Name: Messung von Veränderungen in Taktile Empfindlichkeit in der Hinterpfote von Mäusen unter Verwendung eines elektronischen von Frey Apparat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Erfahren Sie die elektronische von-Frey-Methode zur präzisen Messung mechanischer Schwellenwerte in der Mäusehinterpfote. Diese Technik ermöglicht reproduzierbare Schmerzbeurteilung in Entzündungsmodellen.

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NIH R15 NS067536-01A1 (nach DC) und der Macalester College Wallace Research Fund (nach DC) unterstützten diese Studien. Die Macalester College Library unterstützte die Open-Access-Veröffentlichung dieses Artikels. Darüber hinaus danken wir den aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Chatterjea-Labors für ihre Unterstützung.

Das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Macalester College hat alle Protokolle genehmigt. Für diese Experimente wurden 8-12 Wochen alte männliche ND4-Schweizer Mäuse verwendet.
1. Zubereitung und Injektion von Bothrops jararaca Gift
<ol>
	<li>ACHTUNG: Das Gift von B. jararaca ist giftig. Tragen Sie Handschuhe, Maske und Augenschutz, wenn Sie mit dem Pulver umgehen und Lösungen zubereiten.</li>
	<li>Verabreichen Sie 45 μg/kg B. jararaca-Gift (Schema bestimmt durch frühere Dosis-Wirkungs-Experimente) oder 0,9 % Kochsalzlösung (10 μl) durch intraplantare Injektion in beide Hinterpfoten mit 3/10 ml Insulinspritzen und 29 G x 1/2 Nadeln. Hinweis: Je nach Versuchsdesign können Behandlungs- und Kontrolllösungen separat in jede Hinterpfote injiziert werden, um interne Kontrollen bei jedem Probanden zu ermöglichen.</li>
</ol>
2. Aufbau und Betrieb der elektronischen von Frey-Apparatur
<ol>
	<li>Setzen Sie die elektronische von-Frey-Einheit auf das Sondenstativ. Stellen Sie sicher, dass die Sonde und das Kabel ordnungsgemäß an die Anzeigeeinheit angeschlossen sind, und schalten Sie das Gerät ein. Stellen Sie die Anzeige im Setup-Modus auf Null (0,00 g) und platzieren Sie das angegebene Prüfgewicht (5,00 g) vorsichtig auf dem Konus der von-Frey-Sonde.</li>
	<li>Notieren Sie den Messwert in einem Labornotizbuch und wiederholen Sie diesen Vorgang nach Beendigung der Testsitzung. Wenn vor und nach der Prüfung eine Abweichung von mehr als 0,20 g zwischen den Messwerten des Prüfgewichts besteht oder wenn die Anzeige nach dem Anlegen des Prüfgewichts schwankt, kann eine Neukalibrierung des Geräts (durch den Hersteller) erforderlich sein.</li>
	<li>Um die Entzugsschwelle der Hinterpfote der Maus zu beurteilen, verwenden Sie die entsprechende Polypropylenspitze aus den mit der Sonde gelieferten Spitzen. Die Wahl der Spitze hängt vom zu untersuchenden Gewebe ab. Starre Spitzen eignen sich gut für das weniger empfindliche, härtere Hinterpfotengewebe, während halbflexible Spitzen eine bessere Wahl für einen empfindlicheren Bereich wie den anogenitalen Kamm sein können (Chatterjea, unveröffentlicht). Montieren Sie die starre Spitze vorsichtig auf dem Konus der Sonde.</li>
	<li>Um den maximal angelegten Druck aufzuzeichnen, schalten Sie den Betriebsmodus von Setup auf Betrieb um, so dass der maximal angelegte Druck auf dem Display aufgezeichnet wird. In diesem Modus wird die Anzeige des maximal angelegten Drucks auf dem Bildschirm gespeichert, wenn die Sonde zurückgezogen wird.</li>
</ol>
3. Allgemeine Überlegungen zur Bewertung der Rückzugsschwelle der Hinterpfote
<ol>
	<li>Im Idealfall werden zwei Untersucher benötigt, um die Rückzugsschwelle der Hinterpfote (mechanische Empfindlichkeit) mit einem EvF-Gerät zu messen - einer für die Bedienung des Geräts und die Durchführung der Messungen und ein weiterer für die Transkription der aufgezeichneten Messungen und den Umgang mit Mäusen.</li>
	<li>Um Verzerrungen zu reduzieren, sollte der Prüfarzt, der das Gerät bedient, für die Behandlungen und die aufgezeichneten Entzugsschwellenwerte verblindet werden. Um die Konsistenz zwischen den Messungen zu gewährleisten, sollte dieselbe Person außerdem alle Ausgangs- und experimentellen Entzugsschwellen bewerten.</li>
	<li>Führen Sie alle Messungen in einem ruhigen, klimatisierten Raum und zur gleichen Tageszeitdurch 14.</li>
	<li>Der Experimentator, der die Messungen aufzeichnet, sollte jede Maus in einzelne Kammern eines Gehäuses aus mehrteiligem Polymethylmethacrylat (PMMA) legen, das auf einem Netzständer steht. Decken Sie die Kammern mit perforierten PMMA-Deckeln ab und legen Sie einen schweren Gegenstand darauf, um ein Entkommen von Mäusen zu verhindern. Legen Sie saugfähiges Material unter den Ständer, um ausgeschiedene Abfälle aufzunehmen/zu sammeln. Lassen Sie die Mäuse 15 Minuten lang in den Kammern akklimatisieren, bevor Sie zu Studienbeginn oder zur experimentellen Entzugsschwelle abgesetzt werden 6,7,10. </li>
	<li>Die Hinterpfoten der Mäuse müssen durch die Öffnungen des Gitterbodens leicht zugänglich sein, daher platzieren Sie den Gitterbodenständer in bequemer Höhe auf einem Wagen mit Bremsen oder auf einer stabilen Tischplatte, die von allen Seiten zugänglich ist.</li>
	<li>Während der Messungen müssen Mäuse möglicherweise mit einem Futterpellet15 abgelenkt werden, das direkt außerhalb der Messkammer platziert ist, oder mit einem sehr leichten Geräusch, das durch Klopfen oder Führen eines Stifts entlang des Drahtgeflechts des Bodens der Kammer vor, aber nicht während der Messung erzeugt wird. Dies veranlasst die Maus, still zu halten, so dass der Experimentator leichter mit den Messungen beginnen kann.</li>
</ol>
4. Bewertung der Ausgangsschwelle für den Rückzug der Hinterpfoten
<ol>
	<li>Die erste Reihe von Ausgangsmessungen sollte 48 Stunden vor der Verabreichung der Behandlung durchgeführt werden. Stellen Sie die Sonde auf Null, wenn Sie die starre Spitze montieren. Heben Sie die Sonde mit beiden Händen langsam an, um die Mitte (Fußballenbereich) der linken oder rechten Hinterpfote zu stimulieren (wenn beide Pfoten die gleiche Behandlung erhalten haben).</li>
	<li>Erhöhen Sie den Druck allmählich, bis definierte nozizeptive Reaktionsverhaltensweisen wie das Zurückziehen der Hinterpfoten, das Lecken der Hinterpfoten oder das Springen mit vier Pfoten6,10 beobachtet werden. Weisen Sie den anderen Untersucher an, den Druck zu transkribieren, der das beobachtete Verhalten ausgelöst hat.</li>
	<li>Messen Sie die Entnahmeschwelle der Maus, die sich in der angrenzenden Kammer befindet. Fahren Sie fort, bis Sie die Entnahmeschwellenwerte jeder Maus einmal bewertet haben. Wiederholen Sie dies noch viermal, so dass jede Maus 5x gemessen wird, wie zuvor beschrieben10.</li>
	<li>Berechnen Sie für jede Maus den Medianwert der 5 Messungen, und berechnen Sie dann, wie stark jeder Wert vom Median abweicht. Wählen Sie 3 Werte aus, die am wenigsten abweichen, und mitteln Sie sie, um einen Basisauszahlungsschwellenwert zu erhalten, wie zuvor beschrieben10. In dieser Demonstration wurde die Messung anhand von 3 von 5 Werten standardisiert. Während die spezifische Anzahl der Messungen je nach Versuchsdesign variieren kann, ist es wichtig sicherzustellen, dass alle Mäuse gleich oft gestochen werden, um die Ausgangswerte zu bewerten.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Basismessungen 24 Stunden später. Nehmen Sie 5 Messungen pro Maus vor und mitteln Sie die 3, die dem Median am nächsten liegen, um einen Ausgangsentnahmeschwellenwert zu erhalten.</li>
	<li>Um die durchschnittliche Entzugsschwelle einer Maus zu berechnen, wird der Durchschnitt der Entzugsschwellen zu Studienbeginn ermittelt, die 48 und 24 Stunden vor der Behandlung gemessen wurden. Wenn der durchschnittliche Ausgangsschwellenwert für den Entzug unter 3,50 g liegt oder wenn sich die beiden Ausgangsschwellenwerte um 2,00 g oder mehr unterscheiden, schließen Sie die Maus vom Experiment aus. Diese Kriterien stellen sicher, dass alle Mäuse im Experiment konsistente Ausgangsreaktionen und ausreichend hohe Ausgangsentzugsschwellen aufweisen, die es ermöglichen, nach der Behandlung niedrigere Schwellenwerte zu beobachten.</li>
	<li>Hinweis: Die Ausschlussschwelle hängt vom zu untersuchenden Gewebe, dem Stamm der untersuchten Tiere und der Art der verwendeten Spitze ab. Zum Beispiel haben wir festgestellt, dass 3,5 g ein nützlicher Richtwert für ND4-Hinterpfotengewebe sind, aber empfindlichere Bereiche wie der anogenitale Kamm benötigen eine niedrigere Ausschlussschwelle (Chatterjea, unveröffentlicht).</li>
	<li>Ordnen Sie die Mäuse so in Behandlungsgruppen ein, dass die durchschnittliche Entzugswertlinie der Versuchsgruppen vor der Verabreichung der Behandlungen so ähnlich wie möglich ist.</li>
</ol>
Hinweis: Basismessungen können vor 48 Stunden vor einem Experiment durchgeführt werden. Es sollten jedoch mindestens 2 Sätze von Basismessungen in regelmäßigen Abständen vor Beginn der Behandlungen durchgeführt werden.
5. Experimentelle Bewertung der Rückzugsschwelle für die Hinterpfote
<ol>
	<li>Die Rückzugsschwelle der Hinterpfote (mechanische Empfindlichkeit) nach der Behandlung ist zu geeigneten Zeitpunkten zu beurteilen, die durch das Versuchsdesign festgelegt wurden. Bringen Sie die Mäuse sofort nach Abschluss der Messungen in ihre Käfige mit Zugang zu Futter und Wasser zurück.</li>
	<li>Befolgen Sie die oben beschriebenen Schritte; nehmen Sie 3 statt 5 Messungen vor, um die Möglichkeit einer Überstimulation des (behandelten) Hinterpfotengewebes zu verringern, insbesondere wenn die Empfindlichkeit zu mehreren Zeitpunkten beurteilt werden soll. Wenn sich zwei der drei Messungen um mehr als 2,00 g unterscheiden, ist eine vierte Messung durchzuführen.</li>
	<li>Berechnen Sie den Durchschnitt von 3 Messungen, um die experimentelle Entzugsschwelle für jede Maus zu erhalten. Für alle Mäuse, für die 4 Messungen durchgeführt wurden, berechnen Sie den Durchschnitt von drei, die am wenigsten vom Median abweichen, um die experimentelle Entzugsschwelle zu erhalten.</li>
	<li>Um den Delta-Entnahmeschwellenwert für jede Maus zu einem bestimmten Zeitpunkt zu erhalten, subtrahieren Sie die Basislinie vom experimentellen Entnahmeschwellenwert. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Mäuse und alle experimentellen Zeitpunkte9.</li>
	<li>Führen Sie eine angemessene statistische Analyse der gesammelten Daten durch. Hier haben wir JMP 9.0 (SAS, Cary, NC) verwendet, um eine unidirektionale ANOVA und eine Tukey HSD-Post-hoc-Analyse durchzuführen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offenzulegen.

Die Messung von Veränderungen der Entzugsreaktionen ist ein wichtiges Instrument zur Beurteilung von Veränderungen der taktilen Empfindlichkeit in Nagetiermodellen für Schmerzen und Entzündungen. Hier zeigen wir die Nützlichkeit einer elektronischen von-Frey-Apparatur zur Durchführung dieser Bewertung. Diese Technik hat mehrere Vorteile: i) wir können die Entzugsreaktionen auf ausgeübten Druck für mehrere Mäuse zu mehreren Zeitpunkten, die ziemlich nahe beieinander liegen, schnell beurteilen, ii) wir können eine einzige Spitze verwenden, um kontinuierlichen und spezifischen Druck auf einen kleinen Bereich des Gewebes auszuüben, iii) wir können den genauen Druck, der ausgeübt wird, um eine Entzugsreaktion zu erhalten, genau messen, und iv) wir können problemlos robuste Ausgangswerte, Ausschlusskriterien und interne Kontrollen implementieren, um sicherzustellen, dass Verhaltensbewertungen so präzise und objektiv wie möglich sind.
Die entscheidenden Schritte, um die besten Ergebnisse für einen EvF-Assay zu erzielen, sind die vorherige Kalibrierung des Geräts und konsistente Messpraktiken. Wie im Protokollabschnitt beschrieben, muss das Gerät vor und während des Gebrauchs sorgfältig behandelt und eine ordnungsgemäße Kalibrierung sichergestellt werden. Bevor Messungen durchgeführt werden, müssen die Messwerte des Prüfgewichts bestätigt werden, um eine optimale Funktion der Maschine zu gewährleisten. Wenn die Messwerte stark schwanken oder wenn die Messwerte des Prüfgewichts nicht genau sind, sollte unverzüglich mit dem Hersteller Kontakt aufgenommen werden, um das Gerät zu kalibrieren. Vor diesem Hintergrund ist es ratsam, wenn möglich, eine elektronische von-Frey-Ersatzapparatur zu haben, um zeitkritische Experimente nicht durch einen unerwarteten Kalibrierbedarf des Instruments zu gefährden. Darüber hinaus sollte ein einzelner, gut ausgebildeter Prüfarzt alle Ausgangs- und experimentellen Messungen für eine bestimmte Studie oder Versuchsreihe durchführen, während er für Behandlungsgruppen blind bleibt. Mäuse sollten in einem ruhigen Raum untersucht, bei konstanter Temperatur gehalten, mindestens 15 Minuten lang an die EvF-Kammern gewöhnt, aber nicht länger als nötig in der Kammer festgehalten werden (insbesondere wenn mehrere Messungen innerhalb eines einzigen Tages durchgeführt werden), um stress- und beschwerdebedingte Verhaltensschwankungen zu minimieren.
EvF-Messungen bieten erhebliche Verbesserungen im Vergleich zu den bestehenden CvF-Techniken. Die Forscher können kontinuierlichen Druck ausüben und müssen nicht zwischen Spitzen mit verschiedenen Gewichten wechseln, wie dies bei CvF-Filamentexperimenten der Fall ist6. Dies führt zu weniger Stichen in das Gewebe, was besonders bei entzündetem oder verletztem Gewebe relevant ist. Der genaue Druck, bei dem die Entnahme erfolgt, kann im Vergleich zu 50 %-Entnahmemessungen gemessen werden, die auch durch die verfügbaren Filamentgewichte begrenzt sind, die bei CvF-Messungen verwendet werden13. Da rationale und einheitliche Ausschlusskriterien implementiert werden können (wie oben diskutiert), können Mäuse so in Versuchsgruppen eingeteilt werden, dass alle Gruppen zu Beginn des Experiments ähnliche durchschnittliche Ausgangswerte haben. EvF-Messungen bewerten die Veränderungen in der Verhaltensreaktion auf einen bestimmten Reiz und nicht die absoluten Reaktionen selbst. Daher wird die Veränderung der nozizeptiven Reaktion jeder Maus als Differenz zwischen ihren individuellen experimentellen und Ausgangsentnahmen gemessen, so dass für jede durchgeführte Messung interne Kontrollen möglich sind.
Die vielleicht bedeutendste Einschränkung von EvF besteht darin, dass derselbe Forscher, ähnlich wie bei seinem manuellen Gegenstück, alle Messungen für eine bestimmte Reihe von Basis- und experimentellen Messungen durchführen muss. Dies macht die Skalierung der Technik aus zeitlicher, personeller und materieller Sicht zu einer Herausforderung. Wir stellen fest, dass ~20 Mäuse gleichzeitig (abhängig von der Konfiguration der Assay-Kammern) in 30-45 Minuten oder weniger zu mehreren Zeitpunkten gemessen werden können, vorausgesetzt, es liegen mindestens 45 Minuten zwischen den Messungen. Eine damit zusammenhängende Überlegung ist in diesem Zusammenhang die Lernkurve der einzelnen Experimentatoren. Die interne Konsistenz muss hergestellt werden, bevor ein einzelner Forscher ein groß angelegtes Experiment durchführen kann, und dies erfordert viele Stunden engagierter Praxis mit wiederholten Basisreaktionsmessungen, bis die gewünschte Konsistenz erreicht ist. Darüber hinaus impliziert die Verwendung von Baseline-Cutoffs, dass nicht alle Mäuse, die für ein Experiment als Baseline eingestuft wurden, eingeschlossen werden können; Wir stellen fest, dass 25-30% der Mäuse, die pro Experiment zu Baselining eingenommen wurden, typischerweise ausgeschlossen sind.
In Bezug auf Modifikationen und zukünftige Anwendungen fügen EvF-Verhaltensmessungen einer Vielzahl von Entzündungsmodellen eine leistungsstarke Dimension hinzu, um begleitende akute und/oder chronische Schmerzen zu analysieren, die entzündlichen Pathologien zugrunde liegen können. Bei der Vergiftung fanden wir heraus, dass ausgeprägte, schnell einsetzende Veränderungen der taktilen Empfindlichkeit die erwarteten Ergebnisse der Gewebeschwellung, der Leukozytenrekrutierung und der Mastzelldegranulation in den Hinterpfoten von männlichen ND4-Mäusen begleiteten. Diese Ergebnisse bestätigen frühere Beobachtungen über den Beitrag von Mastzellmediatoren zur thermischen Empfindlichkeit bei Ratten20 und zur mechanischen Empfindlichkeit, die durch das Gift von B. jararaca bei ND4-Schweizer Mäusen induziert wurde, gemessen mit CvF21. Das EvF-Protokoll kann leicht für die Anwendung auf andere Gewebe als die Hinterpfote modifiziert werden , z. B . Abdomen7 und Anogenitalkamm8 , wo CvF derzeit verwendet wird. Nagetiermodelle für Allergien, Wundheilung, Neuropathien und andere Pathologien können leicht angepasst werden, um Messungen der mechanischen Empfindlichkeit in Geweben einschließlich und außerhalb der Hinterpfote einzubeziehen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass EvF eine nützliche und effektive Technik ist, die einen klassischen Ansatz zur Messung der Nozizeption bei Nagetieren aktualisiert und ein wichtiges neues Werkzeug zur Untersuchung der komplexen zugrunde liegenden Mechanismen von Schmerzen in einer Vielzahl von Krankheitsmodellen darstellt.

Chronische nichtübertragbare Krankheiten sind für einen unverhältnismäßig hohen Anteil der menschlichen Belastung durch Mortalität und Morbidität verantwortlich1. Chronische Schmerzen werden zunehmend als wichtiger Bestandteil der globalen Krankheitslast anerkannt2. Dies hat den Innovationen in der Prävention, Behandlung und Behandlung von Schmerzen einen großen Impuls gegeben. Gleichzeitig gibt es zahlreiche Belege dafür, dass die zugrundeliegende Biologie des Schmerzes komplex ist3. Die Mechanismen, die sowohl schützenden als auch maladaptiven und chronischen Schmerzen zugrunde liegen, deuten auf ein komplexes Zusammenspiel zwischen Immun- und Nervensystem hin3,4. Die Aufklärung dieser Mechanismen erfordert rigorose quantitative, reproduzierbare experimentelle Ansätze von der molekularen Dissektion bis zur Verhaltensanalyse.
Nagetiermodelle waren von unschätzbarem Wert bei der Charakterisierung molekularer Akteure von entzündlichen und neuropathischen Schmerzen5. Die Verkürzung der Zeit und Intensität zuvor spezifizierter Reaktionen auf schädliche Reize wird verwendet, um Schmerzzustände bei diesen Tieren zu messen, da Nagetiere sonst nicht in der Lage sind, über ein Schmerzempfinden zu berichten6. Veränderte Reaktionen auf Temperatur und Druck werden häufig als Metriken für die Gewebeempfindlichkeit in Nagetiermodellen für entzündliche Nozizeption verwendet, die durch Infektionen7,8, chemische Exposition6, 9,10, chirurgische Schnitte11 sowie neuropathische Schmerzen verursacht werden können, die durch Nervenligatur12 verursacht werden.
Die mechanische Empfindlichkeit oder Reaktion auf Druckreize wird oft mit klassischen von-Frey-Filamenten (CvF) gemessen - einer Reihe (z.B. 0,4-15 g13) von gewichteten Spitzen, die manuell in seriellen Schritten auf das Testgewebe angewendet werden, bis das Schmerzverhalten bei Kontrollen und Versuchspersonen induziert wird. Es gibt verschiedene Methoden, um diese Spitzen oder Haare zur Beurteilung der mechanischen Empfindlichkeit zu verwenden6,13; Die am häufigsten verwendete Methode ist die folgende. Ein Tipp mit einem gewissen Druck (innerhalb der Reihe; z. B. 2 g13) wird als Ausgangspunkt ausgewählt, und die 50 %-Entnahmeschwelle einer Ratte oder Maus (die Reizintensität, die erforderlich ist, um eine Reaktion in 50 % der Fälle hervorzurufen, in denen die Spitze auf das Gewebe angewendet wird) wird bestimmt, indem das Spitzengewicht auf der Grundlage der Anzeige zuvor spezifizierter Reaktionsverhaltensweisen13 auf und ab bewegt wird. Die absoluten 50%-Entzugsschwellen für Behandlungsgruppen werden dann zwischen dem Ausgangs- und dem Nachbehandlungszeitpunkt verglichen. Diese manuelle Technik ist recht zeitaufwändig. Zusätzlich zu der verlängerten Zeit, die jeder Proband in einer von-Frey-Kammer verbrachte, erhöht sich auch die Häufigkeit, mit der Testspitzen verschiedener Gewichte auf entzündetes Gewebe aufgebracht werden, was bei den Nagetieren in der Studie zu größerem Unbehagen führt. Darüber hinaus werden Rücknahmeschwellen von 50 % berechnet und zwischen Nagetiergruppen verglichen. Die individuellen Reaktionen der Versuchspersonen sind in der Regel nicht auf ihre individuellen unbehandelten Ausgangsreaktionen normalisiert, mit einer Ausnahme, soweit wir wissen,6. Infolgedessen werden Nagetierprobanden in der Regel nicht als Behandlungsgruppen auf der Grundlage konsistenter Ausgangsreaktionen innerhalb eines zuvor festgelegten Bereichs eingestuft und einzelne Probanden werden auch nicht auf der Grundlage eines konsistent angewandten Satzes von Ausschlusskriterien bewertet, die es ermöglichen, das Ansprechen zu Studienbeginn für eine bestimmte Reihe von Studien und Assays zu standardisieren.
Hier stellen wir eine alternative Methode zur Messung der taktilen Empfindlichkeit der Hinterpfote von Mäusen nach Exposition gegenüber dem Gift von Bothrops jararaca mit einem elektronischen von-Frey-Gerät (EvF) vor. Cunha und Kollegen6 haben Pionierarbeit bei der Anwendung von EvF-Techniken bei Nagetieren geleistet und die Wirksamkeit von CvF und EvF systematisch verglichen, um zu zeigen, dass EvF ein "empfindlicheres, objektiveres und quantitativeres" Maß für die taktile Empfindlichkeit in Nagetiermodellen für entzündliche Schmerzen bietet. Kurz gesagt, bei EvF-Messungen wird eine nicht-hygroskopische Polypropylen-von-Frey-Spitze mit einheitlichem Durchmesser (0,8 mm) und geeigneter Steifigkeit für das zu testende Gewebe an einer elektronischen Sonde und Anzeige befestigt, die die Kraft/das Gewicht anzeigt, bei dem sich das Nagetier von der Spitze zurückzieht. Es gibt mehrere wichtige Unterschiede zwischen CvF- und EvF-Messungen. Erstens wird der Prozess der Messung sowohl der Ausgangsreaktionen als auch der experimentellen Reaktionen mit EvF stark vereinfacht, da der Druck auf die Hinterpfote mit zunehmender Kraft ausgeübt werden kann, bis eine Reaktion auftritt und es nicht erforderlich ist, die Spitzen wie bei CvF zu wechseln. Die Tiere verbringen weniger Zeit in den Assay-Kammern und sind daher während eines Versuchs weniger gestresst und fühlen sich wohler. Zweitens ermöglicht die EvF eine relativ einfache Umsetzung rationaler Ausschlusskriterien für Studienteilnehmer in Form von Bereichen akzeptabler Ausgangsschwellenwerte. Dies ermöglicht eine Standardisierung des Ausgangsansprechens innerhalb und zwischen Behandlungsgruppen. Drittens wird die Reaktion eines Probanden nach einer experimentellen Behandlung immer mit seiner eigenen individuellen Ausgangsreaktion verglichen, was zu wichtigen internen Kontrollen für Messungen führt. Viertens wird die Genauigkeit der Entnahmeschwellen mit einer höheren Auflösung aufgezeichnet, da der Druck kontinuierlich ausgeübt werden kann und nicht in Schritten, die in Form von Gewichten manueller Filamente verfügbar sind. Wie bei gut konzipierten CvF-Assays werden auch bei EvF-basierten Experimenten derselbe Untersucher (behandlungsblind) durchgeführt, der die Kraft aufwendet und das Reaktionsverhalten aufzeichnet. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Technik Zeit und Mühe seitens der Forscher erfordert, um die interne Konsistenz der Messungen herzustellen, und dass Experimente so geplant werden müssen, dass für Mäuse, die möglicherweise aufgrund inkonsistenter Ausgangsreaktionen ausgeschlossen werden müssen, angemessene Vorkehrungen getroffen werden.
Eine einfach zu implementierende, effektive, gut kontrollierte Bewertung der mechanischen Empfindlichkeit erleichtert das Hinzufügen von Verhaltensbewertungen zu Modellen von Entzündungsereignissen wie Vergiftung - das Beispiel, das wir hier verwendet haben, um die Fähigkeiten und die Leistungsfähigkeit von EvF-Messungen bei der Messung von Veränderungen der taktilen Empfindlichkeit zu veranschaulichen. Wir fanden heraus, dass männliche ND4-Schweizer Mäuse eine erhöhte mechanische Empfindlichkeit zeigten, nachdem sie Gift der südamerikanischen Grubenotter Bothrops jararaca in die Hinterpfote injiziert hatten. Die Verhaltensreaktionen wurden von Ödemen, Einstrom von Neutrophilen und Mastzelldegranulation im betroffenen Gewebe begleitet.

<table><tbody><tr><td>ND4 Schweizer männliche Mäuse</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>Die hier verwendeten Mäuse waren 8-12 Wochen alt und wurden gemäß den IACUC-Richtlinien des Macaleter College untergebracht und verwendet.</td></tr><tr><td>3 ml/100 Insulinspritze mit 29 G 1/2 in der Nadel</td><td>BD</td><td>BD309301</td><td>Nach jedem Gebrauch in den entsprechenden Behälter geben.</td></tr><tr><td>B. jararaca Gift</td><td>Sigma</td><td>V5625</td><td>ACHTUNG: Giftige Substanz. Tragen Sie Augen- und Hautschutz. In steriler 0,9%iger Kochsalzlösung auflösen.</td></tr><tr><td>Elektronische von-Frey-Apparatur; Sonde = 90 g Reichweite</td><td>IITC</td><td>2394</td><td>Bewegen Sie sie sanft und stellen Sie sicher, dass sie immer waagerecht ist. Um die Sonde auf Null zu setzen, drücken Sie "Programm" und "Löschen". Um vom Setup- in den Betriebsmodus zu wechseln, drücken Sie "Function" (für "MH"-Anzeige) oder "MAX".</td></tr><tr><td>Gitterständer + PMMA-Kammern</td><td>IITC</td><td>410</td><td>Stellen Sie es auf eine stabile Tischplatte oder einen Wagen mit vier Rädern, um Zugang zu allen Seiten zu haben.</td></tr><tr><td>Nur elektronische von Frey starre Spitzen, 90 g Reichweite</td><td>IITC</td><td>2390</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

messung von veränderungen in taktile empfindlichkeit in der hinterpfote von mäusen unter verwendung eines elektronischen von frey apparat

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Die Messung entzündungsinduzierter Veränderungen der Schwellenwerte für den Rückzug der Hinterpfote aus mechanischem Druck ist eine nützliche Technik, um Veränderungen der Schmerzwahrnehmung bei Nagetieren zu beurteilen. Entzugsschwellen können zuerst zu Studienbeginn und dann nach Medikamenten-, Gift-, Verletzungs-, Allergen- oder anderweitig hervorgerufenen Entzündungen gemessen werden, indem eine genaue Kraft auf sehr bestimmte Bereiche der Haut ausgeübt wird. Ein elektronisches von-Frey-Gerät ermöglicht eine präzise Bestimmung der Entnahmeschwellen der Hinterpfoten der Maus, die im Gegensatz zu klassischen von-Frey-Messungen nicht durch die verfügbaren Filamentgrößen begrenzt sind. Die Leichtigkeit und Schnelligkeit der Messungen ermöglicht die Einbeziehung der Bewertung der taktilen Sensitivitätsergebnisse in verschiedene Modelle von schnell einsetzenden entzündlichen und neuropathischen Schmerzen, da mehrere Messungen innerhalb eines kurzen Zeitraums durchgeführt werden können. Experimentelle Messungen für einzelne Nagetierprobanden können intern gegen individuelle Ausgangsreaktionen und Ausschlusskriterien gesteuert werden, die leicht festgelegt werden können, um die Ausgangsreaktionen innerhalb und zwischen Versuchsgruppen zu standardisieren. Somit stellen Messungen mit einer elektronischen von-Frey-Apparatur eine nützliche Modifikation der etablierten klassischen von Frey-Filament-basierten Assays für mechanische Allodynie von Nagetieren dar, die auch auf andere nichtmenschliche Säugetiermodelle angewendet werden können.

Die lokale Verabreichung von B. jararaca-Gift verursacht Veränderungen der taktilen Empfindlichkeit der Hinterpfote und Gewebeödeme bei ND4-Schweizer männlichen Mäusen.
1,5 Stunden nach der Verabreichung von 45 µg/kg B. jararaca-Gift zogen ND4-Schweizer männliche Mäuse ihre Hinterpfoten bei einem Druck, der 3,0 g unter dem Ausgangswert lag, zurück (Abbildung 1A). Die basale Rückzugsreaktion aller Gruppen erfolgte bei etwa 4,5 g angewendetem Druck; nach der Giftbehandlung zogen die Versuchsmäuse ihre Hinterpfoten bei 1–1,5 g angewendetem Druck zurück (Daten nicht gezeigt). Salinbehandelte Kontrollmäuse zeigten zu allen untersuchten Zeitpunkten kaum oder keine Verringerung der Reaktion auf Druck im Vergleich zum Ausgangswert. Die erniedrigten Reaktionsschwellen bei behandelten Mäusen blieben deutlich über 3 und 6 Stunden nach der Vergiftung erhalten (Abbildung 1A) und waren nach 24 Stunden nicht mehr von den Kontrollen zu unterscheiden (Daten nicht gezeigt). Die Hinterpfoten der vergifteten Mäuse wiesen ein Gewebsödem auf, das typisch für eine Entzündung ist. 1,5 Stunden nach der Gabe des Gifts waren die behandelten Hinterpfoten, gemessen wie zuvor beschrieben10, 1,5 mm dicker als im Ausgangszustand; das Ödem blieb über 3 und 6 Stunden bestehen (Abbildung 1B). Im Gegensatz dazu zeigten salinbehandelte Pfoten während des gesamten Versuchszeitraums keine Schwellung oder Dickenveränderung. Für das hier dargestellte repräsentative Experiment wurden insgesamt 21 Mäuse für die Basismessungen verwendet, von denen 14 zur Aufnahme in das Experiment ausgewählt wurden. Diese wurden den Behandlungsgruppen so zugeordnet, dass die durchschnittlichen Rückzugsreaktionen im Ausgangszustand für jede Gruppe insgesamt bei etwa 4,5 g lagen.
Durch das Gift von B. jararaca hervorgerufene Veränderungen der Tastempfindlichkeit gehen mit einer Degranulation der Mastzellen und einem Neutrophileneinstrom in die Hinterpfoten von männlichen ND4-Swiss-Mäusen einher.
Zusätzlich zu erhöhter taktile Empfindlichkeit und Gewebeödem untersuchten wir den Neutrophileneinstrom (Abbildungen 2A–B) und die Degranulation von Mastzellen (Abbildungen 2C–D) in den Hinterpfoten von vergifteten im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen. Neutrophile sind die ersten entzündlichen Zellen, die aus der Zirkulation in eine Läsion rekrutiert werden, und sind dafür bekannt, entzündliche nozizeptive Reaktionen zu vermitteln10,16,17. Mastzellen sind im Gewebe ansässige Wächterzellen18, und die Degranulation von Mastzellen wurde mit nozizeptiven Reaktionen in der Hinterpfote von Mäusen10 sowie mit der Dura mater von Ratten19 assoziiert.
Hier stellten wir fest, dass der Neutrophileneinstrom in die mit Gift behandelten Hinterpfoten im Vergleich zu den mit Kochsalzlösung behandelten Hinterpfoten um fast das 1.000-Fache erhöht war (Abbildung 3A), wie durch Zählung von Hämatoxylin-Eosin-gefärbten 4 µm Paraffinschnitten sagittaler plantarer Gewebeproben ermittelt wurde10, die 1,5 Stunden nach Gabe des Gifts von euthanasierten Mäusen entnommen wurden.
In den mit Kochsalzlösung behandelten Pfoten waren die mastzellen im plantaren Gewebe der Hinterpfote weitgehend intakt oder wiesen eine leichte Degranulation auf (Abbildung 3B). Im Gegensatz dazu zeigten die mit Gift behandelten Hinterpfoten eine moderate bis ausgeprägte Degranulation von Mastzellen in einem Ausmaß von 15–20 % (Abbildung 3B). Die oben beschriebenen Gewebeschnitte wurden mit Toluidinblau gefärbt, und die Anzahl sichtbarer Granula pro beobachteter Mastzelle wurde gezählt, um den Grad der Degranulation wie zuvor beschrieben zu bestimmen10.
<img alt="B. jararaca venom effect graphs: A) Mechanical threshold, B) Paw width over time. Statistical data.
" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Abbildung 1. Lokal B. jararaca Die Verabreichung des Giftes führt bei ND4-Schweizer männlichen Mäusen zu Veränderungen der mechanischen Empfindlichkeit der Hinterpfote sowie zu Gewebeödemen. Basale Withdrawal-Schwellen und basale Pfotenbreite wurden 48 und 24 Stunden vor der intra-plantaren B. jararaca Gift (Bjv; 45 µg/kg) oder Behandlung mit dem Lösungsmittel (physiologische Kochsalzlösung) (10 µl). Die Withdrawal-Schwellen wurden 1,5, 3 und 6 Stunden nach der Behandlung bestimmt (A). Adurchschnittliche Pfotenbreite (Mittelwert aus der Breite der linken und rechten Pfote einer Maus) im mittleren plantaren Bereich wurde mit einem digitalen Messschieber zum Ausgangszeitpunkt sowie 1,5, 3 und 6 Stunden nach der Behandlung bestimmt, um das Gewebeödem wie zuvor beschrieben zu ermitteln10 (B). Die Signifikanzniveaus werden im Vergleich zu Sal-behandelten Mäusen angegeben (* = p &lt; 0,05, ** = p &lt; 0,01, *** = p &lt; 0,001 bzw.). n = 10–11 Mäuse pro Behandlungsgruppe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um die Abbildung in voller Größe anzuzeigen</a>.
<img alt="Histological comparison of saline and B. jararaca effects, under 400x and 1000x magnification." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Abbildung 2. B. jararaca Die durch Gift induzierte mechanische Empfindlichkeit geht einher mit einer Degranulation von Mastzellen und einem Neutrophileneinstrom in die Hinterpfoten von ND4-Schweizer männlichen Mäusen. 3 Mäuse/Behandlungsgruppe wurden durch CO getötet2 1,5 Stunden nach der Behandlung und ihre Hinterpfoten wurden entfernt, 24 Stunden lang in 10 % Formalin fixiert, in 70 % Ethanol überführt, 1–2 Wochen lang in 15 % EDTA entkalkt und in Paraffin eingebettet. 4 µm sagittale Schnitte wurden mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt (A-B) und Toluidinblau (C-D) zur Visualisierung von Neutrophilen (A-B) und Mastzellen (C-D), jeweils. Die Bilder wurden bei 400facher und 1.000facher Vergrößerung wie annotiert aufgenommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um die Abbildung in voller Größe anzuzeigen</a>. 
<img alt="Neutrophils and degranulation by B. jararaca venom; bar graph; venom impact analysis." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Abbildung 3. B. jararaca Die durch Gift induzierte mechanische Empfindlichkeit geht mit signifikanten Zunahmen der Mastzell-Degranulationswerte und einem verstärkten Neutrophileneinstrom in die Hinterpfoten von männlichen ND4 Swiss-Mäusen einher. Neutrophile und Mastzellen in gefärbten Gewebeschnitten wurden mit einem Olympus CX21LED-Mikroskop gezählt. Neutrophile wurden in jeweils 3 Hinterpfoten pro Behandlungsgruppe von der Ferse bis zu den Zehen in benachbarten Sichtfeldern bei 400facher Vergrößerung gezählt. (A). Mastzellen wurden in 3 Fußpolstern pro Behandlung gezählt, und ihr Degranulationsstatus wurde anhand der Anzahl sichtbarer Granula außerhalb der Zellgrenze bewertet: intakt (0), leicht (0–10), mäßig (10–20), ausgedehnt (21+), wie zuvor beschrieben10 (B).  Um zu verhindern, dass dieselben Zellen doppelt gezählt werden, verwendeten die Untersuchenden, die die Neutrophilenanzahl und den Grad der Mastzelldegranulation in den Hinterpfoten-Schnitten beurteilten, ein im Okular-Netz eingezeichnetes Raster. Die Untersuchenden waren gegenüber der Behandlung verblindet.s. Die Signifikanz wird im Vergleich zu mit Sal behandelter Maus angegeben (* = p &lt; 0,05, ** = p &lt; 0,01, *** = p &lt; 0,001 bzw.). n = 3 Mäuse pro Behandlungsgruppe.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um die Abbildung in voller Größe anzuzeigen</a>.

Elektronische von-Frey-Messungen sind eine effektive und verbesserte Alternative zu klassischen von-Frey-Filamenten, da sie eine schnelle und präzise Messung der Veränderungen der mechanischen Entnahmeschwellen von Nagetieren bei kontinuierlich angelegten Druckreizen vor und nach einem Entzündungsereignis ermöglichen.

Messung von Veränderungen in Taktile Empfindlichkeit in der Hinterpfote von Mäusen unter Verwendung eines elektronischen von Frey Apparat

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, nicht suszeptible Reaktionen auf mechanischen Druck in der Hinterpfote von Mäusen zu messen. Dazu werden die Tiere zunächst auf einen Drahtgitterboden gestellt und haben die Möglichkeit, sich daran zu akklimatisieren. Anschließend wird eine Polypropylen-Spitze an die Unterseite der Hinterpfote angelegt, und der Druck wird schrittweise erhöht. Wenn die entsprechende Verhaltensreaktion festgestellt wird, wird der Reiz zurückgenommen. Nachdem die Basiswerte erhoben wurden, erhalten die Tiere eine experimentelle Intervention, bevor weitere Tests durchgeführt werden. Schließlich werden die Änderungen der Withdrawal-Schwellen der Hinterpfoten zwischen den Behandlungsgruppen verglichen, um den Einfluss einer bestimmten Behandlung auf die Veränderungen der taktilen Empfindlichkeit gegenüber Druck zu bestimmen.Schmerz ist eine zentrale Komponente der Entzündung. Es ist wichtig, Schmerz in verschiedenen Kontexten zu messen und zu charakterisieren. Diese relativ einfache Methode der Schmerzbeurteilung kann auf zahlreiche verschiedene Modelle der Entzündung angewendet werden.Die Durchführung der Methode wird Tiana ov, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin in meinem Labor, Madison Mack, die als Studentin an dieser Arbeit beteiligt war, und Akila Sykes demonstrieren, die derzeit als Studentin in meinem Labor tätig ist. Wir beginnen damit, die Testapparatur so einzurichten, dass leichter Zugang zu den Hinterpfoten gewährleistet ist.Platzieren Sie einzelne Kammern auf einem Maschenboden. Der Maschenboden sollte sich in einer bequemen Höhe und auf einer stabilen Unterlage befinden. Stellen Sie anschließend das elektronische Von-Frey-Gerät auf die Laborbank.Stellen Sie sicher, dass die Sonde und das Kabel ordnungsgemäß mit der Anzeigeeinheit verbunden sind, und schalten Sie das Gerät im Einrichtungsmodus ein. Stellen Sie die Anzeige auf Null und platzieren Sie vorsichtig das bereitgestellte Prüfgewicht auf dem Kegel der Von-Frey-Sonde. Notieren Sie den Anzeigewert und wiederholen Sie diesen Vorgang am Ende der Prüfung. Falls zwischen den beiden Werten eine Abweichung besteht, muss das Gerät möglicherweise neu kalibriert werden.Wählen Sie eine Polypropylen-Spitze passender Größe für das zu untersuchende Gewebe aus. Starre Spitzen eignen sich gut für das weniger empfindliche, robustere Gewebe der Hinterpfote. Befestigen Sie die Spitze vorsichtig am Kegel der Sonde.Wechseln Sie anschließend vom Einrichtungsmodus in den Betriebsmodus. Dadurch wird der maximale aufgebrachte Druck angezeigt, wenn die Sonde zurückgezogen wird. Zur Messung der Entzugs­schwellen der Hinterpfote sind zwei Untersucher erforderlich.Eine Person bedient das Gerät und führt die Messungen durch, während eine andere die Messwerte aufzeichnet, um Verzerrungen zu minimieren. Die Untersucherin oder der Untersucher, die oder der das Anästhesiegerät bedient, sollte gegenüber den Behandlungen sowie den aufgezeichneten Withdrawal-Schwellenwerten verblindet sein. Darüber hinaus sollte zur Sicherstellung der Konsistenz zwischen den Messungen dieselbe Person alle Basiswerte und Withdrawal-Schwellenwerte erfassen.48 Stunden vor der Behandlung werden die ersten Baseline-Messungen aufgezeichnet. Legen Sie absorbierendes Material unter das Gestell, um ausgeschiedene Abfälle aufzufangen. Nachdem die Spitze montiert und die Sonde auf Null gestellt wurde, platziert der Experimentator, der die Messungen aufzeichnet, die Mäuse in einzelne Kammern.Bedecken Sie die Kammern mit perforierten Deckeln und legen Sie einen schweren Gegenstand darauf. Um zu verhindern, dass die Mäuse entkommen, sollten diese 15 Minuten lang an die Kammer gewöhnt werden, bevor der Vorgang fortgesetzt wird. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten mit dem schrittweisen Aufbringen erhöhten Drucks sowie mit der Erzielung einer internen Konsistenz bei eigenen Messungen; Übung ist daher unerlässlich, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.Wenn bereit, heben Sie die Sonde mit beiden Händen langsam an und stimulieren Sie die Fußsohle der linken oder rechten Hinterpfote. Steigern Sie den Druck schrittweise, bis ein nozizeptives Verhalten beobachtet wird. Dieses wird durch eine Rückzugsreaktion der Hinterpfote, Ablecken der Hinterpfote oder ein Hochspringen der Pfote erkannt.Weisen Sie den anderen Untersucher an, den Druck zu dokumentieren, der das beobachtete Verhalten ausgelöst hat. Während der Messung ist es hilfreich, die Maus dazu anzuregen, ruhig zu halten, indem ein Futterplättchen direkt außerhalb der Kammer platziert oder ein leises Geräusch, wie ein sanftes Klopfen, erzeugt wird, bevor die Messung durchgeführt wird. Fahren Sie mit der nächsten Maus fort, bis jede einmal getestet wurde, und wiederholen Sie diesen Vorgang noch viermal.Nachdem fünf Basiswerte erhoben wurden, berechnen Sie einen Durchschnittswert für jede Maus. Wiederholen Sie die Basislinienmessungen 24 Stunden später und verwenden Sie diese Werte, um einen weiteren Durchschnitt zu berechnen. Um sicherzustellen, dass alle Mäuse konsistente Basiswerte aufweisen, schließen Sie Tiere aus, deren durchschnittlicher Basiswert der Rückzugschwelle unter 3,5 Gramm liegt oder deren Basiswerte um zwei Gramm oder mehr voneinander abweichen.Zuletzt werden die Mäuse so auf separate Behandlungsgruppen verteilt, dass der durchschnittliche Entzugsgrundwert jeder Gruppe so ähnlich wie möglich ist. Hier wurden die Entzugsschwellen nach Behandlung der Hinterpfote mit dem Gift, ROS raca, und kontrollseitiger Gabe von Kochsalzlösung gemessen. Die Mäuse zeigten im Vergleich zum Grundwert zu allen Zeitpunkten kaum eine Veränderung.Die getesteten Punkte zeigten, dass die nozizeptiven Reaktionen bei behandelten Mäusen deutlich bis zu sechs Stunden aufrechterhalten blieben. Außerdem war eine Gewebeödem, charakteristisch für Entzündung, in den Hinterpfoten nach Behandlung mit Gift, jedoch nicht nach Behandlung mit Kochsalzlösung, erkennbar. Die durch das Gift hervorgerufenen Veränderungen der taktilen Empfindlichkeit gingen mit einem Neutrophileneinstrom einher, der um fast das 1000-fache erhöht war.Im Vergleich zu den mit Kochsalzlösung behandelten Hinterpfoten wiesen die plantaren Mastzellen im Gewebe der Hinterpfoten größtenteils eine intakte Struktur auf oder zeigten eine leichte Degranulation. Im Gegensatz dazu zeigten makierte Hinterpfoten eine moderate bis ausgeprägte Degranulation der Mastzellen in einem Ausmaß von 15 bis 20 %. Diese Technik kann angepasst werden, um die mechanische oder taktile Empfindlichkeit einer Vielzahl von Geweben außer den Hinterpfoten zu bewerten.Daher kann diese Technik in viele verschiedene Nagetiermodelle von Entzündung und Schmerz integriert werden.

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Forschung

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Messung von Veränderungen in Taktile Empfindlichkeit in der Hinterpfote von Mäusen unter Verwendung eines elektronischen von Frey Apparat (Video) | JoVE Journal

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