Elektro-Zell-Substrat-Impedance Sensing zur Quantifizierung der endothelialen Proliferation, Barrierefunktion und Beweglichkeit

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe der elektrischen Zell-Substrat-Impedanz-Sensierung, bekannt als eis, zelluläre Verhaltensweisen zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem Zellen auf Elektroden in einem Array kultiviert und Messungen in verschiedenen Modi durchgeführt werden, um die Bildung und Reifung von endothelialen Barrieren zu quantifizieren. Anschließend werden Manipulationen wie elektrische Verletzung und Zugabe von Stimulanzien vorgenommen, um die Zellmotilität und Barrierefunktion zu testen. Es werden Ergebnisse erhalten, die die Zelladhäsion, Proliferation, Migration, die Detektion der endothelialen Permeabilität sowie die Beurteilung von Zell-Zell- und Zell-Substrat-Kontakten auf Grundlage der esis beschreiben.

Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im zellbiologischen Bereich zu beantworten, beispielsweise durch die Echtzeiterzeugung quantitativer Daten und die Charakterisierung von Zellen in ihrem natürlichen Konfluenzzustand unter standardmäßigen Zellkulturbedingungen. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die zugrundeliegende Theorie komplex erscheint und man mehrere grundlegende Aspekte beachten muss, bevor man ein Experiment beginnt. Zunächst müssen die Arrays gereinigt und stabilisiert werden, um Elektrodenverschiebungen zu verhindern, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen.

Daher 200 Mikroliter 10-Millimolar-EL-ine nach 15 Minuten in jedes Brunnen eines Acht-Brunnen-Arrays geben. Bei Raumtemperatur das EL-Cystin durch zwei Waschungen mit ultrareinem Wasser entfernen, keine Phosphatpuffer verwenden. Zudem die Elektroden vor der Beschichtung nicht Exposition gegenüber serumhaltigen Lösungen aussetzen, da diese die Proteinaufnahme stören können. Danach 200 Mikroliter erwärmtes 1 %-Gelatinin jedes Brunnen geben und das Array für eine halbe Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Um die Gelatine zu entfernen, verwenden Sie ultrareines Wasser und lassen Sie die Elektrodenoberflächen nicht austrocknen. Füllen Sie dann die Vertiefungen mit 400 Mikrolitern vollständigem Kulturmedium, das nun Serum enthalten kann. Setzen Sie das Array in den Halter ein.

Überprüfen Sie die neun goldenen Quadrate. Diese sollten die POGO-Stifte berühren. Befestigen Sie das Array vorsichtig von Hand und ziehen Sie die Justierschraube am Computer fest.

Öffnen Sie die Messsoftware. Drücken Sie auf Einrichten und überprüfen Sie dann im Abschnitt „Daten sammeln“, um eine schnelle Impedanzmessung jedes Wells bei der Standardfrequenz von 4.000 Hertz durchzuführen. Die Werte werden im Kommentarbereich gespeichert.

Stellen Sie sicher, dass unter dem Abschnitt „Wellenkonfiguration“ im Array-Diagramm korrekt der verwendete Typ des EIS-Arrays ausgewählt wurde. Rot und Grün zeigen die Funktionalität der Verbindungen an. Falls die Reinigung und Codierung erfolgreich waren, sollten acht W one E sys-Arrays etwa fünf bis sechs NANOFARAD und acht W 10 E-Arrays registrieren.

Der Ausgangswiderstand von 50 bis 60 Nanofarad vor der Zellseeding beträgt somit etwa 2000 Ohm. Um die Daten mithilfe von RB Alpha und cm zu modellieren, starten Sie eine MFT-Aufzeichnung mit dem Array, bei dem das Medium versagt hat. Nehmen Sie 15 Minuten lang datenfreie Messungen vor und beenden Sie das Experiment, um die Zellen hinzuzufügen.

Entfernen Sie nun das Array und geben Sie 400 Mikroliter Einzelzell-Suspension in jede Vertiefung. Um das Zellwachstum zu untersuchen, säen Sie 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter; für einen nahezu konfluenten Zellrasen säen Sie 60.000 Zellen pro Quadratzentimeter. Nachdem Sie das Array in den Halter eingelegt haben, wählen Sie im Abschnitt „Well-Konfiguration“ die zu messenden Vertiefungen aus.

Wechseln Sie dann zu den Datenerfassungsoptionen und wählen Sie einen Messmodus für eine Zeitreihe mit fester Frequenz: Wählen Sie SFT und die Messfrequenz, um die Elektrodenbedeckung zu messen, und wählen Sie MFT, um das Modell RB und Alpha zu bestimmen. Das Gerät führt dann automatisch Messungen bei allen verfügbaren Frequenzen durch. Führen Sie die Messung nach Möglichkeit im Multifrequenzmodus durch. Dies erfordert Daten bei allen verfügbaren Frequenzen und liefert dadurch die umfassendsten Erkenntnisse.

Wählen Sie für die Mikrobewegungsanalyse RTC aus und passen Sie die Abtastrate an. Die standardmäßige zeitliche Auflösung beträgt ein Hertz, kann jedoch erhöht werden, um schnelle Änderungen der Impedanz zu verfolgen. Der Wert kann für das z-Theta auf 25 Hertz erhöht werden.

Um Mikrobewegungen nacheinander aus mehreren Vertiefungen zu messen, wählen Sie das Hilfemenü. Wählen Sie dann die Menüpunkte „Expertentoolleiste anzeigen“ sowie „Mehrere Vertiefungen RTC erfassen“. Im Abschnitt „Daten sammeln“ stellen Sie sicher, dass Sie die Zeitbegrenzung in Stunden angeben.

Bei Verwendung dieser Einstellung fordert die Software nach dem Start der Datenaufnahme zur Eingabe der Anzahl der Zyklen auf. Bei der Datensammlung mittels SFT oder MFT wählen Sie das Zeitintervall zwischen den Messungen, angegeben in Sekunden. Für eine maximale Datenaufnahme lassen Sie diese Option deaktiviert.

Drücken Sie nun auf Start und geben Sie an, wo die Daten gespeichert werden sollen. Der Durchlauf wird beendet, indem Sie auf Beenden drücken. Durch Drücken von Pause wird die Datenaufnahme angehalten, jedoch läuft die experimentelle Uhr weiter.

Entfernen Sie nun das Array und bearbeiten Sie die Vertiefungen unter einer laminaren Luftstromhaube. Nachdem das Array in den Halter zurückgebracht wurde, klicken Sie auf „Verbindung prüfen“, um die elektrischen Anschlüsse zu überprüfen, und anschließend auf „Experiment fortsetzen“, um die Datenerfassung fortzusetzen. Falls die Zellen nach der Manipulation nicht sterilen Bedingungen unterliegen müssen, kann ein Stimulus wie Thrombin während der Datenaufnahme direkt einer Vertiefung zugegeben werden.

Solche eingeführten Variationen können auf der experimentellen Zeitskala markiert werden, indem man „mark“ drückt und einen Kommentar hinzufügt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Zellen elektrisch zu verletzen. Die Einstellungen hierfür erfordern einige Anpassungen, um eine kurze Verletzungszeit zu erreichen, da die Methode nicht zu lange wirksam ist und die Elektroden beschädigt werden können.

Beginnen Sie einfach mit den vom Softwarestandard vorgegebenen Einstellungen und gehen Sie von dort aus vor. Gehen Sie zum Abschnitt „The wound electro parade setup“ und aktivieren Sie die Wunde. Wählen Sie nun die unter „Well-Konfiguration“ zu verletzenden Wells aus.

Nur die markierten Vertiefungen werden verletzt. Durch Klicken auf „aktivieren“ öffnet sich ein Popup-Fenster, das zur Verletzung auffordert. Nach der Verletzung überprüfen, ob das Signal auf einen Wert eines nahezu zellfreien Elektrodenbereichs abfällt.

Falls die Verletzung nicht allgemein zur Arbeit mit den Daten wiederholt wurde, verwenden Sie die Option zum Exportieren der Daten und wählen Sie Excel aus. RB- und Alpha-Modellierung können jedoch direkt innerhalb der Software durchgeführt werden. Beachten Sie bei den MFT-Daten, dass die Modellierung nur bei konfluenten Zellschichten gültig ist.

Und vergessen Sie nicht, die zellfreie Referenz hinzuzufügen. Wählen Sie zunächst automatisch eine zellfreie Referenz mithilfe der Suchfunktion im Abschnitt zur Frequenzscan-Modellierung und -Analyse aus. Bestätigen Sie den Wert mit „Setzen“.

Drücken Sie anschließend auf Modell, um die Berechnungen zu starten. Seien Sie nicht beunruhigt, wenn dies mehrere Minuten in Anspruch nimmt. Während eines typischen Experiments durchlaufen die Zellen eine Wachstumsphase und gelangen in eine Plateauphase.

Wenn sie Konfluenz erreichen, werden während dieses Prozesses direkt von der Elektrode Bilder aufgenommen. Die nächste Phase ist die Bildung und Reifung der endothelialen Barriere. Anschließend wird eine elektrische Verletzung verwendet, um die Zellmigration zu untersuchen.

Ein charakteristischer Abfall des Signals auf den Grundwert wird gefolgt vom Wiederherstellen des Konfluenzzustands. Schließlich wird die Reaktion auf Reize in Echtzeit verfolgt. Hier wurde das vasokative Agens Thrombin zugegeben.

Dies führte zu einer zellulären Kontraktion und dadurch zu einer vorübergehenden Öffnung kleiner Lücken in der Barriere, was einen Abfall der Impedanz, des Widerstands und der Kapazitätsmessungen zur Folge hatte, die ergänzende Informationen über die Zelladhäsion und Wachstumsresistenz bei der empfindlichsten Messung liefern. Die Frequenz repräsentiert Qualität und Funktion der Zellbarriere und berücksichtigt den Widerstand gegenüber parazellulärem und transzellulärem Stromfluss. Wenn sich die Zellen an den Elektroden anheften, beschränken sie den Stromfluss, und die Kapazität sinkt proportional.

Diese Phase liefert eine Gesamtbewertung der Elektrodenbedeckung und wird am besten quantifiziert, indem die Kapazität bei einer Frequenz über 40 Kilohertz gemessen wird. Der Widerstand gibt Aufschluss darüber, wie gut Zellen den Stromfluss blockieren können und damit über die Qualität der Zellbarriere. Daher weisen Zellen unterschiedlicher Passagen und verschiedener Typen unterschiedliche Widerstände auf.

Unser RB und Alpha helfen dabei, zwischen Zell-Zell- und Zell-Matrix-Adhäsionen zu unterscheiden. RB ist der Widerstand von Zell-Zell-Kontakten gegenüber dem Stromfluss oder eine inverse Messgröße für die Permeabilität. Alpha ist ein Maß für die Impedanzbeiträge der Zell-Elektroden-Übergänge.

Sowohl der RB- als auch der Alpha-Wert können innerhalb der ISIS-Software berechnet werden. Geringe Schwankungen im Widerstandssignal können auf subtile Bewegungen in der konfluenten Zellschicht oder Mikrobewegungen zurückzuführen sein. Sie können mit einem E-Array bei der empfindlichsten Frequenz gemessen und mittels schneller Fourier-Transformation innerhalb der EIS-Software analysiert werden, wodurch präzise Einblicke in das zelluläre Verhalten gewonnen werden können.

Beispielsweise ist es möglich, eine 250-Mikrometer-elektrische Wunde zu erzeugen, die innerhalb weniger Stunden schließt, um die Zellmigration zu untersuchen. Die Impedanzspektroskopie eignet sich ebenfalls gut zur Analyse des Einflusses hinzugefügter Substanzen. Wie bereits erwähnt, führt Thrombin durch Verringerung der basalen Zellspannung zu einer Hyperpermeabilität der Zellschicht; mit einem ARO-Kinase-Inhibitor könnte die Wirkung von Thrombin abgeschwächt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die ESIS äußerst empfindlich gegenüber Veränderungen im Zellumfeld wie Temperatur, pH, Mediumerschöpfung und dergleichen ist.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Ologie den Weg, um die Trends und Wirkungen vasogener Substanzen auf konfluente Zellkulturen in Echtzeit zu untersuchen.