Name: Einrichten eines Simple Light Noten Mikroskop für In Toto Imaging von C. elegans Entwicklung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Lernen Sie den Aufbau eines Lichtscheibenmikroskops für In-Toto-Bildgebung von C. elegans-Embryonen. Diese Methode ermöglicht schnellere Bildaufnahmen mit geringerer Phototoxizität als konfokale Mikroskopie.

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Wir danken allen Mitgliedern der Lenne und Bertrand Labors, insbesondere Olivier Blanc für Software-Entwicklung und Jérémie Capoulade zur Diskussion. Wir danken auch dem PICsL-IBDM Bild Anlage, insbesondere Claude Moretti und Brice Detailleur für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus ATIP CNRS (P.-FL und VB) unterstützt, die Labex INFORM Zuschuss (P.-FL und VB) und einen Zuschuss von Sanofi-Aventis (VB). Wir erkennen France-BioImaging Infrastruktur von der Agence Nationale de la Recherche unterstützt (ANR-10-InSb-04-01, als &quot;Investissements d&#39;Avenir&quot;).

1. Einrichten des Lichtblattes und der Erfassungspfad Abbildung 1 zeigt ein allgemeines Schema der optischen Aufbau. <ol><li> Platzieren und befestigen Sie das Mikroskop und die Laser auf dem optischen Tisch. </li><li> Kombinieren Laser 488 nm, 561 nm und 405 nm mit den entsprechenden dichroitischen Spiegeln. Nach der dichroitischen Spiegel haben die Laser genau miteinander ausgerichtet werden. Man beachte, dass die Auswahl der Laserwellenlängen, dichroitische Spiegel und optische Filter ist aus den Absorptionsspektren der bestimmten Fluoreszenzmarkierungen in den Experimenten verwendet wird, bestimmt. </li><li> Legen Sie die akustisch-optische Filter (AOTF). Verwenden Sie das Testblatt des Lieferanten, die Frequenz und die Macht des AOTF einzustellen. Wenn gut ausgerichtet ist, etwa 90% der Laserleistung bei einer maximalen Abstimmung, wie durch einen Leistungsmesser gemessen übertragen. Beachten Sie, dass einige Laser kann vollständig durch Software gesteuert werden, welche der AOTF unnötig machen könnte. </li><li> Zeigen und fixierendas Teleskop. Beachten Sie, dass das Teleskop aus zwei Linsen, die den Strahl auf eine Breite gleich oder größer als der Durchmesser des hinteren Apertur des Beleuchtungsobjektivlinse zusammen erweitern. Das Objektiv mit der kleinsten Brennweite zuerst kommen sollte. </li><li> Platz, ausrichten und das Sehrohr nach oben bringen den optischen Weg näher an der Rückseite Öffnung der zylindrischen Linse. Beachten Sie, dass die beiden Spiegel des Periskop in einer Weise, dass ihre lange Achse wird mit auf die Neigung des Spiegels, um den vollständig expandierten Strahl zu reflektieren montiert. </li><li> Setzen Sie die Zylinderlinse neben dem Periskop Ausgang. Beachten Sie, dass die Zylinderlinse fokussiert den Strahl in eine Richtung und lässt sie kollimiert in der anderen Richtung, wodurch ein leichtes Blatt bildet. </li><li> Neuausrichtung der resultierende Lichtbogen mit Hilfe der Beleuchtung Objektiv. Beachten Sie, dass der Bildbrennpunkt des Beleuchtungsziel sollte mit dem Gegenstandsbrennpunkt des Erfassungsziel übereinstimmen. Projizieren Sie den Strahlauf einem Bildschirm (beispielsweise einer Mauer) in einem großen Abstand. Bewegen Sie die Beleuchtungsobjektivs entlang der Strahlachse Beleuchtung auf den Bildschirm scharfen Konturen des Lichtblattes erhalten. </li><li> Legen Sie die Quad-Linie (405/488/561/638) Emissionsfilter in dem Ort, an dem Mikroskop (Würfel) reserviert. </li><li> Legen Sie die EMCCD Kamera am Mikroskop Ausgang. </li><li> Befestigen Sie die erste manuelle Übersetzung der Bühne auf dem Mikroskoptisch durch Schrauben in Löchern in den Mikroskoptisch gebohrt. Beachten Sie, dass der Rand der Übersetzungsstufe bei etwa 2 cm von der Mitte des Mikroskoptisches positioniert werden, so daß die Küvette unter der Nachweisobjektivlinse zentriert. </li><li> Befestigen Sie die zweite manuelle Übersetzung Bühne, auf der ersten. Die Richtungen der beiden Stufen müssen senkrecht (X-und Y-Übersetzungen) sein. </li><li> Befestigen Sie den Z-Piezotisch an der Spitze der beiden vorherigen Stufen. Beachten Sie, dass eine motorisierte Stufe kann anstelle des piezoelektrischen Bühne verwendet werden. </li><li> Befestigen Sie die Küvette holder (siehe Abbildung 2) an der Spitze der Stufen. Die Küvette wird somit an der Kreuzung der Beleuchtungspfad und dem Erfassungspfad, die senkrecht zueinander sind, platziert werden. </li></ol> 2. Überprüfung des Lichtblattes <ol><li> Füllen einer Glasküvette mit Fluoreszenzlösung, und auf dem Probenhalter an dem Schnittpunkt der beiden optischen Wege. Der Lichtbogen ist somit sichtbar. Es hat horizontal ist, und symmetrisch / zentriert in Bezug auf die Detektionsobjektivlinse. </li><li> Entfernen Sie die Zylinderlinse und erwerben Sie ein Bild, um die Dicke des Lichtblattes messen. Beachten Sie, dass die Dicke der Lichttafel hängt von der numerischen Apertur (NA) der Beleuchtungsobjektivlinse (etwa 3-4 &amp;mgr; m für NA = 0,3). Beachten Sie, dass für eine gegebene Linse kann die Dicke der Licht-Folie durch die Verringerung der Größe des Strahls in die hintere Apertur mit einem Schlitz erhöht werden. Beachten Sie, dass fluoreszierende Mikrosphären können verwendet werden, um die Axt zu messenial und lateralen Auflösung des Mikroskops. </li><li> Setzen Sie die Zylinderlinse vor dem Start des Experiments. </li></ol> 3. Die Montage C. elegans Embryonen Die folgenden Schritte sind in Fig. 3 dargestellt. <ol><li> Verwenden eines diamantMarkierungsStift, um ein Stück einer Glasplatte von 10 x 20 x 1 mm geschnitten. </li><li> Bereiten Sie 5% Bacto-Agar in Wasser kochen und pflegen sie in einem Heizblock bei 60 ° C </li><li> Dann werden 50 &amp;mgr; l Poly-L-Lysin auf einer Seite des Zuschnittes von Folie trocknen lassen. </li><li> Legen Sie ein Mikroskop-Objektträger auf der Bank und zu beheben. </li><li> Juxtapose den Schnitt Stück Folie mit dem festen Rutsche und einen Tropfen geschmolzenen Agar auf der Oberseite. Drücken Sie die Agar mit einem anderen sauberen Objektträger, um eine dünne Agar-Pad erhalten. </li><li> Lassen Sie die Agar-Pad, um vor dem Entfernen der Oberschlitten trocknen. </li><li> Schneiden Sie die Agar-Pad auf der Seite der festen Folie, um einen Überschuss von etwa 3 mm o verlassenf-Agar und entfernen sanft die feste Folie. </li><li> In 50 ul von Poly-L-Lysin auf dem Agar und lassen Sie es vollständig trocknen. </li><li> Setzen trächtige Würmer in M9-Medium in einem Uhrglas. </li><li> Schneiden die Würmer auf der Ebene der Vulva mit einem Skalpell, um die Embryonen zu lösen. </li><li> Unter einem Fernglas erkennen Sie die Embryonen im Stadium von Interesse und sammeln Sie sie mit Hilfe eines Mikrokapillar Pipette. </li><li> Zeigen die Embryonen auf dem Teil des Agars mit Poly-L-Lysin, das von dem Schnittstück des Schiebers ragt beschichtet. Legen Sie die Embryonen nur an der Grenze der Folie. Die Embryonen auf dem Rand des Agar positionieren nicht, weil sie nicht stabil genug. Entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit, so dass die Embryonen werden auf der Poly-L-Lysin-Schicht-Stick. </li><li> Schnell richten Sie die Embryonen, um ein Austrocknen zu vermeiden. </li><li> Setzen Sie den Schnitt Folie in einer Petrischale aus Kunststoff und sanft hinzufügen M9-Medium, um die Folie zu bedecken. </li><li> Überprüfen unter einem Binokular, dass die Eier noch auf den Agar fest. </li&gt; </ol> 4. Aufnahme von C. elegans Entwicklung <ol><li> Befestigen Sie die vorherige Vorbereitung (Schnitt Rutsche, Agar-Agar und Embryonen) in den Probenhalter und legen Sie sie in eine Küvette. Abbildung 4 beschreibt die hausgemachten Halter und Abbildung 5 zeigt eine Ansicht der Küvette in Beobachtung Kontext. </li><li> Befestigen Sie die Küvette auf dem piezoelektrischen Bühne. </li><li> Ermitteln Sie die Position der Embryonen mit Hellfeldbeleuchtung. </li><li> Starten Sie das hausgemachte Software-Steuerung der AOTF, die Kamera und den piezoelektrischen Bühne. Beachten Sie, dass eine freie Software, wie z. B. Mikromanager, können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Wählen Sie die Laserlinie und Leistung (AOTF). </li><li> Stellen Sie die Position des Lichtblattes mit der Stufe 3 Richtungen Unterstützung der Zylinderlinse und der Beleuchtungslinse. Bewegen der Plattform entlang der seitlichen Richtung (X), um die hellste Signal zu erhalten. Stellen Sie dann die Z-Position des Lichtblattes und die Längsposition (Y), um th erhaltene beste Signal-Rausch-Verhältnis. Beachten Sie, dass die Position des Lichtblattes Fokus muss möglicherweise von einem Embryo zu einem anderen eingestellt werden, um Unterschiede in der Lichtpfadlängen zu korrigieren. </li><li> Zeitraffer-Bilder zu erwerben, wählen Sie die Belichtungszeit, zu gewinnen, Zeit zwischen zwei Bildern, als auch die Anzahl der Bilder, die erworben werden sollen, und die Laserleistung. Für zwei Farberfassung, wählen Sie eine zweite Laserlinie. Zwei Farbbilder werden nacheinander erworben. </li><li> Um az-Stack zu erwerben, wählen Sie auch den Abstand zwischen den zwei Scheiben, und die Anfangs-und Endposition des piezoelektrischen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Einstellung der Lichtbogen-Mikroskopie in vivo-Bildgebung von C. elegans Embryonen. Die optischen Elemente, die zum Erstellen und richten Sie den Lichtbogen, darunter Laser, Strahlaufweitung, Bündelung und Fokussierung Linsen, kann leicht auf einer optischen Bank montiert werden. In Kombination mit einem aufrechten Mikroskop für die Detektionspfad und der Kamera bietet dies eine einfache Lösung für das Einrichten eines Lichtschnittmikroskop. Diese Geometrie macht die Probenumgebung einfach. Die lebende Probe wird in eine Glasküvette, die gehalten wird, angeordnet und durch eine begrenzte Anzahl von mechanischen Teilen verschoben angeordnet ist. Als Blattbeleuchtung Mikroskopie ist ein weites Feld Technik mit Auftrennung wird nur ein einziges motorisierte Achsen-Bewegung für die 3D-Bildgebung erforderlich. Dies begrenzt das Erfordernis der Synchronisation auf einen einzigen Scanelement und erleichtert die Software-Entwicklung. Im Vergleich zu unseren ISPIM 6 aufrecht geory ermöglicht die Verwendung von hohen NA Objektiv für die Erkennung. Im Vergleich zu SPIM Aufbauten mit Objektivlinsen in der horizontalen Ebene die Befestigung der Probe und der Abbildungs ​​einer Reihe von Embryonen zu erleichtern. Insgesamt ist die Implementierung dieser Technik einfach und kann mit wenig Erfahrung in der Optik erreicht werden. Dies ist eine günstige Alternative zum konfokalen Mikroskopen mit den Vorteilen einer höheren Geschwindigkeit und geringere Phototoxizität, aber Nachteil einer geringeren axialen Auflösung. Wir haben auch eine einfache und reproduzierbare Weise, C. Halterung entwickelt elegans Embryonen für die in vivo-Bildgebung unter Verwendung dieses Systems. Der Montagevorgang ist schnell (15 min) und ist geeignet für den täglichen Experimenten. Für C. elegans-Bildgebung, die Vorteile dieser einfachen Aufbau sind mindestens zwei Falten (i) in toto Abbildungs ​​möglich ist, ohne Drehung und damit die 3D-Rekonstruktion ist einfach; (Ii) Probe Montage ist einfach und mehrere Embryonen nacheinander abgebildet werdenauf derselben Folie. Wir zeigten Beispiele von Zeitraffer-Filmen mit ausreichender zeitlicher Auflösung zu Zellteilungen und Zellformänderungen zu beobachten. Die Macht der Lichtbogen-Mikroskopie zu untersuchen C. elegans Entwicklung wurde auch kürzlich von anderen 6, 7, 8 dargestellt. Daher wird diese Technik sehr nützlich, um die Morphogenese und Strukturieren der Studie C. elegans Embryo. Kann dieses System auch verwendet werden, um die Entwicklung von anderen Modellorganismen analysieren? Es ist wichtig zu erkennen, dass die Umsetzung der Blattbeleuchtung Mikroskopie für kleine und transparent Organismus wie C. elegans ist weniger streng als für größere Organismen wie Drosophila-Embryonen. In toto Bildgebung von Drosophila erfordert in der Regel Rotation und Multi-View-Rekonstruktionen 9, 10. Anregung von zwei Seiten mit kollineare Anregung Objektive können auch reduzierte die Schatteneffekte durch die Dämpfungs verursachtIon des Lichts 11. Dennoch ist das Setup hier vorge noch Bild einer Seite der Drosophila-Embryonen angepasst, mit geringem Bleichen und niedrigen photoxicity. Diese Einrichtung könnte auch hilfreich, wenn Bilder klein und transparent Embryonen wie Seescheiden oder Zebrafisch sein.

Die Ausbildung und Formgebung des Organismus beinhaltet Zellbewegungen, Änderungen der Zellform, der Zellteilung und Zelldifferenzierung. Das Verständnis der Progression und Koordination dieser Prozesse erfordern schnelle Imaging-Tools mit drei Dimensionen Fähigkeit und subzellulärer Auflösung. Zu den Techniken, mit diesen in-vivo-Imaging-Funktionen, Lichtblatt-Beleuchtung Mikroskopie auch als Einzel / selektiven Plane Illumination Mikroskopie hat den einzigartigen Vorteil der Herstellung von Low-phototoxische Effekte und Low-Photobleaching 1,2. In Blatt Beleuchtung Mikroskopie wird die Probe von der Seite durch einen Lichtbogen, der die optische Schnitte führt beleuchtet. Der Beleuchtungspfad und der Detektionspfad sind senkrecht zueinander und der Lichtbogen wird ausgerichtet, um mit der Objektbrennebene der Objektivlinse Detektion zusammenfallen. Die Probe wird an dem Schnittpunkt der beiden Pfade angeordnet ist, einnd entlang der Erfassungsachse bewegt werden, um 3D-Bildgebung zu ermöglichen. Nur die interessierende Ebene beleuchtet wird und alle Punkte dieser Fläche werden gleichzeitig erfasst. Dies erhöht die Aufnahmegeschwindigkeit und verringert Photobleichen sowie Phototoxizität im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie 3. Praktisch ist Blatt Beleuchtung Mikroskopie einfach zu installieren und align: für zweidimensionale Bildgebung notwendig weder für den Erfassungsteil, noch für die Beleuchtungsteil ist kein Scannen; als Weitfeldtechnik mit Auftrennung kann die dreidimensionale Bildgebung durch eine einzige Achse der Bewegung des Bühnen Halten der Probe erhalten werden. Hier präsentieren wir die Einrichtung eines einfachen Lichtmikroskop Blatt und seine Umsetzung in toto Bildgebung von C. elegans Embryonen. C elegans Embryonen sind gut geeignet, um in vivo ima lebenGing aufgrund ihrer Transparenz, invariant Abstammung und stereotype Zelle positioniert 4,5. Das entwickelte Lichtblatt-Setup basiert auf einem Standard aufrechten Mikroskop zur Erkennung basiert. Die nachstehende Protokoll beschreibt, wie zu bauen und richten Sie die Anregung Modul / Pfad, zu testen und zu charakterisieren den Lichtbogen und montieren Sie die Probe für die 3D-Bildgebung. Es bietet auch Beispiele für mit dem Setup auf verschiedenen Stämmen, fluoreszierende Marker erworben Zeitraffer-Filme.

<table><tbody><tr><td>SPIM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Detektion</td></tr><tr><td>aufrechtes Mikroskop</td><td>ZEISS</td><td>Axiophot 1</td><td></td></tr><tr><td>100x W Objektiv (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&nbsp;</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD rückwärtig beleuchtet</td><td>ANDOR</td><td>DU-885K-CS0-#VP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Beleuchtung</td></tr><tr><td>LASER 488 nm / 60 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam smart</td><td></td></tr><tr><td>LASER 405 nm / 120 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam smart</td><td></td></tr><tr><td>LASER 561 nm / 500 mW</td><td>COBOLT</td><td>JIVE 500</td><td>&nbsp; für Zeitrafferaufnahmen sind 50 oder 100mW</td></tr><tr><td>ausreichend Filter Quad-Linien-Laserabweisungsband ZET 405/488/561/638</td><td>AHF</td><td>F57-405</td><td></td></tr><tr><td>Dichroitisch 405</td><td>AHF</td><td>F38-405</td><td></td></tr><tr><td>Dichroitisch 488</td><td>SEMROCK</td><td>Di01-R488</td><td></td></tr><tr><td>AOTF</td><td>AA</td><td>AOTFnC-400.650-TN</td><td></td></tr><tr><td>Spiegellinse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mm</td><td>THORLABS</td><td></td><td>Teleskop 5X</td></tr><tr><td>Objektiv 200 mm</td><td>THORLABS</td><td></td><td>Teleskop 5X</td></tr><tr><td>Periskop</td><td>THORLABS</td><td>RS99/M</td><td></td></tr><tr><td>Zylinderlinse f=100mm</td><td>THORLABS</td><td>ACY254-100-A</td><td></td></tr><tr><td>10X NA 0,3</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xyz Tisch</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Probe</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Bectkton Dickinson</td><td>214010</td><td>5% in Wasser</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin-Lösung&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Kapillaren GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td><td>Havard Appartus</td><td>30-0019</td><td></td></tr><tr><td>Aspirationsrohr (Mundpipette)</td><td>Dutsher</td><td>55005</td><td></td></tr><tr><td>M9 medium:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (3g/L)</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (6g/L)</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCL (5g/L)</td><td>Jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (1 mM endgültig)</td><td>Jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Küvettenhalter</td><td>HOME MADE</td><td></td><td>made by Brice Detailleur&nbsp;</td></tr><tr><td>Probenhalter</td><td>HOME MADE</td><td></td><td>von Claude Moretti&nbsp;</td></tr><tr><td>x Tisch</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 50x20x1 mm</td><td>MARIENFELD</td><td></td><td>geschnitten dann in 10x20x1mm</td></tr><tr><td>piezoelektrischer Tisch mit Verstärker/Controller</td><td>PI</td><td>P-622. ZCD / E-625.CR</td><td></td></tr><tr><td>Küvette 40mmx40mmx10mm</td><td>HELLMA</td><td>704.002-OG.40 mm- 10mm hoch</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Point Glasmarkierstift</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>C++ (Qt) hausgemachte Software</td><td></td><td></td><td>, entwickelt von Olivier Blanc und Claire Chard&egrave; s, auf Anfrage erhältlich. Alternative Lösungen: Mikromanager oder Labview&nbsp;</td></tr></tbody></table>

einrichten eines simple light noten mikroskop für<em&gt; in toto</em&gt; imaging von<em&gt; c. elegans</em&gt; entwicklung

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Schnelle und phototoxische bildgebenden Verfahren sind Voraussetzung, um die Entwicklung von Organismen in toto zu studieren. Lichtbogen basiert Mikroskopie reduziert Fotobleichen und phototoxische Effekte im Vergleich zu der konfokalen Mikroskopie und bietet 3D-Bilder mit subzellulärer Auflösung. Hier stellen wir den Aufbau einer Lichtschnittmikroskop basiert, die von einem aufrechten Mikroskop und einen kleinen Satz von opto-mechanischen Elementen für die Erzeugung des Lichtblattes zusammengesetzt ist. Das Protokoll beschreibt, wie zu bauen, richten Sie das Mikroskop und prägen das Lichtblatt. Außerdem enthält es, wie die Methode in toto Abbildung C zu implementieren elegans Embryonen mit Hilfe eines einfachen Beobachtungskammer. Das Verfahren ermöglicht die Erfassung von 3D-Zwei-Farben Zeitraffer-Filme über einige Stunden der Entwicklung. Dies sollte die Verfolgung der Zellform, Zellbereiche und markierte Proteine ​​über lange Zeiträume zu erleichtern.

Drei 3D Zeitrafferaufnahme aus drei verschiedenen Experimenten C. elegans-Stämmen veranschaulichen die Art von Daten, die unter Verwendung des oben beschriebenen Lichtschnittmikroskopaufbau erhalten werden können. Wir überprüften, dass unter diesen Bedingungen die Embryonen entwickeln, mit normaler Geschwindigkeit und überleben die Bildgebung, im Einklang mit früheren Berichten darauf hinweist, dass SPIM Bildgebung verursacht nur geringe Phototoxizität Ebenen in C. elegans Embryonen 6,7. Der erste Stamm drückt eine Histon-GFP (zuIs178; stIs10024) fusioniert. Aufzeichnung wurde während 2 Stunden unter einem Stapel von Scheiben 20 (Abstand zwischen den Schichten 1 um) genommen jede 37 s durchgeführt. Fig. 6 veranschaulicht eine Ebene des Stapels zu verschiedenen Zeitpunkten. Beide interphasic Kerne (Pfeil) und kondensierte mitotischen Chromatin (Pfeilspitze) sind deutlich sichtbar. Der zweite Stamm drückt eine Tubulin-GFP (ruIs57) fusioniert und ein Histonzu mCherry (; stIs10226 itIs37) fusioniert. Aufzeichnung wurde während 16 min mit einem Stapel von Scheiben 20 (Abstand zwischen den Schichten 1 um) genommen jede 105 sec durchgeführt. Fig. 7 zeigt verschiedene Ebenen des Stapels und zu verschiedenen Zeitpunkten. Der zugehörige Film 1 zeigt 3D-Rekonstruktionen in 3 aufeinander folgenden Zeitpunkten. Während der Teilung der mitotischen Spindel (grün) und kondensierte Chromosomen (rot) sind deutlich sichtbar so dass die Verfolgung der Zellteilung Orientierungen während der Entwicklung. Der dritte Stamm drückt die Apolipoprotein VIT-2 bis GFP (pwIs23) fusioniert und eine Membran gebunden mCherry (ltIs44). Aufzeichnung wurde während 25 min mit einem Stapel von Scheiben 10 (Abstand zwischen den Schichten 1 um) genommen alle 30 Sekunden durchgeführt. Fig. 8 zeigt verschiedene Ebenen des Stapels und zu verschiedenen Zeitpunkten. Die schnellen Bewegungen der Eigelb-Lipoprotein-Partikel (grün) innerhalb der Zellen können leichtgefolgt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1: SPIM optische Einrichtung der Beleuchtungs-und Detektionseinheiten, Vorder-und Unteransichten zusammen. In der Beleuchtungseinheit, die Laser kombiniert durch die dichroitischen Spiegel in das AOTF, die die Leistung jedes Lasers unabhängig steuert. Dann erhöht das Teleskop die Größe des Strahls durch 4-fach und das Periskop bringt es auf die Höhe des Mikroskops. Die Zylinderlinse bildet den Lichtbogen, die durch die Beleuchtung Ziel neu ausgerichtet wird. Die Erfassungseinheit in der aufrechten Mikroskop integriert und wird hauptsächlich durch die Erfassungslinse, die Filter, die Tubuslinse und EMCCD besteht. Die Probe wird an dem Schnittpunkt zwischen der Beleuchtungs-und Detektionswegen angeordnet. Ein piezoelektrischer Phase ermöglicht vertikale (Z) Verschiebungen der Probefür 3D-Akquisition. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2:. Küvettenhalter Der Halter besteht aus 3 Aluminium-Platten und auf dem piezoelektrischen Stufe eingeschraubt. Die Glasküvette wird durch eine Feder (in rot) gehalten. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3: Montage der C-Protokoll elegans Embryonen für SPIM Experimenten. Ein Schnittstück aus Glas mit Poly-L-Lysin beschichtet ist. Ein Kissen aus Agar auf der beschichteten Oberfläche positioniert. Poly-L-Lysin wird dann auf die Agar-Pad aufgenommen. Schließlich C. elegans Embryonen werden auf der Poly-L-Lysin beschichteten Agar Kissen ausgerichtet sind. Abbildung 4: Probenhalter. Die Halterung passt in die Innenmaße der Glasküvette. Zwei Federn (in rot) halten den Glasobjektträger (in Abbildung 3 beschrieben). Diese Halterung wird dann im Inneren des Glas Küvette setzen. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> Figur 5:... Probenhalter in der Beobachtungs Zusammenhang Embryonen werden auf dem Objektträger nach dem Protokoll fasste in Fig. 3 immobilisiert wird der Schieber durch die in Fig. 4 beschriebenen Probenhalter gehaltenen Probenhalter in der Glasküvette eingesetzt, durch die in Fig. 2 beschriebene Halter gehalten. Lichtblattes horizontal und illuminates die Embryonen von der Seite. Die Detektionsobjektivlinse vertikal über der Probe. <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6: Aufnahme eines C. elegans Embryo eine Histon :: GFP-Fusionsebene ausdrückt Einzelbilder eines transgenen Embryos Expression eines Histon :: GFP-Fusions (zuIs178; stIs10024) zu verschiedenen Zeitpunkten aus einem 3D-Bilder Zeitraffer-Aufnahme extrahiert:.. Stapel von 20 Scheiben (gemacht Abstand zwischen den Schichten 1 m); Belichtungszeit pro Stück: 30 ms; Zeitintervall zwischen den Stapeln: 37 sec; Gesamterfassungszeit: 2 Stunden. Pfeil: interphasic Kern, Pfeilspitze: mitotischen Chromatin kondensiert. Bei t = 0 min der Embryo im 2-Zellen-Stadium und bei t = 120 min der Embryo wie unter normalen Entwicklungs s erwartet enthält etwa 70 Zellengepinkelt (beachten Sie, dass nur die in einer einzigen Ebene enthaltenen Zellen sichtbar sind in den Bildern und nicht alle Zellen des Embryos). Die Macht der Beleuchtung war 30 uW bei 488 nm (gemessen am Ausgang des Beleuchtungsziel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen.</a> <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> Abbildung 7: Aufnahme eines C. elegans Embryo eine Tubulin :: GFP-Fusions ausdrücken und ein Histon :: mCherry Fusion. Bilder aus einem 3D Zeitrafferaufnahme eines C extrahiert elegans Embryo eine Tubulin :: GFP-Fusions (ruIs57) und einen Histone :: mCherry Fusion (itIs37; stIs10226) ausdrückt. Aufnahmebedingungen: Übernahme von einem Stapel von 20 Scheiben (Abstand zwischen Scheiben einum) alle 105 sec; Gesamtaufnahmezeit: 16 min; Belichtungszeit: 200 ms für jeden Kanal. Feld A zeigt die 10 Scheiben des gleichen Stapels. Panel B zeigt die gleichen Scheibe alle 210 Sekunden. Die Macht der Beleuchtung war 30 uW und 300 uW, für 488 und 561 nm Laser, bzw. (gemessen am Ausgang des Beleuchtungsziel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen.</a> <img alt="Fig. 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> Abbildung 8: Aufnahme eines C. elegans Embryo ein VIT-2 :: GFP-Fusions ausdrücken und ein Membran-bezogene mCherry. Bilder aus einem 3D Zeitrafferaufnahme eines C extrahiert elegans Embryo Ausdruck einer VIT-2 :: GFP-Fusions (PWIs23) und ein Membran-bezogene mCherry (ltIs44). Aufnahmebedingungen: Übernahme von einem Stapel von 10 Scheiben (Abstand zwischen Scheiben 1 m) alle 30 sec; Gesamtaufnahmezeit: 25 min; Belichtungszeit pro Kanal: 200 msec. Tafel A zeigt die ersten 5 Schnitte des gleichen Stapels. Panel B zeigt die gleichen Scheibe jede 30sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines Lichtschnittmikroskop und dessen Umsetzung zur in vivo Bildgebung von C. elegans Embryonen.

Einrichten eines Simple Light Noten Mikroskop für<em&gt; In Toto</em&gt; Imaging von<em&gt; C. elegans</em&gt; Entwicklung

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Entwicklung von C Allergan mittels fluoreszenzbasierter Lichtscheibenmikroskopie abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst ein auf einer aufrechten Mikroskopanordnung basierendes Lichtscheibenmikroskop mit einem kleinen Satz optomechanischer Elemente zur Erzeugung einer Lichtscheibe aufgebaut wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht im Einbetten des Embryos.Die letzten Schritte bestehen darin, den Lichtschnitt auf das Embryo einzustellen und dessen Entwicklung aufzuzeichnen. Die Ergebnisse können die Dynamik fluoreszenzmarkierter Proteine während der Entwicklung von CL egan durch die Analyse von 3D- und Zeitraffer-Videos zeigen. Der Hauptvorteil der Lichtschnittmikroskopie gegenüber anderen etablierten Methoden, wie der konfokalen Mikroskopie, liegt darin, dass sie eine schnellere Bildgebung bei geringerer Phototoxizität ermöglicht.Drittens kann diese Methode Einblicke in die Dichtung gegen die Entwicklung liefern. Sie kann auch auf andere Systeme wie Roil oder Zebrafisch angewendet werden. Die Durchführung des Verfahrens wird klar sein.Shales, ein Ingenieur aus meinem Labor, und Pauline Linac, eine Ingenieurin aus dem Labor von van. Dieser Abschnitt beschreibt den Aufbau der Montage, der für alle Experimente zusammengelassen werden kann. Sobald die Laser, Filter, das Teleskop und das Periskop alle auf dem optischen Tisch positioniert wurden, befestigen Sie die zylindrische Linse, um die Lichtscheibe zu erzeugen.Ein anderes Objektiv wird auf den Fokus eingestellt. Der Brennpunkt des Beleuchtungsobjektivs sollte mit dem Objektbrennpunkt des Detektionsobjektivs zusammenfallen. Projizieren Sie nun den Strahl auf die Wand oder einen Schirm und bewegen Sie das Beleuchtungsobjektiv entlang der Strahlachse, bis die Konturen der Projektion scharf sind.Verwenden Sie einen Vierfach-Linienemissionsfilter und eine E-M-CCD-Kamera in der Mikroskopanordnung. Befestigen Sie die zweite manuelle Translationsstufe senkrecht an der ersten. Schrauben Sie die Montage auf die vorhandene Mikroskopbühne.Nachdem Sie das zylindrische Linsen-Beleuchtungsobjektiv entfernt haben, positionieren Sie die Baugruppe am Mikroskop und setzen Sie das Beleuchtungsset wieder auf die Stufen. Befestigen Sie den qve-Halter am senkrechten Schnittpunkt des Beleuchtungspfads und des Detektionspfads. Überprüfen Sie nun den Lichtschnitt.Füllen Sie ein Glasgefäß mit Fluorescein-Lösung und stellen Sie es in den Halter auf den Stufen. Das Lichtblatt sollte sichtbar sein. Es sollte horizontal und bezüglich der Detektionsobjektivlinse zentriert sein.Entfernen Sie als Nächstes die zylindrische Linse. Optimieren Sie die Lichtschicht durch eine 3D-Translation des Beleuchtungsobjektivs und nehmen Sie ein Bild auf, um die Dicke der Lichtschicht zu messen. Dies hängt von der Apertur des Objektivs ab.Danach sollte die zylindrische Linse ersetzt werden. Schneiden Sie zunächst ein Stück Glas mit einer Dicke von einem Millimeter und den Abmessungen zehn Millimeter mal zwanzig Millimeter zu. Verwenden Sie einen Diamantzeichner.Fügen Sie anschließend 20 Mikroliter Poly-L-Lysin auf einer Seite hinzu und setzen Sie, sobald es trocken ist, einen zweiten Objektträger direkt daneben. Fügen Sie an einer festen Position einen Tropfen 5 % Agar hinzu und glätten Sie ihn mit dem Gewicht eines dritten Objektträgers, der darauf platziert wird. Nachdem der Agar getrocknet ist, entfernen Sie den dritten Objektträger und schneiden Sie das Agar-Präparat drei Millimeter vom Rand der beiden verbleibenden Objektträger über dem Objektträger ohne Poly-L-Lysin ab.Entfernen Sie dann den fixierten Objektträger, sodass ein Überstand aus Agar übrig bleibt. Beschichten Sie den Agar mit 20 Mikrolitern Poly-L-Lysin und lassen Sie ihn trocknen. Geben Sie nun GR-Würmer in eine Uhrglaschale, die mit M-9-Medium unter einem Stereomikroskop gefüllt ist.Schneiden Sie die Würmer mit einem Skalpell auf Höhe der Vulva durch, um so die Eier freizusetzen. Identifizieren Sie anschließend die Embryonen im gewünschten Entwicklungsstadium und sammeln Sie diese mit einer Mikrokappillarpipette. Überführen Sie die Embryonen auf das Agar-Überstandsstück außerhalb des vorbereiteten Objektträgers direkt neben der Kante des Objektträgers, jedoch nicht auf die Grenze des Agars. Dann richten Sie die Embryonen mit einer Mikrokapi­llarpipette aus, während Sie die Flüssigkeit entfernen. Durch Aspiration haften die Embryonen an der Polyol-Lysin-Beschichtung. Es ist sehr wichtig, die Embryonen korrekt zu positionieren, um eine gute Aufnahme zu erzielen, und dies erfordert eine Kapillare mit der richtigen Öffnungsweite.Falls der Durchmesser zu klein ist, wird es schwierig sein, die Embryonen freizusetzen. Falls er zu groß ist, wird es schwierig sein, den austretenden Fluss straff zu kontrollieren und die Embryonen auszurichten. Bedecken Sie den Objektträger in einer Petrischale mit M9-Medium und überprüfen Sie mithilfe einer Vergrößerung, ob die Embryonen noch am Agar haften. Befestigen Sie nun den vorbereiteten Objektträger mit den Embryonen am Probenträger, der in ein Vete passt.Der Halter ist eine hausinterne Konstruktion, die darauf ausgelegt ist, an einen Vete anzupassen. Befestigen Sie anschließend den Vete an einer piezoelektrischen Stufe und lokalisieren Sie unter Hellfeldbeleuchtung ein Embryo. Starten Sie nun die Software, die das akusto-optische abstimmbare Gerät steuert.Filtern Sie die Kamera und die Bühne. Diese Software wurde intern entwickelt, aber auch die kostenlose Software Micromanager kann verwendet werden. Wählen Sie zunächst die Laserlinie aus.Danach justieren Sie den Objekttisch entlang der X-Achse, bis das Lichtblatt seine maximale Helligkeit erreicht hat. Anschließend stellen Sie die beiden anderen Dimensionen, Y und Z, so ein, dass das Signal-Rausch-Verhältnis optimal ist. Dieser Schritt muss möglicherweise für jedes Embryo wiederholt werden.Dieser Schlüssel dient dazu, das Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren, um eine gute Aufnahme durch Verschieben eines freien Ständers, Unterstützung der Objektivposition und Eliminierung des Objektivs im Hinblick auf die gewünschte Beziehung zu erhalten, um eine kontinuierliche Simulation des Embryos und den besten Kontrast zu erzielen. Erwerben Sie nun zeitlich aufgelöste Bilder, indem Sie die Laserleistung, Belichtungszeit, Verstärkung und Bildaufnahmefrequenz entsprechend dem Fluoreszenzniveau des Embryos und der Geschwindigkeit des analysierten biologischen Prozesses einstellen. Für Zack.Die Bildgebung legte den Abstand zwischen den Schichten sowie deren Start- und Endpositionen bei c elgan fest, das ein Histon-GFP-Konstrukt exprimierte. Es wurde eine Zeitrafferaufnahme über zwei Stunden durchgeführt, wobei alle 37 Sekunden 20 Schichtstapel aufgenommen wurden. Zellteilungen waren bei einem Stamm deutlich sichtbar, der Tubulin, das mit GFP fusioniert war, sowie Histon, das mit mCherry fusioniert war, exprimierte. Die Aufnahmen wurden alle 105 Sekunden über 16 Minuten durchgeführt.3D-Darstellungen werden zu drei Zeitpunkten gezeigt. Die mitotischen Spindeln und die kondensierten Chromosomen sind deutlich sichtbar und können leicht über Zellteilungen hinweg verfolgt werden. Bei einem dritten Stamm wurde das an GFP fusionierte APO-Lipoprotein vit zwei zusammen mit der Markierung der Zellmembran durch mCherry abgebildet.Über einen Zeitraum von 13 Minuten wurden alle 27 Sekunden 10 Schnittstapel aufgenommen. Schnell bewegte Lipoproteine ließen sich leicht verfolgen. Hier nutzen wir die Lichtscheibe, die mithilfe komplexerer Methoden erzeugt wird.Mittels des Lichtschnitts könnte die räumliche Auflösung weiter verbessert werden.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Dieser Artikel beschreibt eine Technik zur Visualisierung der frühen Ereignisse der Embryogenese in den...

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Die transparente C. Elegans Darm kann als eine"in-Vivo Gewebe Kammer" für das Studium Apicobasal Membran und Lumen Biogenese einzellige und subzellulärer Ebene bei mehrzelligen Tubulogenesis dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Standardbeschriftung kombinieren, Verlust der Funktion genetische/RNAi und mikroskopische Ansätze, diese Prozesse auf molekularer Ebene zu zergliedern.

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