Einrichten eines Simple Light Noten Mikroskop für In Toto Imaging von C. elegans Entwicklung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Entwicklung von C Allergan mit Hilfe der Fluoreszenzlichtblattmikroskopie abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst das auf Lichtblättern basierende Mikroskop eingerichtet wird, das aus einem aufrechten Mikroskop und einem kleinen Satz optomechanischer Elemente besteht, um ein Lichtblatt zu erzeugen. Der zweite Schritt des Eingriffs besteht darin, den Embryo zu besteigen.

Der letzte Schritt besteht darin, das Lichtblatt auf den Embryo zu setzen und seine Entwicklung zu dokumentieren. Die Ergebnisse können die Dynamik von fluoreszenzmarkierten Proteinen während der Entwicklung von CL egan durch die Analyse von 3D- und Zeitraffervideos zeigen. Der Hauptvorteil der Lightship-Mikroskopie gegenüber anderen bestehenden Methoden, wie z. B. der konfokalen Mikroskopie, besteht darin, dass sie eine schnellere Bildgebung mit geringerer Phototoxizität ermöglicht.

Drittens kann diese Methode einen Einblick in die Abdichtung gegen Entwicklung geben. Es kann auch auf andere Systeme wie Roil oder Zebrafisch angewendet werden. Die Demonstration des Verfahrens wird klar sein.

Shales, ein Ingenieur aus meinem Labor und Pauline Linac, eine Ingenieurin aus dem Labor von van. In diesem Abschnitt wird die Setup-Baugruppe beschrieben, die für alle Experimente zusammengebaut bleiben kann. Sobald die Laser, Filter, das Teleskop und das Periskop alle auf dem optischen Tisch positioniert sind, befestigen Sie die zylindrische Linse, um das Lichtblatt zu erzeugen.

Für die Fokussierung ist ein anderes Objektiv eingestellt. Der Brennpunkt des Beleuchtungsobjektivs sollte mit dem Objektbrennpunkt des Detektionsobjektivs übereinstimmen. Projizieren Sie nun den Strahl auf die Wand oder Leinwand und bewegen Sie das Beleuchtungsobjektiv entlang der Strahlachse, bis die Konturen der Projektion scharf sind.

Integrieren Sie einen Quad-Line-Emissionsfilter und eine E-M-C-C-D-Kamera in das Mikroskop-Setup. Befestigen Sie die zweite manuelle Übersetzungsstufe senkrecht mit der ersten. Schrauben Sie die Baugruppe an den vorhandenen Mikroskoptisch.

Nachdem Sie das eingestellte Zylinderlinsenbeleuchtungsobjektiv entfernt haben, positionieren Sie die Baugruppe auf dem Mikroskop und setzen Sie das Beleuchtungsset wieder auf die Tische ein. Befestigen Sie den qve-Halter am senkrechten Schnittpunkt des Beleuchtungspfades und des Erfassungspfades. Überprüfen Sie nun das Lichtblatt.

Füllen Sie einen Glas-Vete mit Fluoreszeinlösung und legen Sie ihn in die Halterung auf den Tischen. Das Lichtblatt sollte sichtbar sein. Es sollte horizontal und zentriert in Bezug auf die Detektionsobjektivlinse sein.

Entfernen Sie anschließend die Zylinderlinse. Optimieren Sie das Lichtblatt mit 3D-Translation des Beleuchtungsobjektivs und erfassen Sie ein Bild, um die Dicke des Lichtblatts zu messen. Dies hängt von der Blende des Objektivs ab.

Achten Sie dann darauf, die Zylinderlinse auszutauschen. Schneiden Sie zuerst ein Stück ein Millimeter dickes Glas mit einer Größe von 10 Millimetern x 20 Millimetern. Verwenden Sie einen Diamantmarkierungsstift.

Geben Sie dann 20 Mikroliter Poly-L-Lysin auf eine Seite und stellen Sie es nach dem Trocknen einem zweiten Objektträger gegenüber. Geben Sie in einer festen Position einen Tropfen 5%Agar hinzu und glätten Sie ihn mit dem Gewicht einer dritten Folie, die darauf gesetzt ist. Nachdem der Agar getrocknet ist, entfernen Sie den dritten Objektträger und schneiden Sie das Agarpad drei Millimeter vom Rand der beiden verbleibenden Objektträger über den Objektträger ohne Poly-L-Lysin.

Entfernen Sie dann den festen Objektträger, so dass ein Überhang aus Agar übrig bleibt. Bestreichen Sie den Agar mit 20 Mikrolitern Poly-L-Lysin und lassen Sie ihn trocknen. Legen Sie nun die GR-Würmer in ein mit M neun Medium gefülltes Uhrglas unter ein Präpariermikroskop.

Schneide die Würmer mit einem Skalpell in Höhe der Vulva und gib so die Eier frei. Identifizieren Sie dann die Embryonen, die sich im interessierenden Stadium befinden, und entnehmen Sie sie mit einer Mikrokapillarpipette. Übertragen Sie die Embryonen auf den Agar-Überhang des vorbereiteten Objektträgers direkt neben dem Rand des Objektträgers, nicht am Rand des Agars.

Richten Sie dann die Embryonen mit einer Mikrokapillarpipette aus, während Sie die Flüssigkeit entfernen. Durch die Aspiration bleiben die Embryonen an dem Polyol Lysin haften. Es ist sehr wichtig, die Embryonen gut zu positionieren, um eine gute Aufnahme zu erhalten, und dies erfordert eine Kapillare mit der richtigen Apture.

Wenn sie zu klein sind, wird es schwierig, die Embryonen freizusetzen. Wenn es zu groß ist, wird es schwierig sein, den ausgetretenen Fluss genau zu kontrollieren und die Embryonen auszurichten. Decken Sie den Objektträger mit M neun Medium in einer Petrischale ab und bestätigen Sie durch Vergrößerung, dass die Embryonen noch mit dem Agar verbunden sind. Befestigen Sie nun den vorbereiteten Objektträger mit den Embryonen auf dem Probenhalter, der in einen Tierarzt passt.

Der Halter ist eine hausgemachte Vorrichtung, die so konzipiert ist, dass sie zu einem Tierarzt passt. Befestigen Sie dann den Vete an einem elektrischen Pizo-Tisch und lokalisieren Sie unter Hellfeldbeleuchtung einen Embryo. Starten Sie nun das Softwarepaket, das die akustische Optik abstimmbar steuert.

Filtern Sie die Kamera und die Bühne. Diese Software hier wurde im eigenen Haus geschrieben, aber es kann auch Micromanager-Freeware verwendet werden. Wählen Sie zunächst die Laserlinie aus.

Passen Sie dann den Tisch entlang der x-Achse an, bis das Lichtblatt am hellsten ist. Stellen Sie dann die anderen beiden Dimensionen, Y und Z, ein, bis das Signal-Rausch-Verhältnis am besten ist. Dies muss möglicherweise für jeden Embryo wiederholt werden.

Dieser Schlüssel zur Optimierung des Signal-zu-Verhältnisses, um eine gute Aufzeichnung zu erhalten, die die eines freien Stadiums übersetzt, unterstützt das und Eliminierungsziel, wenn ich nur eine Beziehung habe, um eine ous Simulation des Embryos und den besten Kontrast zu erhalten. Erfassen Sie nun Zeitrafferbilder, stellen Sie die Laserleistung, die Belichtung, den Zeitgewinn und das Bildgebungsintervall entsprechend dem Fluoreszenzniveau des Embryos und der Geschwindigkeit des analysierten biologischen Prozesses ein. Für Zack.

Die Bildgebung legte den Abstand zwischen den Schichten und ihre Start- und Endpositionen in einem Metall fest, das ein Histon-GFP-Konstrukt ausdrückt. Es wurde ein zweistündiges Zeitrafferbild mit 20 Schichtstapeln erstellt, die alle 37 Sekunden aufgenommen wurden. Zellteilungen waren deutlich sichtbar in einem Stamm, der Tubulin exprimierte, das mit GFP fusioniert war, und seinem Stein, der mit Kirsche fusionierte. Die Aufzeichnungen wurden alle 105 Sekunden 16 Minuten lang aufgenommen.

3D-Renderings werden zu drei Zeitpunkten angezeigt. Die mitotischen Spindeln und kondensierten Chromosomen sind gut sichtbar und durch Zellteilungen leicht zu verfolgen. In einem dritten Stamm wurde das APO-Lipoprotein, Vit zwei, das mit GFP fusioniert war, mit mCherry-Markierung der Zellmembran abgebildet.

Über einen Zeitraum von 13 Minuten wurden alle 27 Sekunden 10 Schichtstapel entnommen. Sich schnell bewegende Lipoproteinpartikel waren leicht zu verfolgen. Hier verwenden wir das leichte Blech, das durch komplexere Verfahren gebildet wird, zur Herstellung.

Das Lichtblatt kann implementiert werden, um die räumliche Auflösung weiter zu verbessern.