Rekonstitution und Charakterisierung von Aktin-Mikrotubuli-Verbundwerkstoffen mit abstimmbarer motorgetriebener Dynamik und Mechanik

Unsere Arbeit bringt die Bemühungen um die Rekonstitution von Zytoskeletts einen wichtigen Schritt näher an die Nachahmung zellulärer Bedingungen, indem sie Verbundwerkstoffe aus Aktin und Mikrotubuli entwickeln, die von Kinesin- und Myosinmotoren angetrieben werden, um aktiv abzustimmen, zu restrukturieren und sich zu bewegen. Die Dynamik und Struktur unserer Verbundwerkstoffe kann präzise programmiert werden, indem die verschiedenen Komponenten unabhängig voneinander hinzugefügt, entfernt und abgestimmt werden, um eine reiche Phasenbasis von Kontraktion, Infektion, Demenierung, Vergröberung und Ruptur zu zeigen. Unser Ansatz ist breit anwendbar, um aktive Materieplattformen zu entwerfen, zu erstellen und zu charakterisieren, die mehrere krafterzeugende Komponenten enthalten, die auf verschiedene Substrate in einem einzigen System wirken.

Daisy Achiriloaie und Maya Hendija demonstrieren das Verfahren. Studentische Forscher aus unserem Labor. Fügen Sie zunächst die Reagenzien zu einem sterilen schwarzen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Mikropipette und sterilen Pipettenspitzen hinzu, um Kinesin-Motorcluster zu bilden, die Kräfte zwischen Mikrotubulipaaren binden und ausüben.

Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren. Dann inkubieren Sie die Lösung für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, schützen Sie sie vor Licht. Um ein miteinander verschränktes Verbundnetzwerk aus Actonfilamenten und Mikrotubuli herzustellen, stellen Sie den Wärmeblock auf 37 Grad Celsius ein.

Die Reagenzien in ein steriles 0,6-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 25 Mikroliter beträgt. Pipetten Sie die Lösung vorsichtig auf und ab, um sie zu mischen, und legen Sie sie eine Stunde lang auf den 37 Grad Celsius heißen Wärmeblock, der vor Licht geschützt ist.

Danach entfernen Sie das Röhrchen aus dem Kühlblock und mischen Sie mit einer Mikropipette vorsichtig 0,84 Mikroliter 100 Mikromolar Phalloidin ein. Inkubieren Sie fünf bis 10 Minuten bei lichtgeschützter Raumtemperatur. Um aktive Komposite für die conffokale Bildgebung vorzubereiten, fügen Sie die Reagenzien der Lösung hinzu und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren auf und ab.

Teilen Sie die Lösung in drei 10-Mikroliter-Aliquots und kennzeichnen Sie sie als K, K plus M und Negativkontrolle. Fügen Sie 2,54 Mikroliter Myosin zum K plus M-Aliquot und 2,54 Mikroliter PEM zu K und Negativkontrollaliquots hinzu. Dann fügen Sie 2,5 Mikroliter Kinesin-Cluster zu K und K plus M-Aliquots hinzu und pipetten Sie auf und ab, um zu mischen.

Als nächstes fügen Sie der Negativkontrolle mit der gleichen Technik 2,5 Mikroliter PEM hinzu. Verwenden Sie eine Mikropipette, um jede Lösung langsam durch Kapillarwirkung in den entsprechenden Kanal der Probenkammern zu fließen. Drücken Sie die Pipette sehr langsam und vorsichtig nach unten, um keine Luftblasen in den Kanal einzuführen.

Versiegeln Sie die beiden offenen Enden jedes Kanals mit schnell trocknendem Epoxid- oder UV-härtendem Kleber. Wenn der Klebstoff vollständig trocken ist, platzieren Sie den Kanal auf dem Mikroskop, um den Verbundwerkstoff so nah wie möglich am ursprünglichen inaktiven Zustand abzubilden. Stellen Sie zuerst den K-Kanal und die K- und M-Kanäle vor, gefolgt vom Steuerkanal.

Beachten Sie die Zeit, die zwischen dem Hinzufügen der Kinesin-Cluster zu K und K plus M Aliquots und dem Beginn der Datenerfassung verstrichen ist. Um Aktin zu Aktin oder AA-Vernetzern herzustellen, fügen Sie Biotin-Actin, NeutrAvidin, Biotin und PEM in ein Mikrozentrifugenröhrchen hinzu und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren auf und ab. In ähnlicher Weise fügen Sie für Mikrotubuli zu Mikrotubuli oder MM-Vernetzern Biotin-Tubulin, NeutrAvidin, Biotin und PEM zu einem Mikrozentrifugenröhrchen hinzu und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren auf und ab.

Wickeln Sie das Rohr in eine thermoplastische Deckenfolie, um eine wasserdichte Abdichtung zu erzeugen, und legen Sie sie in ein Flotationsfloß in einem temperaturgesteuerten Ultraschallbad, das 90 Minuten lang auf vier Grad Celsius eingestellt ist. Um A-A-Vernetzerkomplexe in Proben für die Bildgebung einzubauen, fügen Sie die Reagenzien in ein Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 25 Mikroliter beträgt.

In ähnlicher Weise fügen Sie bei M-M-Vernetzerkomplexen die auf dem Bildschirm angezeigten Reagenzien zu einem Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Mischen Sie die Lösung, indem Sie auf und ab pipettieren und legen Sie sie eine Stunde lang auf den 37 Grad Celsius heißen Wärmeblock, der vor Licht geschützt ist. Danach entfernen Sie das Röhrchen aus dem Kühlblock und mischen Sie mit einer Mikropipette 0,84 Mikroliter 100 Mikromolar Phalloidin ein.

Inkubieren Sie fünf bis 10 Minuten bei lichtgeschützter Raumtemperatur und wiederholen Sie das zuvor gezeigte Verfahren, um aktive Komposite für die konfokale Bildgebung vorzubereiten. Aktinmonofasern und Tubulin-Dimere werden copolymerisiert, um co-verschränkte Netzwerke von Aktinfilamenten und Mikrotubuli zu bilden. Myosin zwei Mini-Filamente und Kinesin-Cluster drücken und ziehen an den Filamenten, um die Verbundwerkstoffe aus dem stationären Zustand zu treiben.

Passive Vernetzung wird mit NeutrAvidin erreicht, um biotinylierte Aktinfilamente oder Mikrotubuli zu verknüpfen. Myosin zwei Minifilamente, Kinesin-Cluster oder beide Motoren werden in Verbundwerkstoffe ohne passive Vernetzungen, Aktin-Aktin-Vernetzungen und Mikrotubuli-Mikrotubuli-Vernetzungen eingebaut. Zwei konfokale Farbaufnahmen von Myosin-getriebenen Zytoskelett-Kompositen mit unterschiedlichen Myosinkonzentrationen und molaren Aktinfraktionen sind hier dargestellt.

Die Partikelbild-Velocimetrie zeigt, dass die Aktin-Myosin-Aktivität eine koordinierte kontraktile Dynamik von Aktin und Mikrotubuli in co-verschränkten Kompositen auslöst. Hier entsprechen unterschiedliche Pfeilfarben unterschiedlichen Geschwindigkeiten, wie in der Farbskala rechts neben den Vektorfeldern angegeben. Zeitaufgelöste differentielle dynamische Mikroskopie wird an Mikrotubuli- und Aktinkanälen von Zeitreihen durchgeführt, um die Eigenschaften der Abklingzeiten gegenüber der Wellenzahl sowohl für Aktin als auch für Mikrotubuli zu bestimmen.

Die Kontraktionsgeschwindigkeiten werden über Anpassungs- und Abklingzeitkurven bestimmt, die über alle Verzögerungszeiten für die gesamte Dauer jeder 45-minütigen Zeitreihe gemittelt werden. Die zeitaufgelöste differentielle dynamische Mikroskopie quantifiziert, wie sich die Dynamik im Laufe der Zeit ändert, indem sie die Zerfallszeiten für aufeinanderfolgende sechsminütige Intervalle während der 45-minütigen Aktivierungszeit für Aktin und Mikrotubuli auswertet. Zeitaufgelöste Kontraktionsgeschwindigkeiten für Aktinfilamente und Mikrotubuli werden aus Anpassungen an entsprechende Zerfallszeitkurven bestimmt.

Die räumliche Bild-Autokorrelationsanalyse quantifiziert die motorgetriebene Umstrukturierung aktiver Zytoskelettkomponenten durch Vergleich der Autokorrelationskurven für die verschiedenen Netzwerke zu Beginn des Experiments im Vergleich zum Ende. Zeitaufgelöste Korrelationslängen, die über exponentielle Anpassungen von Autokorrelationskurven bestimmt wurden, zeigen Verbundwerkstoffe, die nicht umstrukturieren, im Vergleich zu solchen, die im Wesentlichen restrukturieren. Zwei konfokale Farbbilder von Kinesin-getriebenen Aktin-Mikrotubuli-Verbundwerkstoffen zeigen eine formulierungsabhängige Umstrukturierung im Laufe der Zeit ohne Vernetzer, die sich in lose verbundene Mikrotubuli-reiche Cluster restrukturieren.

Die Aktin-Aktin-Vernetzung unterstützt die Aktin-Mikrotubuli-Kolokalisierung, während die Mikrotubuli-Mikrotubuli-Vernetzung die D-Mischung verbessert. Differentielle dynamische Mikroskopie und räumliche Bild-Autokorrelationsanalysen zeigen den Einfluss von vernetzenden und konkurrierenden Mycin- und Kinesin-Motoren auf die zeitvariable Dynamik und Struktur der Verbundwerkstoffe. Um zelluläre Bedingungen genauer nachzuahmen, können Forscher Zwischenfilamente, andere Motoren und Bindungsproteine einbauen, die Filamentlängen und Steifigkeiten steuern.

Optische Pinzettenmessmessungen können auch durchgeführt werden, um die Verbundmechanik zu charakterisieren. Mit unserem Ansatz können Forscher die Dynamik und Struktur von Zytoskelett-inspirierter zusammengesetzter aktiver Materie über einen beispiellosen Phasenraum präzise abstimmen, um verschiedene zelluläre Prozesse zu emulieren und rekonfigurierbare programmierbare Materialien zu entwickeln.