Vorbereitung der segmentierte Mikrotubuli auf Anträge von der Demontage Microtubule Ends Driven Studieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Bewegungen von Proteinmolekülen und proteinbeschichteten Kügelchen mit den Enden depolymerisierender Mikrotubuli zu untersuchen. Dies wird durch die Montage einer wiederverwendbaren Durchflusskammer mit einem sauber dimensionierten Abdeckglas erreicht. Als nächstes werden Mikrotubuli-Samen vorbereitet, die auf dem Deckglas befestigt sind, und zur Keimbildung von Mikrotubuli verwendet, die dann vorübergehend mit photozerstörbaren Kappen stabilisiert werden.

Dann werden GFP-markierte Proteine oder proteinbeschichtete Kügelchen in die Durchflusskammer eingeführt und binden an segmentierte Mikrotubuli. Die Depolymerisation der Mikrowanne wird dann durch Entfernen der Kappen durch Photoablation ausgelöst. Die Bilder werden mit CH analysiert, um festzustellen, ob die markierten Proteine ein Tip-Tracking-Verhalten aufweisen, d. h. eine Bewegung mit den Enden depolymerisierender Mikrotubuli

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das Auslösen der Mikrotubuli-Isierung mit hoher zeitlicher und spezieller Auflösung ermöglicht. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung. Das Protokoll beginnt mit der Vorbereitung und Montage der Durchflusskammer mittels Ultraschallfräsen.

Modifizieren Sie normale Objektträger so, dass sie zwei Rillen haben. Die Rillen im Abstand von 14 Millimetern anrichten. Geben oder nehmen Sie einen Millimeter, was optimal für Kammern ist, die mit quadratischen 22-Millimeter-Abdeckgläsern montiert sind.

Legen Sie dann ein 100 Millimeter langes Polyethylenrohr in jede Nut der Rutsche, wobei Sie an den inneren Enden der Rillen etwa fünf Millimeter Überhänge lassen. Befestigen Sie die Rohre mit Cyanacrylatkleber in den Rillen und betten Sie die Rohre vollständig in die Rillen ein. Füllen Sie die Rillen vorsichtig mit Epoxidkleber, ohne zu verschütten.

Lassen Sie es einen Tag trocknen. Am nächsten Tag. Schneide den erstarrten Kleber mit einer scharfen Rasierklinge drei bis vier Millimeter vom distalen Ende jeder Befestigungsstelle entfernt ab.

Entfernen Sie die Teile proximal zur Mitte des Objektträgers. Die Rohre sollten in ihren Rillen bleiben und die Schnitte sollten ebene Flächen mit Rohröffnungen bilden. Füllen Sie anschließend eine Spritze mit Wasser und testen Sie, ob die Schläuche ordnungsgemäß funktionieren.

Wenn die Flüssigkeit frei fließt, geben Sie einen Tropfen Epoxidkleber mit einem Durchmesser von etwa fünf Millimetern an die äußeren Enden der Rillen und lassen Sie ihn etwa einen Tag trocknen. Die fertiggestellten Strömungskammern sind somit langlebig und können über viele Monate hinweg wiederholt verwendet werden. Dieses dreistündige Protokoll erstellt 12 Deckblätter.

Es werden ein Abzug, ein keramischer Deckglashalter, drei 15-Milliliter-Färbegläser und 1 250-Milliliter-Glas mit Deckel benötigt. In die Färbegläser müssen vier 22-Millimeter-Deckgläser mit der regulären Nummer 1 in einen Stapel passen. Beginnen Sie mit einem Stapel von 12 vorgereinigten und getrockneten Deckgläsern in der Keramikhalterung.

Füllen Sie das Glas mit plus einer Silene-Lösung und senken Sie die Objektträger langsam ab. Verschließen Sie das Glas und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Der wichtigste Schritt, um eine gleichmäßige Zivilisation des Deckglases zu gewährleisten, besteht darin, Wasserspuren während der Inkubation der Deckgläser in Selene-Lösung zu vermeiden.

Dieser Schritt ist für die feste Anhaftung von Mikrotubensamen unerlässlich. Später in einem Protokoll, Wenn die Deckgläser fertig sind, entfernen Sie den Keramikhalter aus dem Glas. Übertragen Sie dann die Deckgläser einzeln mit einer teflonbeschichteten Pinzette aus dem Keramikhalter in methanolbeladene Färbegläser.

Laden Sie nun die drei Gläser in das Wasserreservoir eines Schallbades, in dem sich ein Metall- oder Glassockel befindet. Der Wasserstand sollte bei zwei Dritteln der Höhe der Gläser liegen, beschallen Sie die Gläser bei 70 Watt für 20 Minuten. Wechseln Sie während der Beschallung die Methanollösung alle fünf Minuten.

Wenn die Beschallung abgeschlossen ist, spülen Sie, der Bezug lässt sich 10 Mal mit entionisiertem Wasser reinigen. Wenn die Siloisierung ordnungsgemäß funktioniert hat, erscheinen die Deckgläser trocken Wenn sie aus dem Wasser genommen werden, entfernen Sie unabhängig von ihrem Aussehen gründlich das restliche Wasser. Mittels Stickstoffgastransfer gleitet der getrocknete Deckel in einen stickstoffgetrockneten, verschließbaren Behälter.

Legen Sie Kim-Tücher zwischen die Eindeckfolien. Auf diese Weise können sie mehrere Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden. Dieses Protokoll erfordert ein bis zwei Stunden, eine Durchflusskammer und vorbereitete G-M-P-C-P-P-P-stabilisierte Mikrotubensamen.

Zuerst bauen Sie die Durchflusskammer zusammen. Befestigen Sie zwei Stücke doppelseitiges Klebeband entlang der zentralen fünf Millimeter breiten Fläche des vorbereiteten Objektträgers und drücken Sie den Deckglas fest auf das Klebeband. Füllen Sie die Kammer mit einer Ein-Milliliter-Spritze über ein Röhrchen mit 100 Mikrolitern B rrb 80-Lösung.

Drücken Sie als Nächstes einen kleinen Tropfen zweifarbigen Schnellguss-Dichtmasses auf eine kleine Petrischalen aus Kunststoff. Mit einem Zahnstocher schnell und gründlich vermischen. Er wird grün.

Tragen Sie den Dichtstoff sofort an allen Rändern des Deckglases auf. Prüfen Sie, ob der Dichtstoff zu tief unter den Deckglas eindringt. Wenn ein Schlauch verstopft ist, ziehen Sie den Netzstecker aus der Spritze und heben Sie den Schlauch an, um leichten Druck auszuüben und ein Auslaufen des Dichtmittels zu verhindern. Stellen Sie nach 10 Minuten sicher, dass der Lösungsfluss nicht eingeschränkt ist.

Dann stellen Sie die Kammer auf einen erwärmten Mikroskoptisch bei 32 Grad Celsius. Befestigen Sie einen der Schläuche an einer Pumpe, um die Lösung zu entfernen. Tauchen Sie das freie Ende des Einlaufrohrs in ein 0,5-Millimeter-Fläschchen mit warmem BRB 80-Puffer

Stellen Sie die Pumpe auf 100 Mikroliter pro Minute ein und drücken Sie damit bei Bedarf sanft Luftblasen heraus. Dies kann auch manuell erfolgen. Verwenden Sie nun die Pumpe, um 30 Mikroliter warme Antigen-Antikörper zu laden.

Schalten Sie die Pumpe aus und warten Sie fünf Minuten. Schalten Sie die Pumpe während aller Inkubationen aus. Waschen Sie anschließend die Kammern mit etwa 100 Mikrolitern warmem b rrb 80.

Dann 50 Mikroliter 1%onic F1 27 in BRB 80 perfundieren. Warten Sie 10 Minuten, bis die hydrophobe Oberfläche des siloisierten Deckglases blockiert ist. Waschen Sie nun die Kammern mit 100 Mikrolitern Motilitätspuffer.

Reduzieren Sie anschließend die Pumpendrehzahl auf 15 Mikroliter pro Minute und perfundierten Sie die Kammer mit 30 bis 40 Mikrolitern Mikrotubuli-Samen, die von einem bis 200 bis einem von 600 in Motilitätspuffer verdünnt sind. Inkubieren Sie die Samen 15 Minuten lang und waschen Sie dann die Kammer mit 400 Mikrolitern Motilitätspuffer bei 100 Mikrolitern pro Minute, um ungebundenes Material zu entfernen. Reduzieren Sie anschließend die Pumpendrehzahl auf 30 Mikroliter pro Minute und perfundierten Sie die Kammer mit unmarkierter Tubulinlösung.

Die wichtigsten Aspekte dieses Protokolls sind die Vermeidung von Luftblasen. Frisch zubereitete Tubulinlösungen zu verwenden und den genauen Zeitplan des Protokolls einzuhalten, insbesondere während des Mikrotubencapings. Überwachen Sie das Wachstum der Mikroröhren mit DIC-Optiken während der fünf- bis siebenminütigen Inkubation.

Die Mikrotubuli wachsen in der Regel um etwa 10 Mikrometer, tauschen die Lösung schnell mit dem Rumine Tubulin Mix aus der Vorkriegszeit aus und ermöglichen acht bis 10 Minuten mehr Inkubationszeit. Waschen Sie die Kammer gut mit 100 Mikrolitern Motilitätspuffer bei 20 Mikrolitern pro Minute, um Turbulenzen und Nukleotide sowie lösliche Mikrotubuli-Fragmente zu entfernen. Als nächstes perfundieren Sie die Kammer mit einer erwärmten Lösung aus GFP-markiertem Protein oder proteinbeschichteten Kügelchen und fahren Sie mit der Abbildung der mit GFP markierten Hefe-Kinetico-Komponente DAM fort, die aus Bakterienzellen gereinigt und als Positivkontrolle für Tip-Tracking-Assays verwendet wurde.

Solche Proteine folgen dem depolymerisierenden Ende eines Mikrotubuli und bewegen sich stetig in Richtung des am Deckglas befestigten Samens. Diese Proteine erscheinen als schräge Linie auf einem entsprechenden Diagramm, das dann analysiert werden kann, um die Anzahl der Proteinmoleküle im Tip-Tracking-Komplex zu bestimmen. Diese Analyse ist im Textprotokoll ausführlich beschrieben.

Im Gegensatz dazu zeigen Proteine, die keine Tip-Track betreiben können, keine Anreicherung des Fluoreszenzsignals am zerlegenden Mikroende. Dies ist beim humanen NDC 80 GFP-Protein zu beobachten. Die Bindung zwischen proteinbeschichteten Kügelchen und Mikrotubuli ist in der Regel recht stark, so dass die Kügelchen, wenn sie in die Mikroskopiekammer gegeben wurden, leicht an die segmentierten Deckglas-angehängten Mikrotubuli gebunden wurden.

Wenn die Perlenverfolgung prozessiv ist, können viele Beobachtungen gemacht werden. Kügelchen, die an einem Mikrotubuli befestigt waren, zeigten eine bogenartige Bewegung, da sich die Mikrotubuli leicht um die Stelle ihres Wachstums drehen. Wenn die Stabilisierungskappe beleuchtet ist und nur ein rotes Segment distal vom Samen und der Perle entfernt zu sehen ist, wird die Perle an einem Mikrotubuli befestigt.

Die Kappe ist oft zu sehen, wie sie den Perlen in gleicher Weise folgt, bis die Kappe gebleicht ist. Die Bewegung der Perle kurz nach dem Bleichen scheint mit der Ausrichtung der Mikrotubuli übereinzustimmen. Wenn sich die Mikroröhre verkürzt und die Perle sich in Richtung des Samens bewegt, nimmt die Amplitude der bogenartigen Schwingungen ab. Wenn es den Kügelchen nicht gelingt, dauerhafte Bindungen an die stabilen Mikrotubuli zu bilden.

Lasertrapping kann verwendet werden: Kügelchen mit unterschiedlichen Proteinkonstrukten von plus endgerichtetem Kinesin SE E erforderte diese Technik, um die Kügelchen auf die segmentierten Mikroröhrenwände in Gegenwart eines TP zu schießen. Diese Kügelchen bewegten sich schnell in Richtung der verkappten Mikroröhren-Plus-Enden auf einem Diagramm. Diese Bewegung führte zu einer schrägen Linie, die nach der Zerstörung der Kappe in Richtung der Kappe gerichtet war. Die Kügelchen, die mit abgeschnittenem Spionageprotein beschichtet sind, lösen sich vom Mikrotubuli, wie der grüne Pfeil zeigt.

Im Gegensatz dazu könnten Kügelchen mit B-Protein in voller Länge die Bewegung in umgekehrter Richtung aufrechterhalten. Dies wird als Zickzackmuster auf dem chm-Diagramm gesehen, das auf eine Bewegung in entgegengesetzte Richtungen zum Plus- oder Minusende der Mikrotubuli zurückzuführen ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Strömungskammern vorbereitet und segmentierte Mikrotubuli züchtet, um Bewegungen zu untersuchen, die durch die Demontage von Mikrotuben ausgelöst werden.