Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Hepatitis-C-Virus (HCV) ist ein wichtiger menschlicher Krankheitserreger, der Lebererkrankungen, einschließlich Leberzirrhose und Krebs, verursacht. Ein HCV-infektiöses Zellkultursystem ist essentiell, um den molekularen Mechanismus der HCV-Replikation zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung verschiedener Stadien des HCV-Replikationszyklus.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, verschiedene Stadien des Replikationszyklus des Hepatitis-C-Virus zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst HCV-genomische RNA, Transkripte aus linearisierten HCV-Plasmidkonstrukten, generiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mit H-C-V-R-N-A zu transfizieren.

Als nächstes werden die Zellen für verschiedene Zeitpunkte und Assays plattiert. Der letzte Schritt besteht darin, den Zellkulturüberstand für die Messung des Virustiters zu entnehmen und transfizierte Zellen für Protein und RNA zu gewinnen. Letztendlich werden die reverse Transkription, der PCR-Western-Blotting-Immunfluoreszenz-Assay und der HCV-Titer durchgeführt und zeigen ein robustes HCV-infektiöses Zellkultursystem.

Der Hauptvorteil dieses infektiösen Hepatitis-C-Virus-Zellkultursystems gegenüber dem HCV-Replikantensystem besteht darin, dass die Assemblierungs- und Austrittsschritte des Viruseintritts untersucht werden können. Dieses Protokoll kann helfen, die wichtigsten Fragen im Bereich der Hepatitis-C-Virologie zu beantworten, wie z. B. Vion, Morphogenese und Wirt-a-Erreger-Interaktion. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Impfstoffentwicklung, da sie die Charakterisierung abgeschwächter Virusstämme ermöglicht, die als potenzielle Impfstoffkandidaten bewertet werden können.

Obwohl diese Methode Einblicke in das Hepatitis-C-Virus geben kann, kann sie auch auf andere RNA-Viren aus der Familie der Lab Verde angewendet werden. Im Allgemeinen stehen Personen, die neu in dieser Methode sind, vor der Herausforderung, qualitativ hochwertige HCV-Genom-RNA-Studien zu generieren. Der vollständige Replikationszyklus von HCV wurde in Zellkultur nach der Entdeckung eines Genotyps von zwei Isolaten möglich: A HCV, japanische fulminante Hepatitis eins.

Die visuelle Demonstration des virologischen Assays ist von entscheidender Bedeutung, da der Assay Fachwissen sowohl in molekularen als auch in zellulären Techniken erfordert. Unter Verwendung eines chimären Virus des Intragenotyps zwei A, F-N-X-H-C-V und F-N-X-H-C-V, poll null HCV zur Bewertung der viralen Replikation. Linearisieren Sie zuvor erzeugte virale Plasmide durch Verdau mit dem XBA-Ein-Restriktionsenzym in einem Zwei-Milliliter-Röhrchen. Behandeln Sie dann die Plasmide mit Mungobohnen-Nuklease, um stumpfe Enden zu erzeugen.

Die verdauten Plasmide werden durch Anionenaustauschchromatographie gereinigt. Überprüfen Sie die Integrität des linearisierten Plasmids, indem Sie die DNA einer AROS-Gelelektrophorese unterziehen. Als nächstes fügen Sie das linearisierte Plasmid-DNA-Template in ein 0,2-Milliliter-Röhrchen mit T-Sieben-RNA-Polymerase-Reaktionskomponenten hinzu, um genomische HCV-RNA-Transkripte zu synthetisieren.

Aufreinigung der neu synthetisierten DNA-behandelten RNA mit einem RNA-Aufreinigungskit. Überprüfen Sie dann die RNA-Produktion durch Agros-Gelelektrophorese. Anschließend wird die RNA durch spektrale Photometrie quantifiziert.

Trennen Sie HU-7-basierte adhärente Zellen mit Hilfe einer Trypsin-Enzymbehandlung und sammeln Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Konus. Zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationsreanimationen. Suspendieren Sie das Zellpellet mit kaltem Medium mit niedrigem Serumgehalt Nach Wiederholung der Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in Medium mit niedrigem Serumgehalt bei einmal 10 bis zu sieben Zellen pro Milliliter.

Mischen Sie als Nächstes insgesamt 10 Mikrogramm transkribierte virale RNA mit 400 Mikrolitern resuspendierten Zellen in ein vorgekühltes 0,4 Zentimeter großes Elektroporationsvet und geben Sie die virale RNA mit einer Elektroporation bei 270 Volt, 100 Ohm und 950 Mikroferren in die Zellen ab. Wenn Sie fertig sind, resuspendieren Sie die elektroporierten Zellen in 10 Millilitern vollständigem Wachstumsmedium mit 15 % FBS an dieser Stelle, plattieren Sie die Zellen in beiden T-25-Kolben mit etwa 1,2 mal 10 zu den sechs Zellen pro Kolben und 48-Well-Platten zu einem Mal 10 zu den vierten Zellen pro Vertiefung für Zeitpunkte von 4, 48 und 96 Stunden. Ersetzen Sie das Medium vier bis acht Stunden nach der Transfektion durch frisches, ergänztes Wachstumsmedium mit 10 % FBS, um abgestorbene Zelltrümmer aus den kultivierten Kolben und Platten zu entfernen.

Mit einer serologischen Pipette werden die Zellkulturüberstände zu den Zeitpunkten von 48 N und 96 Stunden in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen geerntet. Entfernen Sie dann nach der Zentrifugation zelluläre Trümmer aus den gesammelten Proben, indem Sie 10 Minuten lang bei 15.000 U/min bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Lagern Sie die zellfreien Überstände bei minus 80 Grad Celsius.

Lyzieren Sie die Zellen für die Protein- und RNA-Analyse mittels Western Blot und Reverse Transkription, quantitativer PCR oder R-T-Q-P-C-R zu den angegebenen Zeitpunkten. Reverse transkribieren Sie ein Mikrogramm der gesamten zellulären RNA unter Verwendung des Reverse-Transkriptase-Enzyms und eines spezifischen Primers für den HCV-Sinnesstrang, der in einem 0,2-Milliliter-Röhrchen an die fünf wichtigsten untranslatierten Regionen bindet. Reverse transkribieren Sie auch F-N-X-H-C-V-R-N-A von bekannten Genomkopien unter Verwendung eines HCV-Sense-Strang-Primers unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Systems.

Führen Sie die QPCR durch, indem Sie 50 Nanogramm der resultierenden transkribierten CD NA unter Verwendung spezifischer HCV-Primer und eines DNA-bindenden grünen Farbstoffs verwenden, der QPCR-Supermix enthält. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen, wenn Sie QPCR ausführen, um die H-C-V-R-N-A-Kopiennummer nach QPCR zu bestimmen. Lösen Sie das Zelllysat aus der viralen RNA auf, die nach 96 Stunden transfiziert wurde.

Posttransfektion mit SDS-Seite. Dann werden die aufgelösten Proteine im Gel mit der Trans-Plot-Turbo-Methode auf eine Poly-Vin-Difluorid-Membran übertragen. Blockieren Sie die Membran mit einer Blockierungslösung, die 5 % Magermilch und 0,2 % Tween 20 in PBS enthält, und geben Sie sie in einen Behälter.

Inkubieren Sie die Membran mit primären monoklonalen Maus-Antikörpern und S3 in einer Verdünnung von eins zu 1000 und Beta-Aktin in einer Verdünnung von eins zu 5.000 in einem Kühlraum von vier Grad Celsius. Nach der Inkubation wird Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin G zugegeben, das an Meerrettichperoxidase in einer Verdünnung von eins zu 5.000 konjugiert ist, und durch Chemilumineszenz nachgewiesen. Zu diesem Zeitpunkt fixieren Sie die H-C-V-R-N-A-Zellen 30 Minuten lang mit Methanol bei minus 20 Grad Celsius für den Immunfluoreszenz-Assay.

Wenn Sie fertig sind, waschen Sie die Zellen nach der Blockierung mit Immunfluoreszenz-Assay-Blockierungspuffer mehrmals mit PB S3, verwenden Sie den polyklonalen Kaninchen-Anti-NS-Antikörper fünf a und den monoklonalen Maus-Anti-DS-RNA-Antikörper J zwei in einer Verdünnung von eins bis 200 und inkubieren Sie ihn fünf Stunden lang bis über Nacht in einem vier Grad Celsius kalten Raum. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen mit PB S3 mal nach dem Primärantikörper. Fügen Sie dann den polyklonalen Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulin G 4 8 8 und den polyklonalen Sekundärantikörper Ziegen-Anti-Muse Immunglobulin 5 9 4 in einer Verdünnung von eins zu 1000 hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer Tischwippe.

Nach dem Waschen der Zellen mit PB S3 färben Sie die Zellkerne mit einem Herx-Stempel und betrachten sie mit einem Fluoreszenzmikroskop. Nächste Platte naiver Farbton, 7,5 0,1 Zellen bei etwa dreimal 10 bis zur dritten Zellen pro Well. Führen Sie am nächsten Tag mit einer 96-Well-Platte eine zehnfache serielle Verdünnung des zellfreien Kulturüberstands durch, der aus H-C-V-R-N-A-transfizierten Zellen unter Verwendung von Wachstumsmedien gewonnen wurde, und inokulieren Sie in dreifacher Ausfertigung auf den Farbton.

7,5 0,1 Zellen Fixieren Sie die Zellen 72 Stunden nach der Infektion mit Methanol für 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius, nachdem Sie die Zellen aus dem Gefrierschrank entnommen haben, Aminofärbung für H-C-V-N-S fünf A-Protein unter den zuvor beschriebenen Bedingungen unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops. Zählen Sie die NS fünf, A positive Zellherde in der Vertiefung mit der höchsten Virusverdünnung und berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der fokusbildenden Einheiten pro Milliliter. Die linearisierte HCV-Plasmidqualität wurde mittels Gelelektrophorese beurteilt.

Das H-C-V-D-N-A wurde einer T-Sieben-RNA-Polymerase-vermittelten In-vitro-Transkription unterzogen, die ein einzelnes RNA-Produkt bei 9,6 Kilobasen ergab. R-T-Q-P-C-R Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass das Wildtyp-Virus das Genom effizient replizierte. Der Wildtyp wies im Vergleich zum Poll-Null-Virus ein um ein bis drei log höheres Maß an Genomreplikation auf.

Das Wildtyp-Virus produzierte das NS-III-Protein, das an der Spaltung des viralen Proteins und der Genomreplikation beteiligt ist. Das Wildtyp-Virus exprimierte auch NS fünf a Protein und NS fünf a Protein und doppelsträngige RNA co, die im zellulären Zytoplasma von Wildtyp-transfizierten Zellen lokalisiert waren, was darauf hindeutet, dass aktive Virusreplikations-Titermessungen darauf hindeuten, dass das Wildtyp-Virus infektiös ist und sechs Stunden nach der Transfektion über 10.000 focibildende Einheiten pro Milliliter infektiöser Partikel produziert. Sowohl Wildtyp- als auch Pol-Null-Viren wiesen ähnliche Luciferase-Aktivitäten auf, was auf eine ähnliche Eingangsmenge an transfizierten Viren hinweist.

Die RNA war jedoch 48 Stunden und 96 Stunden nach der Transfektion translatiert worden. Das Wildtyp-Virus wies im Vergleich zum Poll-Null-Virus eine erhöhte Genomreplikationsrate auf. Das Wildtyp-Virus produzierte auch das virale NS-3-Protein.

Der Poll-Null-Virus wies eine Luziferase-Aktivität auf Basisniveau auf, während der Wildtyp-Virus im Vergleich zum Poll-Null-Reporter-Virus eine zwei bis drei Log höhere Replikationsstufe aufwies. Sobald Sie die virologische Hepatitis TC-Assays beherrschen, können sie in zwei Wochen durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, robuste Zellen und qualitativ hochwertige genomische HCV-RNA-Transkripte zu haben. Nach diesem Verfahren können charakterisierte HCV-Stämme in Tiermodellsystemen getestet werden, um in vivo Fitness und Interaktionen zwischen Wirt und Krankheitserregern zu untersuchen.

Die Entwicklung eines infektiösen HCV-Zellkultursystems ebnete den Forschern den Weg, das Virion, die Morphogenese und die viralen Austrittsschritte des HCV-Replikationszyklus zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie verschiedene virologische Assays zur Charakterisierung verschiedener Stadien des Hepatitis-C-Virus-Replikationszyklus durchführen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem Hepatitis-C-Virus äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung.