Name: Vorbereitung der segmentierte Mikrotubuli auf Anträge von der Demontage Microtubule Ends Driven Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Lernen Sie die Vorbereitung segmentierter Mikrotubuli mit photolabilen Kappen zur Untersuchung von Proteindynamiken an depolymerisierenden Enden. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle der Mikrotubulidynamik für zellbiologische Studien.

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Die Autoren möchten FI Ataullakhanov für die Hilfe, für die Bereitstellung von Bildern für Zahlen, N. und P. Gudimchuk Zakharov für die Entwicklung eines Protokolls und die Bereitstellung Reagenzien zu entwickeln und herzustellen wiederverwendbare Strömungskammern, N. Dashkevich, N. und A. Gudimchuk Korbalev danke vorzubereiten Digoxigenin-markierten Mikrotubuli-Samen, A. Potapenko für die Hilfe bei Textbearbeitung und andere Mitglieder der Grishchuk Labor für Tipps und Diskussionen. Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt durch NIH gewähren GM R01-098389 und ein Pilot Zuschuss von Pennsylvania Muscle Institute ELG, der ein Kimmel Scholar ist, durch RFBR gewährt 12-04-00111-eine 13-04-40190-H und 13 -04-40188-H, Russische Akademie der Wissenschaften Präsidium Grants (Mechanismen des Molecular Systems Integration und Molekulare Zellbiologie und Molekulare Programme) zu FI Ataullakhanov, NIH gewähren GM R01 GM033787 JR McIntosh, und Dmitry Zimin Dynastie Stiftung Postdoc-Stipendium an VAV

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Viele Einzelmolekül-Assays heutzutage routinemäßig speziell behandelt, um unspezifische Proteindeckknack drastisch zu reduzieren. Das Verfahren, das wir hier beschreiben, ist eine Modifikation der in Howard Labor 32 Original-Protokoll entwickelt, und wir finden, dass die Deckgläser Silanisierung ist die Mühe wert, auch mit DIC-basierte Assays Perle, die nicht mit Fluoreszenz. Kammern mit solchen Deckgebaut zeigen viel sauberer Oberflächen, und die in Gegenwart von löslichen Mikrotubuli-Bindungsprotein erhalte...

Mikrotubuli sind hoch konserviert Strukturen des Zytoskeletts, die wichtig für die zelluläre Architektur, Zellbewegung, Zellteilung und intrazellulären Transport 1 sind. Diese dynamischen Polymeren zusammen von Tubulin in Gegenwart von GTP und spontan zwischen Wachstum und Verkürzung 2 wechseln. Mikrotubuli sind sehr dünn (nur 25 nm Durchmesser) daher besondere optische Techniken, um Kontrast verbessern sollte verwendet werden, um Mikrotubuli mit einem Lichtmikroskop zu beobachten. Frühere Arbeiten mit diesen Polymeren untersucht ihr dynamisches Verhalten mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) 3. Diese und ähnliche Studien in vitro gezeigt, dass unter typischen experimentellen Bedingungen, die Mikrotubuli unterziehen Katastrophe und Schalter auf der Depolymerisation nur selten, einmal alle 5-15 Minuten (diese Frequenz für 7-15 mM bei 28 bis 32 ° C untersucht löslich Tubulin-Konzentration ) 4. Verschiedene Techniken wurden so Induktions vorgeschlagene Depolymerisation von Mikrotubuli in einer kontrollierten Weise. Mikrotubuli Verkürzung kann durch Waschen entfernt lösliche 5,6 Tubulin, Mikrotubuli Schneiden mit einem Laserstrahl 7 oder 8 unter Verwendung von segmentierten Mikrotubuli, wie hier beschrieben, ausgelöst werden. Frühere Arbeiten mit segmentierten Mikrotubuli sowie stochastisch Schalt Polymere, hat festgestellt, dass die kleinen intrazellulären Ladungen, wie Chromosomen, Vesikel und Perlen-Protein-beschichtet ist, kann an den Enden der Mikrotubuli Verkürzung 9-13 bewegen. Dieses Phänomen wird gedacht, um eine direkte Auswirkungen auf Chromosom Bewegungen in mitotischen Zellen zu haben, und die zugrunde liegenden Mechanismen sind derzeit aktiv untersucht 14-16. Kürzlich, fluoreszenzbasierten Techniken, einschließlich der vollständigen internen Reflexion (TIRF) Mikroskopie, wurden eingesetzt, um die Motilität mit dynamischen Mikrotubuli untersuchen endet 17-24. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es ermöglicht die Untersuchung der Wechselwirkungs zwischen Mikrotubuli und Mikrotubuli-bindende Proteine ​​in Echtzeit unter Verwendung von Proteinen mit verschiedenen Fluorophoren markiert sind. Mehrere Protein-Komplexe wurden gefunden, um prozessiv mit Verlängerung und / oder Verkürzung der Mikrotubuli-Enden zu bewegen. Sie umfassen die Mikrotubuli-assoziierten Proteinen Dam1 10,12,18, SKA1 19 und 20 XMAP215 sowie Kinesin-Motoren Kif18A 21,22, MCAK 23 und CENP-E 24. Diese Proteine ​​zeigen prozessive tip-Tracking, die sich grundlegend von der der klassischen Spitze-Tracking-Proteine ​​wie EB1 25 ist. Obwohl EB1-Moleküle und die assoziierten Partner erscheinen stabil mit dynamischen Mikrotubuli-Enden, die einzelnen Moleküle bleiben an der Spitze der Mikrotubuli für nur ~ 0,8 s gebunden ist, schnell den Austausch mit dem löslichen Pool 26 zugeordnet bleiben. Im Gegensatz dazu prozessive Spitze-trackers, wie Dam1, reisen mit Mikrotubuli-Enden für viele Mikrometer und ihre Assoziation mit Mikrotubuli-Tipps können für m dauernkeine Sekunden. Die Spitze Assoziation Zeit sowie die resultierende Geschwindigkeit der Verfolgung, hängt stark von der Anzahl der Moleküle, die die Spitze-Tracking-Komplex 27 zu bilden. Größere Protein-Ensembles sind in der Regel viel besser Spitze-trackers. Zum Beispiel können solche komplexen Baugruppen der isolierten Hefe Kinetochore Mikrotubuli gekoppelt bleiben Enden für 28 Stunden. Einige Mikrotubuli-bindende Proteine, wie zB Ndc80 Kinetochorenprotein Komplex gefunden werden nicht mit Mikrotubuli Bahnenden an einer Einzelmolekülebene, noch Ndc80 ist sehr effizient bei der Kopplung der Bewegung der Wulst Ladung 19,29-31. So, um den Mechanismus der Spitze-Tracking von verschiedenen Protein-Komplexe, sowie deren biologische Funktionen zu verstehen, ist es wichtig, Spitze-Tracking in Abhängigkeit von der Anzahl der Moleküle in der Spitze-Tracking-Komplex zu untersuchen, sowie um zu bestimmen, die Fähigkeit dieser Komplexe Tarif Motilität auf der Oberfläche der Perle Ladung aufweisen. (1A) vorzubereiten und durchzuführen Experimenten. Zunächst werden die im Handel erhältlichen Glasobjektträger modifiziert, um kurze Polyethylenschlauch (Protokoll 1) befestigen. Die wiederverwendbare Mikroskopie Flusskammer wird dann aus wie eine Folie die chemisch oder Plasma-gereinigt und silanisierten Deckglas (Protokoll 2) 32-34 montiert und. Die daraus resultierende Raumvolumen ist nur 20-25 ul (oder so klein wie 15 ul, siehe Anmerkung 3 in Protokoll Nr. 1), einschließlich des Volumens der Einlassschlauch. Kommerziell erhältlich Strömungskammern können auch verwendet werden, aber ihr Volumen ist in der Regel größer, was zu einer unnötigen Verschwendung von Proteinen. Wenn eine größere Kammer verwendet wird, sollte das Volumen aller Lösungen in folgenden Protokolle proportional skaliert werden. Mikrotubuli Samen werden dann mit langsam hydrolysierbaren GTP-Analog, GMPCPP (Guanosin-5&#39;-[(α, β)-methyleno] Triphosphat) (Protokoll 3 hergestellt, zum Beispiel, siehe auch Hyman &lt;em&gt; et al. 35). Die Samen werden auf einem gereinigten Deck immobilisiert und die Oberfläche wird anschließend blockiert, um die unspezifische Absorption von anderen Proteinen verhindern, 32 (Protokoll 4 beschreibt Samen Immobilisierung mit Digoxigenin). Die segmentierten Mikrotubuli können dann mit Protokoll Nr. 5 hergestellt werden. Der Hauptgrund für diesen Ansatz ist, dass dynamische Mikrotubuli-Polymere, die in Gegenwart von GTP zu bilden, kann vorübergehend durch Addieren der kurzen &quot;Kappen&quot; von stabilen Tubulin-Segmente, die GMPCPP enthalten stabilisiert werden. Diese Kappen enthalten Rhodamin-markierten Tubulin, so können sie einfach mit einem 530-550 nm-Laser-oder Quecksilberbogenlampe (Protokoll Nr. 6) 36 Beleuchten des Sichtfeldes entfernt werden. Die Fluoreszenzintensität der Spitze-Tracking-Signal kann dann verwendet werden, um die Anzahl der Moleküle, die mit der Demontage der Mikrotubuli-Enden reisen zu schätzen, unter Berücksichtigung der Unebenheiten des Mikroskops Feldbeleuchtung (Protokoll 7) werden. Ein ähnlicher Ansatz kann verwendet werden,Wechselwirkungen zwischen Depolymerisation von Mikrotubuli und Perlen-Protein-beschichteten, hergestellt wie in 27 (Protokoll 8) beschrieben zu studieren. Einige Proteine ​​werden leicht an den Wänden des segmentierten Mikrotubuli binden, aber Laserpinzette können auch verwendet werden, um den Wulst in der Nähe der Mikrotubuli Wand halten, wodurch die Förderung ihrer verbindlich.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabelle 1. Mikroskopie und andere Geräte.</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss Nikon</td><td>Axio Imager 2 Eclipse Ti</td><td>andere Mikroskopmodelle, die DIC- und Epifluoreszenz-Bildgebung unterstützen, können verwendet werden</td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Zeiss Nikon</td><td>420490-9900-000 CFI Apo 100x Öl 1,49</td><td>100X, DIC, 1,3-1,49 NA</td></tr><tr><td>Objektivheizung</td><td>Bioptechs</td><td>150803, 150819-19</td><td></td></tr><tr><td>Leuchtstofffilterwürfel</td><td>Chroma</td><td>49004 oder 49008 41017 oder 49020</td><td>optimiert für Rhodamin-Fluoreszenz&nbsp; optimiert für GFP-Fluoreszenz</td></tr><tr><td>Erfassungssoftware</td><td>Freeware MicroManager Molecular Devices</td><td>nicht anwendbar MetaMorph 7.5</td><td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ andere Software kann zur Aufnahme von Bildern und für eine Partikelverfolgung verwendet werden</td></tr><tr><td>EMCCD-Kamera</td><td>Andor</td><td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td><td>Hochempfindliche EMCCD-Kamera</td></tr><tr><td>Trapping-Laser</td><td>IPG Photonik</td><td>YLR-10-1064-LP</td><td>1.064 nm Laser, 10 W</td></tr><tr><td>Fluoreszenzanregungslaser</td><td>Coherent, Inc. Coherent, Inc.</td><td>Sapphire 488 LP Sapphire 552 LP</td><td>Anregung von grünen Fluorophoren Anregung von roten Fluorophoren</td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Kommerzielle Durchflusskammern</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-20 oder RC-30</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionspumpe</td><td>Cole Palmer Harvard Apparatur</td><td>Masterflex 77120-52 Pico Plus</td><td>Beide Pumpen liefern die erforderliche Flüssigkeitsdurchflussrate, aber eine Schlauchpumpe kann mit sehr langsamer Geschwindigkeit pulsieren. Der Durchfluss mit einer Spritzenpumpe ist für einen weiten Bereich von Raten gleichmäßiger, aber diese Pumpe hat eine Trägheit.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabelle 2. Vorbereitung der Mikroskopiekammer.</td></tr><tr><td>Modifizierte Objektträger für wiederverwendbare Kammern</td><td>Precision Glassblowing of Colorado</td><td>Custom Order www.precisionglassblowing.com</td><td>Sonic steckt Objektträger unter Verwendung von Schaltplänen in Abbildung 1</td></tr><tr><td>Polyethylen-Schlauch</td><td>Intramedic</td><td>427410</td><td>Innendurchmesser 0,58 mm, Außendurchmesser 0,965 mm; verwenden Sie diese Röhren, um die zusammengebaute Kammer mit der Pumpe und dem Abfallbehälter zu verbinden</td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch</td><td>Intramedic</td><td>427400</td><td>Innendurchmesser 0,28 mm, Außendurchmesser 0,61 mm; verwenden Sie diese Röhrchen zur Herstellung der wiederverwendbaren Kammer</td></tr><tr><td>Reguläre Objektträger</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Andere ähnliche Objektträger können verwendet werden</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>VWR</td><td>48393-150, 48366-067</td><td>Andere ähnliche Deckgläser können verwendet werden</td></tr><tr><td>Silikondichtstoff</td><td>World Precision Instruments</td><td>KIT, SILIKONDICHTSTOFF 5 MIN AUSHÄRTUNG</td><td></td></tr><tr><td>Epoxidkleber</td><td>Loctite</td><td>83082</td><td></td></tr><tr><td>Cyanacrylat-Klebstoff</td><td>Scotch 3M</td><td>AD114</td><td>Oder Cyanacrylat-Klebstoff anderer Hersteller</td></tr><tr><td colspan="4">Tabelle 3. Deckgläser Reinigung und Beschichtung.</td></tr><tr><td>Molekularsiebe, Güteklasse 564</td><td>Macron</td><td>4490-04</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas-Färbeglas</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>21036</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas Keramikhalter</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542e40</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne Repel Silan</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin AB</td><td>Roche Applied Science</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabelle 4. Aufbereitung von Samen und segmentierten Mikrotubuli.</td></tr><tr><td>Tubulin</td>, <td>gereinigt aus Kuhgehirnen Cytoskeleton, Inc</td><td> T238P</td><td>Für Aufreinigungsprotokolle siehe 49&ndash; 51 Unmarkiertes Schweinetubulin</td></tr><tr><td>Markiertes Tubulin</td><td>Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen</td><td>TL590M C1171 (Rhodamine) A-2952 (Digoxigenin)</td><td>Rhodamin-markiertes Schweinetubulin Tubulin kann mit jedem aminreaktiven Farbstoff markiert werden, wie in der Referenz52 beschrieben.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-405</td><td>Aliquot und Lagerung bei -70 &deg; C</td></tr><tr><td>VALAP</td><td>Vaseline, Lanolin und Paraffin in einem Massenverhältnis von 1:1:2</td><td></td><td>siehe Referenz9</td></tr></tbody></table>

vorbereitung der segmentierte mikrotubuli auf anträge von der demontage microtubule ends driven studieren

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Mikrotubuli-Depolymerisation Kraft zu liefern, um verschiedene Proteinkomplexe und Perlen-Protein-beschichteten in vitro zu transportieren. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind vermutlich eine wichtige Rolle bei der Mikrotubuli-abhängige Chromosomenbewegungen während der Zellteilung spielen, aber die entsprechenden Proteine ​​und ihre genauen Aufgaben sind schlecht definiert. Somit gibt es einen wachsenden Bedarf an Assays, mit denen eine solche Beweglichkeit in vitro-Studie unter Verwendung von gereinigten Komponenten und definierten biochemischen Milieu entwickeln. Mikrotubuli sind jedoch inhärent instabil Polymere, ihre Umschaltung zwischen Wachstum und Verkürzung stochastisch und schwierig zu steuern. Die Protokolle beschreiben wir hier die Vorteile der segmentierten Mikrotubuli, die mit der Stabilisierung photoablatable Kappen hergestellt werden. Depolymerisation von solchen segmentierten Mikrotubuli mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ausgelöst werden, wodurch die Unterstützung der Motilität Studien an den Mikrotubuli-Enden der Demontage. Diese Technik kann verwendet werden, um ca.RRY eine quantitative Analyse der Anzahl der Moleküle in der fluoreszenzmarkierte Proteinkomplexe, die mit dynamischen Mikrotubuli prozessiv Enden zu bewegen. Ein Signal-zu-Rausch-Verhältnis in diesem und anderen quantitativen Fluoreszenz-Assays zu optimieren, sollte Deck behandelt, um unspezifische Absorption von löslichen fluoreszierend markierten Proteinen zu reduzieren. Detaillierte Protokolle vorgesehen sind, um der Unebenheit der Fluoreszenzbeleuchtung zu nehmen und zu bestimmen, die die Intensität eines einzelnen Fluorophors mit äquidistanten Gauß Form. Schließlich beschreiben wir die Verwendung von segmentierten Mikrotubuli Mikrotubuli-abhängigen Bewegungen der Protein-beschichteten Mikroperlen zu untersuchen, die einen Einblick in die Fähigkeit der verschiedenen Motor-und nichtmotorisiertem Proteine ​​zu koppeln Mikrotubuli-Depolymerisation prozessive Fracht Bewegung.

Protein-Tracking mit Depolymerisation von Mikrotubuli-Enden. Hefe Kinetochor Komponente Dam1 ist mit Abstand der beste Tipp-Tracker der Depolymerisation von Mikrotubuli-Enden 14. Dieses 10-Untereinheit Komplex mit GFP-markierten leicht ausgedrückt und aus Bakterienzellen 18,38 gereinigt, so dass wir empfehlen, es als eine positive Kontrolle für den Tipp-Tracking-Assay. Ein fluoreszierendes Protein, das mit dem Ende einer Depolymerisation der Mikrotubuli-Tracks als hell fluoresziere...

Mikrotubuli sind Polymere von Natur aus instabil, und deren Umschaltung zwischen Wachstum und Verkürzung stochastisch und schwierig zu steuern. Hier beschreiben wir Protokolle mit segmentierten Mikrotubuli mit photoablatable stabilisierende Kappen. Depolymerisation von Mikrotubuli segmentiert mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ausgelöst werden, wodurch die Unterstützung Analyse der Bewegungen mit den Mikrotubuli-Enden der Demontage.

Vorbereitung der segmentierte Mikrotubuli auf Anträge von der Demontage Microtubule Ends Driven Studieren

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Bewegungen von Proteinmolekülen und proteinbeschichteten Kügelchen mit den Enden depolymerisierender Mikrotubuli zu untersuchen. Dies wird durch die Montage einer wiederverwendbaren Durchflusskammer mit einem sauber dimensionierten Abdeckglas erreicht. Als nächstes werden Mikrotubuli-Samen vorbereitet, die auf dem Deckglas befestigt sind, und zur Keimbildung von Mikrotubuli verwendet, die dann vorübergehend mit photozerstörbaren Kappen stabilisiert werden.Dann werden GFP-markierte Proteine oder proteinbeschichtete Kügelchen in die Durchflusskammer eingeführt und binden an segmentierte Mikrotubuli. Die Depolymerisation der Mikrowanne wird dann durch Entfernen der Kappen durch Photoablation ausgelöst. Die Bilder werden mit CH analysiert, um festzustellen, ob die markierten Proteine ein Tip-Tracking-Verhalten aufweisen, d. h. eine Bewegung mit den Enden depolymerisierender Mikrotubuli.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das Auslösen der Mikrotubuli-Isierung mit hoher zeitlicher und spezieller Auflösung ermöglicht. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung. Das Protokoll be

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Forschung

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Biologie

Dieses Video beschreibt TIRF, eine auf Totalreflexionsmikroskopie basierende Technik zur Visualisierung der Polymerisationsdynamik von Aktin und Mikrotubuli. Die Methode ermöglicht die hochauflösende Abbildung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in Echtzeit, was für das Verständnis zellulärer Wechselwirkungen unerlässlich ist.

TIRF-Mikroskopie zur Visualisierung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli

Hefe Angehende ist ein vorteilhaftes Modell die Dynamik der Mikrotubuli in vivo aufgrund seiner leistungsstarken Genetik und die Einfachheit der Mikrotubuli - Zytoskelett für das Studium. Das folgende Protokoll beschreibt, wie zu transformieren und Kultur Hefezellen, konfokale Mikroskopie Bilder erfassen und quantitativ die Dynamik der Mikrotubuli in lebenden Hefezellen analysieren.

Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe

Hier stellen wir eine robuste und detaillierte Methode der Mikrotubuli-Dynamikanalyse in Zellen vor, die in der Prometaphase mit Live-Zell-Spinnscheibe konfokaler Mikroskopie und MATLAB-basierter Bildverarbeitung synchronisiert werden.

Messung der Mikrotubuli-Dynamik durch Spinnen der Disk-Mikroskopie in Monopolar-Mitotischen Spindeln

Mikrotubuli, bei denen es sich um Tubulin-Polymere handelt, spielen eine entscheidende Rolle als Bestandteil des Zytoskeletts in eukaryotischen Zellen und sind für ihre dynamische Instabilität bekannt. In dieser Studie wurde eine Methode zur Fraktionierung von Mikrotubuli entwickelt, um sie in stabile Mikrotubuli, labile Mikrotubuli und freies Tubulin zu trennen, um die Stabilität von Mikrotubuli in verschiedenen Mausgeweben zu bewerten.

Quantitative Mikrotubuli-Fraktionierungstechnik zur Trennung von stabilen Mikrotubuli, labilen Mikrotubuli und freiem Tubulin in Mausgewebe

Hier wird ein TIRF-Mikroskopie-basierter  In-vitro-Rekonstitutionsassay vorgestellt, um gleichzeitig die Dynamik zweier Mikrotubulipopulationen zu quantifizieren und zu vergleichen. Es wird ein Verfahren beschrieben, um gleichzeitig die kollektive Aktivität mehrerer Mikrotubuli-assoziierter Proteine auf vernetzten Mikrotubulibündeln und einzelnen Mikrotubuli zu betrachten.

Simultane Visualisierung der Dynamik von vernetzten und einzelnen Mikrotubuli in vitro mittels TIRF-Mikroskopie

Hier stellen wir ein Protokoll zur Rekonstitution von Mikrotubulibündeln in vitro und zur direkten Quantifizierung der in ihnen ausgeübten Kräfte durch simultanes optisches Einfangen und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Dieser Assay ermöglicht die Messung der Kräfte und Verschiebungen, die von Proteinensembles in aktiven Mikrotubuli-Netzwerken erzeugt werden, auf Nanoskala-Ebene.

Direkte Messung von Kräften innerhalb rekonstituierter aktiver Mikrotubulibündel

Diese Studie beschreibt die Reinigung von KIF1A (1-393LZ), einem Mitglied der Kinesin-3-Familie, unter Verwendung des Sf9-Baculovirus-Expressionssystems. Die In-vitro-Einzelmolekül - und Multimotor-Gleitanalyse dieser gereinigten Motoren zeigte robuste Motilitätseigenschaften, die mit Motoren aus Säugetierzelllysat vergleichbar sind. Somit ist das Sf9-Baculovirus-System in der Lage, Motorprotein von Interesse zu exprimieren und zu reinigen.

Einzelmolekülanalyse von Sf9-gereinigten superprozessiven Motoren der Kinesin-3-Familie

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Selbstorganisation von Mikrotubuli-Taktoiden

Dieser Artikel stellt Protokolle für die Entwicklung und Charakterisierung abstimmbarer dreidimensionaler Verbundnetzwerke aus co-verschränkten Aktinfilamenten und Mikrotubuli vor. Verbundwerkstoffe unterliegen einer aktiven Umstrukturierung und ballistischen Bewegung, die von Myosin II- und Kinesinmotoren angetrieben wird, und werden durch die relativen Konzentrationen von Aktin, Mikrotubuli, Motorproteinen und passiven Vernetzern abgestimmt.

Rekonstitution und Charakterisierung von Aktin-Mikrotubuli-Verbundwerkstoffen mit abstimmbarer motorgetriebener Dynamik und Mechanik

Hier werden Verfahren zur Herstellung aktiver Nematika aus Mikrotubuli und Kinesinmotoren vorgestellt, einschließlich Proteinpräparation und -aufbau sowie der Verwendung von Vertiefungen für den aktiven nematischen Einschluss.

Formen, Einschließen und Beobachten von Mikrotubuli-basierten aktiven Nematiken

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Extraktion von endogenem Tubulin aus Säugetierzellen, denen spezifische Mikrotubuli-modifizierende Enzyme fehlen oder diese enthalten können, um Mikrotubuli zu erhalten, die für eine bestimmte Modifikation angereichert sind. Anschließend beschreiben wir, wie die extrahierten Mikrotubuli mit gereinigten Mikrotubuli-bindenden Proteinen dekoriert werden können, um Gitter für die Kryo-Elektronenmikroskopie herzustellen.

Extraktion modifizierter Mikrotubuli aus Säugetierzellen zur Untersuchung von Mikrotubuli-Protein-Komplexen mittels Kryo-Elektronenmikroskopie

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