasfensters und die langfristige optische Klarheit beeinträchtigen würde. Warten Sie zwei Minuten, bis der Kleber getrocknet ist, und reinigen Sie dann die Kraniotomie im umgebenden Knochen mit normalem PBS. Positionieren Sie nun das vorbereitete Deckglas über dem Kraniotomie.

Die Ränder des Deckglases müssen auf dem dünnen Schädelumfang aufliegen und die darunterliegende Dura mater muss mit dem Glas in Kontakt kommen, sonst kann sich Narbengewebe bilden und die optische Klarheit mit dem Gewebe beeinträchtigen. Absorbieren Sie das PBS entlang der Deckglaskanten, so dass die Lösung den Kraniotomie nicht bedeckt. Wenn Sie einen kleinen Druck auf die Mitte des Deckglases ausüben, wird sichergestellt, dass Knochen, Glas und Gehirn an der interessierenden Stelle miteinander verklebt werden.

Halten Sie mit einer Pinzette leichten Druck in der Mitte des Deckglases aufrecht, während Sie vorsichtig Cyanacrylat an der Grenze zwischen Knochen und Deckglas auftragen, der Kleber verteilt sich spontan, bis er von der PBS-Lösung abgestoßen wird. Innerhalb einer Minute bildet sich eine wirksame Versiegelung, aber achten Sie äußerst darauf, das Deckglas nicht zu bewegen, bis es fixiert ist, da sonst die Operation aufgrund von Klebstoffleckagen fehlschlägt. Wenn sich Klebstoff auf dem Glas verteilt, entfernen Sie ihn mit einer Mikroskalpellklinge mit leichtem Druck und spiralförmigen Bewegungen, um die optische Klarheit zu erhalten.

Festigen Sie nun die Glasfixierung, indem Sie Zahnzement auf die Ränder der Abdeckung auftragen. Schlüpfe in Richtung des angrenzenden Schädels. Decken Sie den gesamten freiliegenden Schädel bis zur Kopfhaut mit zusätzlichem Zement ab.

Bauen Sie Seitenwände um den Deckglas auf, so dass eine Lösungslache über dem Glas gebildet werden kann. Für das Immersionsziel ist zu beachten, dass die Zahnzemente in weniger als 10 Minuten aushärten. Nachdem Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen genommen haben, legen Sie sie in einen Käfig mit einem warmen Gewebenest und fahren Sie mit einer postoperativen Pflege fort.

Das Tumorwachstum unterhalb der Dura mater kann noch Wochen nach der Implantation beobachtet werden. Die Entwicklung dieses Tumors wurde im Laufe der Zeit mit einem Fluoreszenzmikroskop abgeschätzt, wobei die Schrägbeleuchtung für die Hellfeldreflexionsbildgebung und die Epi-Fluoreszenzemissionsschwelle kombiniert wurde. Die Schwelle der Fluoreszenz ermöglicht einen leichten Zugang zum Tumorbereich, während sich oberflächliche Gefäße als dunkle Strukturen aus dem weißen Hintergrund des sichtbaren Lichtbildes lösen. Alternativ ermöglicht die intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie Z-Schnitte und orthogonale Rekonstruktionen von großen Gesichtsfeldern mit subzellulärer Auflösung, wie z. B. Dendriten.

Das Grün zeigt die Expression von cyanfluoreszierenden Proteinen und Neuronen, die das Tumorwachstum mit Zwei-Photonen-Mikroskopie von Tag 16 bis Tag 27 verfolgen. Einige Blutgefäße, die durch Pfeile hervorgehoben sind, waren über die 11 Tage stabil, während sich der umrissene Tumorrand um 520 Mikrometer verschob und sich das Gefäßsystem des Tumors an den Tumorrändern veränderte. Die Ablösung von Gliomzellen war vom Tumorkern aus zu sehen, wie man es von einem invasiven Tumor erwartet.

Diese Zellen emittieren zytoplasmatische Ausstülpungen und verwenden Blutgefäße als Matrix für ihr Fortschreiten, die durch die Pfeilspitzen in Kombination mit einem fluoreszierenden Reporter angezeigt werden. Diese Methode ermöglicht es, solche physikalischen Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und ihrer Umgebung als Schlüsselfaktoren für das Fortschreiten der Krankheit zu betrachten. Unbeherrscht kann diese Methode in 45 Minuten bis zu einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren wird es nicht gemeistert.

Andere präklinische bildgebende Verfahren wie Fluoreszenztomographie, Röntgen, CT, Scanner, MRT können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Infiltration von Neoblastomzellen in das alte Gehirn zu beantworten.