Elektro-Zell-Substrat-Impedance Sensing zur Quantifizierung der endothelialen Proliferation, Barrierefunktion und Beweglichkeit

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Impedanzmessung von Substraten für elektrische Zellen, bekannt als EIS, zur Charakterisierung zellulärer Verhaltensweisen zu verwenden. Dies wird erreicht, indem Zellen auf Elektroden in einem Array gezüchtet werden und Messungen in verschiedenen Modi durchgeführt werden, um die Bildung und Reifung der Endothelbarriere zu quantifizieren, und Funktionsmanipulationen wie elektrisches Wunding und Hinzufügen von Stimulanzien werden dann durchgeführt, um die Zellmotilität und Barrierefunktion zu testen. Es werden Ergebnisse erhalten, die die Zelladhäsion, Proliferation, Migration, Detektion der Endothelpermeabilität und die Beurteilung von Zell-, Zell- und Zellsubstratkontakten auf der Grundlage von ESIS beschreiben.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im zellbiologischen Bereich zu beantworten, wie z. B. die Online-Generierung quantitativer Daten und die Charakterisierung von Zellen in ihrem natürlichen Konfluenzzustand unter ihren Standard-Zellkulturbedingungen. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da die zugrunde liegende Theorie komplex erscheint und Sie sich einiger grundlegender Überlegungen bewusst sein müssen, bevor Sie ein Experiment beginnen. Zu Beginn müssen die Arrays gereinigt und stabilisiert werden, um Elektrodendrift zu verhindern, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und das Signalstärkeverhältnis zu erhöhen.

Geben Sie daher nach 15 Minuten 200 Mikroliter 10 millimolare EL-Ine in jede Vertiefung eines Acht-Well-Arrays. Bei Raumtemperatur entfernen Sie das EL-Cystin mit zwei Reinstwasserwaschmitteln, nicht mit Phosphatpuffern. Setzen Sie die Elektroden vor dem Beschichten auch nicht serumhaltigen Lösungen aus, da diese die Proteinabsorption beeinträchtigen können. Geben Sie dann 200 Mikroliter erwärmte 1%ige Gelatine in jede Vertiefung und inkubieren Sie das Array eine halbe Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Verwenden Sie zum Entfernen der Gelatine Reinstwasser und lassen Sie die Elektrodenoberflächen nicht austrocknen. Füllen Sie dann die Vertiefungen mit 400 Mikrolitern vollständigem Nährmedium, das nun Serum enthalten kann. Legen Sie das Array in den Halter ein.

Überprüfe die neun goldenen Quadrate. Sie sollten sich mit den POGO-Pins in Verbindung setzen. Befestigen Sie das Array vorsichtig von Hand, indem Sie die Einstellschraube am Computer festziehen.

Öffnen Sie die Messsoftware. Drücken Sie auf "Setup" und aktivieren Sie dann im Abschnitt "Daten sammeln", um eine schnelle Impedanzmessung jedes Wells bei der Standardfrequenz von 4.000 Hertz durchzuführen. Die Werte werden im Kommentarbereich gespeichert.

Stellen Sie sicher, dass bei der Überprüfung der Typ des verwendeten EIS-Arrays im Abschnitt "Well-Konfiguration" im Array-Diagramm korrekt ausgewählt wurde. Rot und Grün kennzeichnen die Funktionalität der Verbindungen. Wenn die Reinigung und Codierung erfolgreich war, sollten acht W one E sys-Arrays etwa fünf bis sechs NANOFARAD- und acht W 10 E-Arrays registrieren.

Der Ausgangswiderstand von 50 bis 60 Nanofarad vor der Zellaussaat beträgt somit etwa 2000 Ohm. Um die Daten mit RB alpha und cm zu modellieren, starten Sie eine MFT-Aufzeichnung mit dem Medium failed Array. Nehmen Sie 15 Minuten zellfreie Daten und beenden Sie das Experiment, um die Zellen hinzuzufügen.

Entfernen Sie nun das Array und säen Sie 400 Mikroliter Einzelzellsuspension in jede Vertiefung. Um Zellwachstumskeime zu untersuchen, 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter, beginnend mit einem fast konfluenten Populationskeim, 60.000 Zellen pro Quadratzentimeter. Nachdem Sie das Array in den Halter geladen haben, wählen Sie im Abschnitt "Well-Konfiguration" die Wells aus, die gemessen werden sollen.

Gehen Sie dann zu den Optionen zum Sammeln von Daten und wählen Sie einen Messmodus für eine Zeitreihe mit einer festen Frequenz, wählen Sie SFT, wählen Sie die Messfrequenz zur Messung der Elektrodenabdeckung und modellieren Sie RB und Alpha wählen Sie MFT, und das Gerät führt automatisch Messungen bei allen verfügbaren Frequenzen durch. Führen Sie die Messung nach Möglichkeit im Mehrfrequenzmodus durch. Dies erfordert Daten in allen verfügbaren Frequenzen und liefert damit die meisten Erkenntnisse.

Wählen Sie für die Mikrobewegungsanalyse RTC und passen Sie die Abtastfrequenz an. Die standardmäßige zeitliche Auflösung beträgt ein Hertz, kann aber erhöht werden, um schnelle Änderungen der Impedanz zu verfolgen. Der Wert kann für die z Theta auf 25 Hertz erhöht werden.

Um die Mikrobewegung sequenziell aus vielen Vertiefungen zu messen, wählen Sie das Hilfemenü aus. Wählen Sie dann die Menüpunkte der Expertensymbolleiste anzeigen und erfassen und Multi-Well-RTC aus. Achten Sie darauf, im Abschnitt "Daten erfassen" das Zeitlimit in Stunden anzugeben.

Wenn Sie diese Einstellung verwenden, fragt die Software nach dem Start der Datenerfassung nach der Anzahl der Zyklen. Wenn Sie Daten mit SFT oder MFT erfassen, wählen Sie das Zeitintervall zwischen den Messungen in Sekunden aus. Lassen Sie diese Option deaktiviert, um eine maximale Datenerfassung zu erzielen.

Drücken Sie nun auf Start und geben Sie an, wo die Daten gespeichert werden sollen. Der Lauf wird durch Drücken von Fertigstellen gestoppt. Durch Drücken von Pause wird die Datenerfassung gestoppt, aber die experimentelle Uhr läuft weiter.

Entfernen Sie nun das Array und manipulieren Sie die Vertiefungen unter einer Laminar-Flow-Haube. Nachdem Sie das Array wieder in die Halterung eingesetzt haben, klicken Sie auf Verbindung prüfen, um die elektrischen Verbindungen zu überprüfen, und setzen Sie dann das Experiment fort, um mit der Datenerfassung fortzufahren. Wenn die Zellen nach der Manipulation nicht steril sein müssen, kann ein Stimulus wie Thrombin während der Datenerfassung direkt in eine Vertiefung gegeben werden.

Solche eingeführten Variationen können auf der Experimentieruhr markiert werden, indem man auf Mark drückt und einen Kommentar hinzufügt. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Zellen elektrisch aufzuwickeln. Die Einstellungen dafür müssen etwas angepasst werden, um eine kurze Verwundungszeit zu erreichen, und es ist nicht zu lange wirksam, und Sie können die Elektroden beschädigen.

Beginnen Sie einfach mit den Standardeinstellungen, die die Software bereitstellt, und fahren Sie von dort aus fort. Gehen Sie zum Abschnitt Setup der gewickelten Elektroparade und aktivieren Sie die Wunde. Wählen Sie nun unter Well-Konfiguration die Wells aus, die gewickelt werden sollen.

Nur die überprüften Brunnen werden verwundet. Wenn Sie auf Aktivieren klicken, wird ein Popup-Fenster geöffnet, in dem Sie zur Verwundung aufgefordert werden. Prüfen Sie nach dem Verwunden, ob das Signal auf einen Wert einer nahezu zellfreien Elektrode abfällt.

Wenn die Verwundung im Allgemeinen nicht wiederholt wurde, um mit den Daten zu arbeiten, verwenden Sie die Option Daten exportieren, und wählen Sie Excel aus. Die RB- und Alpha-Modellierung kann jedoch aus der Software heraus durchgeführt werden. Beachten Sie, dass die Modellierung in den MFT-Daten nur in Konfluenzzellschichten gültig ist.

Und vergessen Sie nicht, die zellfreie Referenz hinzuzufügen. Beginnen Sie mit der automatischen Auswahl einer zellfreien Referenz mit der Suchfunktion im Abschnitt Modellierung und Analyse von Frequenzscans. Übernehmen Sie den Wert mit set.

Drücken Sie anschließend auf Modell, um die Berechnungen zu starten. Seien Sie nicht beunruhigt, wenn dies mehrere Minuten dauert. Während eines typischen Experiments gehen Zellen von einer Wachstumsphase in eine Plateauphase über.

Wenn sie die Konfluenz erreichen, werden während dieses Prozesses Bilder direkt von der Elektrode aufgenommen. Die nächste Phase ist die Bildung und Reifung der EC-Barriere. Die elektrische Verwundung wird dann verwendet, um die Zellmigration zu untersuchen.

Auf einen charakteristischen Abfall des Signals auf die Grundlinie folgt die Wiederherstellung des Konfluenzzustands. Schließlich wird die Reaktion auf Reize in Echtzeit verfolgt. Hier wurde der vasoaktive Wirkstoff Thrombin eingesetzt.

Dies führte zu einer zellulären Kontraktion und damit zu einer vorübergehenden Öffnung kleiner Lücken in der Barriere, was zu einem Abfall des Impedanzwiderstands führte, und Kapazitätsmessungen liefern ergänzende Informationen über die Zelladhäsion und den Wachstumswiderstand bei der empfindlichsten Messung. Die Frequenz repräsentiert die Qualität und Funktion der Zellbarriere und berücksichtigt den Widerstand gegenüber dem parazellulären und transzellulären Stromfluss. Wenn Zellen an den Elektroden befestigt werden, schränken sie den Stromfluss ein und die Kapazität sinkt proportional.

Diese Phase ermöglicht eine Gesamtmessung der Elektrodenabdeckung und lässt sich am besten quantifizieren, wenn die Kapazität bei einer Frequenz von mehr als 40 Kilohertz aufgezeichnet wird. Der Widerstand gibt eine klare Vorstellung davon, wie gute Zellen den Stromfluss und damit die Qualität der Zellbarriere blockieren können. Daher haben Zellen unterschiedlicher Passagen und verschiedener Typen unterschiedliche Widerstände.

Unser RB und alpha hilft bei der Unterscheidung zwischen Zellzell- und Zellmatrix-Adhäsionen. RB ist der spezifische Widerstand der Zellzellkontakte zum Stromfluss oder ein inverses Maß der Permeabilität. Alpha ist ein Maß für die Impedanzbeiträge der Zellelektrodenübergänge.

Sowohl der RB- als auch der Alpha-Wert können aus der ISIS-Software berechnet werden. Kleine Schwankungen im Widerstandssignal können auf subtile Bewegungen in der Konfluenzzellschicht oder Mikrobewegungen zurückzuführen sein. Sie können mit einem E-Array bei der empfindlichsten Frequenz gemessen und durch schnelle Fourier-Transformation innerhalb der EIS-Software analysiert werden. Manipulationen, die einen Einblick in das zelluläre Verhalten geben, können präzise vorgenommen werden.

Zum Beispiel ist es möglich, eine elektrische Wunde von 250 Mikrometern herzustellen, die sich innerhalb weniger Stunden schließt, um die Zellmigration zu untersuchen. Die Impedanzspektroskopie eignet sich auch gut, um die Wirkung von zugesetzten Substanzen zu analysieren. Wie bereits erwähnt, macht Thrombin die Zellbarriere hyperpermeabel, indem es die Basalzellspannung mit dem ARO-Kinase-Inhibitor senkt, die Wirkung von Thrombin könnte verringert werden Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass ESIS extrem empfindlich auf Veränderungen in der Zellumgebung wie Temperatur, pH-Wert, Medienmangel usw. reagiert.

Nach der Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Humantechnik den Weg, die Trends und Auswirkungen von vasoaktiven Wirkstoffen auf Konfluenzzellkulturen in Echtzeit zu untersuchen.