Name: Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Analyse der Hepatitis-C-Virus-Replikation mittels RNA-Transkription, Zelltransfektion und virologischer Assays. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung viraler Replikationszyklen für therapeutische Entwicklungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken F. Chisari für die Bereitstellung der Huh-7.5.1-Zelllinie. Wir danken Justine Ho für die Bearbeitung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch den Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award und das National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A. unterstützt.

Ein allgemeiner Überblick über das Protokoll ist in Fig. 1 dargestellt. 1. Cells <ol><li> Vorbereitung vollständige Wachstumsmedium, das 10-15% fötalem Rinderserum (FBS), 10 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 10 mM Hepes, Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin (100 mg / ml) und 2 mM L-Glutamin enthält. </li><li> Pflegen Huh-7.5.1-Zellen in 13 komplette Wachstumsmedium, das die oben genannten Ergänzungen für in-vitro-Analyse von Hepatitis-C-Virusreplikationszyklus. </li><li> Kultur Virusstämme in Huh-7.5.1-Zellen mit den angegebenen Wachstumsmedium ergänzt bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol> 2. Viren und Plasmid-Konstrukte <ol><li> Erzeugen, die komplementäre DNA (cDNA)-Form von HCV-RNA und klonen in einen Plasmidvektor für einfache genetische Manipulation. Hinweis: Die Entdeckung der japanischen fulminante Hepatitis 1, JFH-1 (HCV Genotyp 2a), Isolat HCV kritisch für Forschung gewesen undin erster Linie verwendet, um die HCV-Replikationszyklus 11-13 studieren. Inter-und intragenotypic chimären Viren basierend auf JFH-1 HCV sind häufig in Forschungs 14-18 verwendet. Konstruktion von synthetischen intragenotype 2a chimären Virus, FNX-HCV und einem monocistronischen chimären Reporterstamm wurde zuvor 19 und konstruktive Details sind nicht Gegenstand dieses Protokolls beschrieben. </li><li> Verwenden Sie die pFNX-HCV intragenotype 2a Virus als es enthält eine 5&#39;-NTR-, Struktur-Regionen und P7, und ein Teil der NS2 nicht-strukturellen Regionen (Nukleotide 1-2878) des J6CF Elternstamm (NCBI Zugangsnummer. AF177036), als sowie die nicht-strukturellen Komponenten des JFH-1-Virusstamm (NCBI Zugangsnummer. AB047639). Hinweis: FNX-HCV wurde basierend auf der Sequenz von Jc1 intragenotype 2a chimären HCV synthetisiert zuvor berichtet 15. </li><li> Generieren Sie eine monocistronischen chimären Reporter virales Konstrukt, das pFNX-Rluc, auf der Grundlage der pFNX-HCV-Stamm (oben in Schritt 2.2), indem Sie einen Renilla Luciferase-Gen zwischen der 5 &#39;NTR und Core-Gen (nt zwischen 388 und 389). Anschließend verbinden Sie das Luciferase-Gen-Gen-und Kern dieses Konstrukts mit einem Maul-und Klauenseuche-Virus 2A (F2A) Peptidsequenz, die als Spaltsignal funktionieren würde. </li><li> Ingenieur die RNA-Polymerase-Null (Pol-) virales Konstrukt entweder mit dem pFNX-HCV oder pFNX-Rluc viralen Hintergrund. Ersetzen die katalytischen Reste NS5B Polymerase GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), der eine dieser viralen Rückgrat mit AAG Aminosäureresten. </li></ol> 3. In-vitro-HCV-RNA-Transkription <ol><li> Verwenden Sie ein intragenotype 2a chimären Virus FNX-HCV und HCV-FNX Pol null (Pol-) HCV für die Bewertung der viralen Replikation (Abbildung 2A). </li><li> Linearisieren die viralen Plasmide mit XbaI Restriktionsenzym und dann mit Mungobohnennuclease um glatte Enden zu erzeugen behandeln. Reinigung der verdauten Plasmide durch Anionenaustauschchromatographie. Überprüfen Sie die Integrität of Das linearisierte Plasmid indem DNA-Gelelektrophorese (Fig. 2B) Agarose. </li><li> Übertragen Sie die linearisierte Plasmide mit Hilfe der viralen T7-RNA-Polymerase. </li><li> Reinige den neu synthetisierten DNase behandelte RNA unter Verwendung eines RNA-Reinigungs-Kits. </li><li> Überprüfen Sie, ob die RNA-Produktion durch Agarose-Gelelektrophorese (Abbildung 2C). </li><li> Quantifizierung der RNA durch Spektrophotometrie. </li><li> Lagern Sie den erzeugten RNA in -80 ° C in 10 ug Arbeits Aliquots. Hinweis: Um die Veränderung der RNA-Qualität innerhalb der einzelnen Versuchsplanung zu minimieren durch Transkription aller RNA für jede Virusprobe und Kontrolle zugleich. </li></ol> 4. HCV-RNA-Transfektion und Probenentnahme <ol><li> Ernten Sie die Huh-7.5.1-Zellen mit Trypsin. </li><li> Um Zellen, Zentrifuge spülen und resuspendieren Suspension zweimal mit kaltem niedrigen Serum-Medien. Resuspendieren der Zellen in Medien mit niedrigem Serumgehalt 1 x 10 7 Zellen pro ml beträgt. </li><li> Mischen Sie insgesamt 10 &amp; #956; g transkribierte Virus-RNA mit 400 ul der resuspendierten Zellen (4 × 10 6 Zellen) in einer 0,4-cm-Elektroporationsküvette transferiert. Transfektion von Zellen mittels Elektroporation bei 270 V, 100 Ω und 950 uF. </li><li> Resuspendieren der Elektroporation Zellen in 10 ml Vollwachstumsmedium mit 15% FBS. Hinweis: Erhöhte Überlebensfähigkeit von Zellen elektroporiert wird gesehen, wenn die Huh-7.5.1-Zellen wurden in 15% fötalem Rinderserum kultiviert. </li><li> Platte, die Zellen in beiden T-25-Kolben (~ 1,2 × 10 6 Zellen pro Kolben) und 48-Well-Platten (1 × 10 4 Zellen pro Vertiefung) für jede der folgenden Zeitpunkten: 4, 48 und 96 Stunden. </li><li> Ersetzen Sie die Medien bei 4-8 Stunden nach der Transfektion mit frischem ergänzten Wachstumsmedium mit 10% FBS, um abgestorbene Zellreste aus den kultivierten Flaschen und Platten entfernen. </li><li> Erntezellkulturüberständen an den 48, 96 h Zeitpunkte und Entfernen von Zelltrümmern von gesammelten Proben durch Zentrifugation der Zellen bei 1500 UpM für 10 min bei 4 º C. </li><li> Bewahren Sie die zellfreien Überstände bei -80 º C. Lyse der Zellen, die für Protein-und RNA-Analyse durch Western-Blot und Reverse Transkription-PCR quantitativ zu den angegebenen Zeitpunkten. </li></ol> 5. Reverse Transkription-quantitative PCR (RT-qPCR) für die Beurteilung der HCV-Genom-Kopien <ol><li> Führen eine Zwei-Schritt-RT-qPCR die genomische HCV-RNA Kopienzahl zu bestimmen. </li><li> Revers transkribieren 1 ug zelluläre Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase und eines Primers spezifisch für HCV-sense-Strang, der 5 &#39;NTR (JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3&#39;) bindet, oder ein Primer, die spezifisch für Haushaltsgens Peptidylprolyl Isomerase G (R ppig : 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 &#39;). Auch Reverse Transkription FNX-HCV-RNA (in Schritt 3 erzeugte) bekannter Genomkopien (10. Januar-10. September Standard) mit HCV-Sense-Strang Primer. </li><li> Führen Sie qPCR unter Verwendung von 50 ng der resultierenden cDNA transkribiert mit spezifischen HCV-Primer (JFH RTQF: 5&#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;) und DNA-Bindung grüne Farbstoff, der qPCR Super-Mix. Führen qPCR für Housekeeping-Gen sowie ppig (ppig Primer F: 5&#39;-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 &#39;; ppig R: 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3&#39;) Anmerkung: Für die Berechnung der genauen intrazellulären HCV-RNA-Ebene über die Stichproben verwenden zellulären Housekeeping-Gen, ppig , Expressionsniveau (Ct-Zyklus) für die Normalisierung. Verwenden Sie die Kopienzahl des FNX-HCV-Genom als Standard für die Bestimmung der Kopienzahl. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Bedingungen bei der Ausführung von qPCR auf HCV-RNA-Kopienzahl zu bestimmen: 95 ° C für 15 Sekunden und 60 &#160; º C für 30 Sekunden (40 Zyklen) mit Echtzeit-PCR-System. </li><li> Siehe Fig. 3A und 3B für die Genomreplikation Ergebnisse. </li></ol> 6. Western Blot-Analyse zum Nachweis von HCV-Protein-Expression (Fig. 3C) <ol><li> Verwenden Zelllysate from Virus-RNA bei 96 Stunden nach der Transfektion für Protein-Western-Blot-Analyse transfiziert. </li><li> Lösen das Zelllysat unter Verwendung von SDS-PAGE und Transfer auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran. </li><li> Blockieren der Membran mit einer Blockierungslösung, enthaltend 5% Magermilch, 0,2% Tween 20 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). </li><li> Inkubation der Membran mit primären monoklonalen Maus-Antikörper NS3 (1 von 1.000 Verdünnung) und beta-Aktin (1 in 5000 Verdünnung). </li><li> Hinzufügen Ziege-anti-Maus-IgG, das mit Meerrettich-Peroxidase (1 in 5.000 verdünnt) konjugiert und durch Chemolumineszenz nachzuweisen. </li></ol> 7. Immunfluoreszenz-Assay (IFA) <ol><li> Beheben die HCV-infizierten und transfizierten Zellen unter Verwendung von Methanol für 30 min bei -20 º C für Immunfluoreszenz-Assay. </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und Block mit IFA Blockierungspuffer. </li><li> Verwenden polyklonalen Kaninchen anti-NS5A in erster Linie Antikörper oder monoklonalen Maus-Anti-DSR (freundlicherweise von Dr. Dasgupta, UCLA Verfügung gestellt)NA J2 Antikörper bei einer Verdünnung von 1:200 (1 ug / ml) und Inkubation für 5 h bis über Nacht bei 4 º C. </li><li> Dreimal nach dem primären Antikörper Waschen der Zellen mit PBS. </li><li> Hinzufügen Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundär 488 polyklonalen Antikörper oder Ziege-anti-Maus-IgG-Sekundär 594 polyklonalen Antikörper in einer 1:1000 Verdünnung (1 ug / ml) und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen der Zellen mit PBS dreimal und Fleckenkerne mit Hoechst-Farbstoff und Ansicht mit Fluoreszenzmikroskop (Fig. 3D). </li></ol> 8. Mess Virus Titer <ol><li> Platte naiv Huh-7.5.1-Zellen bei etwa 3 x 10 3 Zellen / Well unter Verwendung eines 96-Well-Platte. Am nächsten Tag, führen das 10-fache serielle Verdünnungen der zellfreien Kulturüberstand von HCV-RNA-transfizierten Zellen mit Wachstumsmedium geerntet und in dreifacher Ausfertigung auf impfen Huh-7.5.1-Zellen. </li><li> Fix-Zellen bei 72 Stunden nach der Infektion mit Methanol (30 min bei -20 </sup&gt; º C) und immunostain für HCV NS5A-Protein, wie in Abschnitt 7 angegeben. </li><li> Verwenden Sie die höchste Verdünnung, die für die NS5A positive Foci zählen und berechnen die durchschnittliche Anzahl der Schwerpunkt Bildungseinheit (FFU) pro Milliliter. Siehe Abbildung 4 für die HCV-Titer. </li></ol> 9. Renilla Luciferase Reporter Assay für virale Genom-Replikation und Infektiosität <ol><li> Für die Beurteilung viralen Genomreplikation, Platte HCV-RNA-Elektroporation Huh-7.5.1-Zellen in dreifacher Ausfertigung in 48-Well-Platten (1 x 10 4 Zellen / well). </li><li> Lyse die Zellen mit 75 ul der passiven Lyse-Puffer an der 6 h, 48 h und 96 h nach der Transfektion. </li><li> Schaukeln Sie die Platten vorsichtig für 15 Minuten bei Raumtemperatur und bei -80 º C. </li><li> Zur Messung der Renilla-Luciferase-Enzymaktivität, die Protein-Lysat auftauen und Renilla-Luciferase-Assay-Reagenzien auf Raumtemperatur. </li><li> In 20 ul Proteinlysat pro Vertiefung einer 96-wel<html> l weiße Lumineszenz Platte und legen Sie die Platte in einem Luminometer. </li><li> Pipettieren von 100 ul Renilla Luciferase-Assay-Reagenz (Coelenterazin Substrat + Puffer) pro Vertiefung und nach einer 2 Sek. vor, lesen Verzögerung; integrieren, das emittierte Licht für 10 Sekunden. </li><li> Mittelwert und Standardabweichung für jede Probe aus den Luciferase-Werte der biologischen Triplikaten und unterziehen die Daten einer statistischen Analyse (Abbildung 5). </li><li> Zur Beurteilung Infektiosität inokulieren 500 ul zellfreier Überstand aus HCV-RNA-transfizierten Zellen für die angegebenen Zeitpunkten (48 h und 96 h) in dreifacher Ausfertigung in 48-Well-Platten auf naiven Huh-7.5.1-Zellen erhalten. </li><li> Ersetzen Sie die viralen Inokulum mit 500 ml frisches Medium pro Well nach 6 Stunden nach der Infektion. </li><li> Lyse der Zellen bei 48 Stunden nach der Infektion und nach Renilla-Luciferase-Assay, wie in Schritten von 8,2 bis 8,7 (Fig. 5) beschrieben. </li></ol>itel &quot;&gt; 10. Statistische Analyse <ol><li> Die Fehlerbalken in den Diagrammen zeigen die Standardabweichungen (SD). Die P-Werte wurden mit dem ungepaarten t-Test berechnet. </li></ol>

<ol><li>Alter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.+Epidemiology+of+hepatitis+C%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology.%22%5BJournal%5D)">J. Epidemiology of hepatitis C.</a> Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).</li>
<li>Alter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.+Epidemiology+of+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">J. Epidemiology of hepatitis C virus infection.</a> World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).</li>
<li>Lavanchy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+hepatitis+C%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">The global burden of hepatitis C.</a> Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).</li>
<li>Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindenbach%2C+BD+%22Flaviviridae%3A+viruses+and+their+replication+in+Fields+Virology%22">Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology</a>. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).</li>
<li>Ciesek, S., Manns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+in+2010%3A+the+dawn+of+a+new+era+in+HCV+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).</li>
<li>Ghany, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+treatment+of+genotype+1+chronic+hepatitis+C+virus+infection%3A+2011+practice+guideline+by+the+American+Association+for+the+Study+of+Liver+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases.</a> Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).</li>
<li>Choo, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+cDNA+clone+derived+from+a+blood-borne+non-A%2C+non-B+viral+hepatitis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome.</a> Science. 244 (4902), 359-362 (1989).</li>
<li>Kolykhalov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+hepatitis+C+by+intrahepatic+inoculation+with+transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA.</a> Science. 277 (5325), 570-574 (1997).</li>
<li>Lohmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+subgenomic+hepatitis+C+virus+RNAs+in+a+hepatoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line.</a> Science. 285 (5424), 110-113 (1999).</li>
<li>Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+initiation+of+HCV+RNA+replication+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture.</a> Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).</li>
<li>Lindenbach, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+replication+of+hepatitis+C+virus+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.</a> Science. 309 (5734), 623-626 (2005).</li>
<li>Wakita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+infectious+hepatitis+C+virus+in+tissue+culture+from+a+cloned+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome.</a> Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+hepatitis+C+virus+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Robust hepatitis C virus infection in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).</li>
<li>Yi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mutations+in+E1%2C+p7%2C+NS2%2C+and+NS3+enhance+yields+of+cell+culture-infectious+intergenotypic+chimeric+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus.</a> J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).</li>
<li>Pietschmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+infectious+intragenotypic+and+intergenotypic+hepatitis+C+virus+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+full-length+hepatitis+C+virus+genotype+1+%28strain+TN%29+infectious+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).</li>
<li>Yi, M., Lemon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+1a+HCV+%28H77S%29+infection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotype 1a HCV (H77S) infection system.</a> Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).</li>
<li>Gottwein, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+hepatitis+C+reporter+viruses+with+genotype+1+to+7+core-nonstructural+protein+2+%28NS2%29+expressing+fluorescent+proteins+or+luciferase+in+modified+JFH1+NS5A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A.</a> J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).</li>
<li>Arumugaswami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+functional+profiling+of+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome.</a> PLoS Pathog. 4 (10), (2008).</li>
<li>Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+enhancer+and+critical+cis-acting+RNA+elements+in+the+protein-encoding+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome.</a> J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).</li>
<li>Salloum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab18+binds+to+hepatitis+C+virus+NS5A+and+promotes+interaction+between+sites+of+viral+replication+and+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets.</a> PLoS Pathog. 9 (8), (2013).</li>
<li>Gonzalez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+optimal+RNA+transfection+reagent+and+comparison+to+electroporation+for+the+delivery+of+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA.</a> J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).</li>
<li>Phan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+NS2+protein+contributes+to+virus+particle+assembly+via+opposing+epistatic+interactions+with+the+E1-E2+glycoprotein+and+NS3-NS4A+enzyme+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes.</a> J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).</li>
<li>Schaller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hepatitis+C+virus+superinfection+exclusion+by+using+novel+fluorochrome+gene-tagged+viral+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes.</a> J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).</li>
<li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hepatitis+C+virus+lacking+the+envelope-encoding+genes+for+single-cycle+infection+by+providing+homologous+envelope+proteins+or+vesicular+stomatitis+virus+glycoproteins+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans.</a> J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).</li>
<li>Jones, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+p7+and+NS2+proteins+are+essential+for+production+of+infectious+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus.</a> J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).</li>
<li>Steinmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+p7+protein+is+crucial+for+assembly+and+release+of+infectious+virions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions.</a> PLoS Pathog. (7), (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Darstellung beschreibt ein Verfahren zum Analysieren des Hepatitis-C-Virus-Replikationszyklus. HCV ist ein humanes Pathogen und die vorgeschriebene Biosafety-Protokoll müssen strikt eingehalten werden. Infektiöse HCV-Zellkultursysteme wurden zuvor 11-13,16,17 beschrieben. Es gibt nur wenige wichtige Punkte zu implementieren, wenn wir nach dem Protokoll dargestellt. Erstens, von hoher Bedeutung ist es, gute Qualität von intakten voller Länge viralen genomischen RNA für nachgeschaltete Studien. Die Eingan...

Hepatitis-C-Virus (HCV) verursacht Leberzirrhose und Leberkrebs. Es betrifft 170 Millionen Menschen weltweit mit 350.000 Menschen sterben jährlich 1-3. HCV ist ein positiver Strang-RNA-Virus mit einer Genomgröße von 9,6 kb. Das HCV-Genom als ein einzelnes Polyprotein von ca. 3000 Aminosäuren, das proteolytisch durch verschiedene zelluläre und virale Proteasen gespalten, in 10-Polypeptide translatiert wird. HCV-Virus ist der Prototyp der Gattung Hepacivirus und gehört zur Familie der Flaviviridae 4. Bei der Belichtung stellt chronischer HCV-Infektion in 80% der Individuen. Die Infektion ist meist asymptomatisch und rechtzeitige Diagnose kann die therapeutische Intervention zu Leber Verschlechterung verhindern können. Die derzeitige Behandlung nicht optimal sein und kein Impfstoff verfügbar ist 5,6. Die Ätiologie der Hepatitis C wurde erstmals 1989 7 beschrieben. Studieren HCV-Replikation ist wichtig für die Hepatitis-C-Impfstoff-und Behandlungsforschung, aber es warlang durch das Fehlen eines effizienten Viruskultursystem behindert. Ein molekularer Klon des HCV Infektions wurde gezeigt, bei Schimpansen auf intra-Impfung 8 sein. Anschließend wurden HCV subgenomische Replikon beschrieben, die das virale Genom-Replikation Stufe in einem Zellkultursystem erlaubt 9,10 sezieren. Entdeckung einer Genotyp HCV 2a isolieren JFH-1 (Japanese Fulminante Hepatitis-1), infizieren Zellkultur eröffnet neue Wege für die HCV-Replikation Forschungs 11-13. Genotyp 2a Stamm JFH-1-Basis inter-und intra-und genotypische chimären Viren vom Genotyp 1 HCV Infektions basierend Kultursysteme sind auch 14 bis 18 erhältlich. Wir haben erfolgreich JFH-1-Stamm-und HCV-intragenotype 2a chimären Virus verwendet, um die hochauflösenden funktionellen Profilierung Karte von Proteindomänen und cis-aktiven RNA-Elemente 19,20 zu erhalten. Demnach beschreiben wir eine effektive Kultursystem routinemäßig verwendet, die ermöglichtStudium der verschiedenen Stadien des HCV-Replikationszyklus und Wirt-Pathogen-Interaktion. Wir präsentieren virologische Untersuchungen auf virale Genom-Replikation und de novo Infektiosität von HCV intragenotype 2a und einem Renilla-Luciferase Reporter basierend HCV beurteilen.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Nicht essentielle Aminosäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduziertes Serummedium, ohne Phenol Red</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7.5.1</td><td>Das Scripps Research Institute</td><td></td><td>Die Zelllinie wurde freundlicherweise von Dr. Francis Chisari Dr. Arumugaswami im Rahmen einer ausgeführten MTA zwischen dem Scripps Research Institute und dem Cedars-Sinai Medical Center zur Verfügung gestellt</td></tr>. <tr><td>Plasmide (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc und pFNX-Rluc Pol null)&nbsp;</td><td>Cedars-Sinai Medical Center</td><td></td><td>Die HCV-Plasmide wurden von Dr. Arumugaswami unter Verwendung von überlappenden Oligonukleotiden synthetisiert.</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Mungobohnen-Nuklease</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td> Nanodrop 2000 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsküvette (4 mm)</td><td>Bioexpress</td><td>E-5010-4</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Total System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>monoklonaler Anti-dsRNA-Antikörper für Mäuse J2&nbsp;</td><td>Deutsch & Wissenschaftliche Beratung Kft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Membran Paket</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0263</td><td></td></tr><tr><td>Blotting Grade Blocker Fettfreie Trockenmilch</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404XTU</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531XTU</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hepatitis C Virus NS3 Antikörper [8 G-2]</td><td>Abcam</td><td>ab65407</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hepatitis C Virus NS3 Antikörper [H23]</td><td>Abcam</td><td>ab13830</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL Prime Western Blotting-Detektionsreagenzien&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2236</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time-PCR-System</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Luciferase Assay System-Kit</td><td>Promega</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>RNase-freies DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>GloMax-Multi-Nachweissystem (Luminometer)</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein protokoll für die analyse von hepatitis-c-virus-replikation

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis-C-Virus (HCV) betrifft 3% der Weltbevölkerung und verursacht schwere Lebererkrankungen wie chronische Hepatitis, Leberzirrhose und Leberzellkarzinom. HCV ist ein umhülltes RNA-Virus aus der Familie Flaviviridae. Strombehandlung nicht wirksam ist und bewirkt, dass nachteilige Nebenwirkungen. Es gibt keine HCV-Impfstoff zur Verfügung. So wird fortgesetzt Aufwand für die Entwicklung eines Impfstoffes und eine bessere Therapie erforderlich. Einem HCV-Zellkultursystems ist kritisch für das Studium verschiedener Stadien der HCV Wachstum einschließlich Viruseintritt, Genom-Replikation, Verpackung und Austritt. In der vorgestellten aktuellen Prozedur verwendeten wir eine Wildtyp-intragenotype 2a chimären Virus, FNX-HCV, und ein rekombinantes FNX-Rluc Virus, eine Renilla-Luciferase-Reportergens um die Virusreplikation zu studieren. Eine menschliche Hepatom-Zelllinie (Huh-7-Basis) wurde für die Transfektion von in vitro transkribierten genomischen HCV-RNAs. Zellfreie Kulturüberstände, Protein-Lysate und total RNA wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Ernte Transfektion HCV Wachstum zu beurteilen. HCV-Genom-Replikation Status wurde durch quantitative RT-PCR und Visualisierung der Gegenwart von HCV-RNA-Doppelstrang ausgewertet. Die HCV-Proteinexpression wurde durch Western-Blot und Immunfluoreszenz unter Verwendung von für HCV-NS3-und NS5A-Proteine ​​Antikörper verifiziert. HCV-RNA-transfizierten Zellen freigesetzt infektiöse Partikel in Kulturüberstand und der Virustiter wurde bestimmt. Luciferase-Assays wurden verwendet, um die Replikationsebene und Infektiosität von HCV-Reporter beurteilen. Zusammenfassend stellen wir verschiedene virologische Tests zur Charakterisierung von verschiedenen Stufen des HCV-Replikationszyklus.

Hepatitis C-Virus ist ein RNA-Virus ist. Somit zur genetischen Manipulation Zweck hat die genomische HCV-cDNA in einen bakteriellen Plasmid-Vektor kloniert. Ein T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz wurde unmittelbar vor dem 5&#39;-Ende des HCV-Genoms eingeführt. Eine allgemeine Übersicht der HCV-Analyse-Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. Um genomische HCV-RNA mit präziser 3-Ende erzeugen, wird das HCV-Genom-Plasmid, das mit XbaI Restriktionsenzym und die erzeugte Einzelstrangüberhang wurde m...

Hepatitis-C-Virus (HCV) ist ein wichtiger menschlicher Krankheitserreger, der Lebererkrankungen, einschließlich Leberzirrhose und Krebs, verursacht. Ein HCV-infektiöses Zellkultursystem ist essentiell, um den molekularen Mechanismus der HCV-Replikation zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung verschiedener Stadien des HCV-Replikationszyklus.

Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, verschiedene Phasen des Replikationszyklus des Hepatitis-C-Virus zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst genomische HCV-RNA-Transkripte aus linearisierten HCV-Plasmidkonstrukten erzeugt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mit H-C-V-R-N-A zu transfectieren. Anschließend werden die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten ausplattiert und verschiedenen Assays unterzogen. Im letzten Schritt wird das Zellkulturüberstand zur Bestimmung der Viruslast gesammelt und die transfizierten Zellen zur Gewinnung von Protein und RNA geerntet. Letztendlich werden Reverse-Transkriptase-PCR, Western-Blotting, Immunfluoreszenz-Assay und die Bestimmung der HCV-Viruslast durchgeführt, um ein robustes infektiöses Zellkultursystem für HCV nachzuweisen.Der Hauptvorteil dieses infektiösen Hepatitis-C-Virus-Zellkultursystems gegenüber dem HCV-Genomreplikonsystem besteht darin, dass die Schritte Virus-Eintritt, Virionen-Assembly und -Ausschleusung untersucht werden können. Dieses Protokoll kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Hepatitis-C-Virologie zu beantworten, wie beispielsweise die Virion-Morphogenese und die Wirt-Pathogen-Interaktion. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Impfstoffentwicklung hinein, da sie die Charakterisierung abgeschwächter Virusstämme ermöglicht, die als mögliche Impfstoffkandidaten evaluiert werden können.Obwohl diese Methode Einblicke in das Hepatitis-C-Virus ermöglichen kann, ist sie auch auf andere RNA-Viren der Familie Flaviviridae anwendbar. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, vor die Herausforderung gestellt, hochwertige HCV-Genom-RNA zu erzeugen. Die Untersuchung des vollständigen Replikationszyklus von HCV wurde in Zellkultur nach der Entdeckung eines Genotyp-2A-HCV-Isolats aus japanischem fulminantem Hepatitis-Fall möglich. Die visuelle Demonstration des virologischen Assays ist entscheidend, da der Assay Expertise in molekularen und zellulären Techniken erfordert.Verwenden Sie ein intragenomisches chimäres Virus vom Genotyp 2A, F-N-X-H-C-V und F-N-X-H-C-V pol-null HCV, zur Beurteilung der viralen Replikation, und linearisieren Sie zuvor generierte virale Plasmide durch Verdauung mit dem XBA-eins-Sperrenzym in einem zwei-Milliliter-Röhrchen. Behandeln Sie anschließend die Plasmide mit Mungobohnen-Nuklease, um stumpfe Enden zu erzeugen.Reinigen Sie die gespaltenen Plasmide mittels Anionenaustauschchromatographie. Überprüfen Sie die Integrität des linearisierten Plasmids, indem Sie die DNA einer Agarose-Gelelektrophorese unterziehen. Fügen Sie anschließend die linearisierte Plasmid-DNA-Vorlage in ein 0,2-Milliliter-Röhrchen ein, das die Reaktionsbestandteile der T-sieben-RNA-Polymerase enthält, um HCV-genomische RNA-Transkripte zu synthetisieren.Reinigen Sie die neu synthetisierte, mit DNase behandelte RNA mithilfe eines RNA-Reinigungskits. Überprüfen Sie anschließend die RNA-Produktion durch Agarose-Gelelektrophorese. Danach quantifizieren Sie die RNA mittels Spektrophotometrie.Lösen Sie die auf Huh-7 basierenden anhaftenden Zellen mithilfe einer Trypsin-Behandlung und sammeln Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Kegelrohr. Zwei anschließende Zentrifugationsschritte umfassen das Aufschwemmen des Zellpellets mit kaltem Medium mit geringem Serumgehalt. Nach Wiederholung der Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in Medium mit geringem Serumgehalt bei einer Konzentration von 1 × 10⁷ Zellen pro Milliliter.Mischen Sie anschließend insgesamt 10 Mikrogramm transkribierte virale RNA mit 400 Mikrolitern resuspendierten Zellen in einer vorab gekühlten Elektroporationsküvette mit 0,4 Zentimeter Elektrodenabstand. Übertragen Sie die virale RNA mithilfe einer Elektroporation bei 270 Volt, 100 Ohm und 950 Mikrofarad in die Zellen. Danach resuspendieren Sie die elektroporierten Zellen in 10 Milliliter komplettem Wachstumsmedium mit 15 % FBS. Impfen Sie die Zellen nun sowohl in T-25-Flaschen mit etwa 1,2 × 10⁶ Zellen pro Flasche als auch in 48-Well-Platten mit 1 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung für Zeitpunkte von 4, 48 und 96 Stunden aus. Ersetzen Sie das Medium vier bis acht Stunden nach der Transfektion durch frisches, supplementiertes Wachstumsmedium mit 10 % FBS, um totes Zellmaterial aus den kultivierten Flaschen und Platten zu entfernen.Die Kulturüberstände mit einer serologischen Pipette zu den Zeitpunkten 48 und 96 Stunden in einen 15-Milliliter-Konikalrohr gewinnen. Anschließend zelluläre Trümmer durch Zentrifugation bei 15.000 rpm für 10 Minuten bei vier Grad Celsius aus den gesammelten Proben entfernen. Nach der Zentrifugation die zellfreien Überstände bei minus 80 Grad Celsius lagern.Lysieren Sie die Zellen zu angegebenen Zeitpunkten zur Protein- und RNA-Analyse mittels Western Blot und reverser Transkriptase-quantitativer PCR oder RT-qPCR. Transkribieren Sie ein Mikrogramm gesamter zellulärer RNA unter Verwendung eines Reverse-Transkriptase-Enzyms und eines spezifischen Primers für den HCV-Sinnstrang, der an die fünfprime nichtübersetzte Region in einem 0,2-Milliliter-Röhrchen bindet. Transkribieren Sie außerdem F-N-X-H-C-V-R-N-A mit bekannter Kopienzahl des Genoms unter Verwendung eines HCV-Sinnstrang-Primers zurück. Führen Sie mittels eines Echtzeit-PCR-Systems die qPCR unter Verwendung von 50 Nanogramm der resultierenden transkribierten cDNA mit spezifischen HCV-Primern und einer qPCR-Supermix-Lösung, die grünen DNA-Bindungsfarbstoff enthält, durch. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen bei der Durchführung der qPCR, um die H-C-V-R-N-A-Kopienzahl zu bestimmen. Trennen Sie nach der qPCR das Zelllysat aus der viralen RNA, die 96 Stunden nach der Transfektion transfiziert wurde, mittels SDS-PAGE auf. Übertragen Sie anschließend die aufgetrennten Proteine aus dem Gel auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran mittels Trans-Blot-Turbo-Methode. Blocken Sie die Membran mit einer Blockierungslösung, die 5 % Magermilchpulver und 0,2 % Tween-20 in PBS enthält, und legen Sie sie in einen Behälter.Die Membran mit dem primären mausmonoklonalen Antikörper NS3 in einer Verdünnung von 1:1000 und Beta-Aktin in einer Verdünnung von 1:5.000 bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin-G, konjugiert mit Meerrettichperoxidase, in einer Verdünnung von 1:5.000 hinzufügen und mittels Chemilumineszenz detektieren.Zu diesem Zeitpunkt fixieren Sie die H-C-V-R-N-A-transfizierten Zellen mit Methanol für 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius für den Immunfluoreszenz-Assay. Anschließend waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Nach der Blockierung mit dem Blockierpuffer für den Immunfluoreszenz-Assay geben Sie den primären Kaninchen-polyklonalen Anti-NS5A-Antikörper und den primären monoklonalen Maus-Antikörper J2 gegen DSRNA im Verdünnungsverhältnis 1 zu 200 hinzu und inkubieren fünf Stunden bis über Nacht im Kühlschrank bei 4 Grad Celsius. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS nach dem primären Antikörper. Danach geben Sie den sekundären polyklonalen Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulin-G-488-Antikörper und den sekundären polyklonalen Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin-594-Antikörper im Verdünnungsverhältnis 1 zu 1000 hinzu und inkubieren eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Tischschüttler. Nach dreimaligem Waschen der Zellen mit PBS färben Sie die Zellkerne mit dem Farbstoff Hoechst und betrachten sie mit einem Fluoreszenzmikroskop. Pflanzen Sie anschließend naiv Huh7.5.1-Zellen mit einer Dichte von etwa drei mal 10 hoch drei Zellen pro Vertiefung in einer 96-Loch-Platte aus. Am nächsten Tag führen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung des zellfreien Kulturüberstandes, der von H-C-V-R-N-A-transfizierten Zellen gewonnen wurde, mit Wachstumsmedium durch und impfen Sie diesen verdünnten Überstand in dreifacher Wiederholung auf Huh7.5.1-Zellen auf. Fixieren Sie die Zellen 72 Stunden nach der Infektion mit Methanol für 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius. Entnehmen Sie die Zellen anschließend dem Gefrierschrank und färben Sie sie unter den zuvor beschriebenen Bedingungen für das H-C-V-NS5A-Protein an. Zählen Sie mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops die NS5A-positiven Zellfoki in der Vertiefung mit der höchsten Virusverdünnung und berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl an fokusbildenden Einheiten pro Milliliter. Die Qualität des linearisierten HCV-Plasmids wurde mittels Gelelektrophorese überprüft. Die H-C-V-D-N-A wurde einer T-sieben-RNA-Polymerase-vermittelten In-vitro-Transkription unterzogen, wodurch ein einzelnes RNA-Produkt mit 9,6 Kilobasen entstand. RT-qPCR-Ergebnisse zeigten, dass das Wildtyp-Virus das Genom effizient replizierte. Das Wildtyp-Virus wies im Vergleich zum Pol-Null-Virus eine um eine bis drei log-Stufen höhere Genomreplikation auf.Das Wildtyp-Virus produzierte das NS3-Protein, das an der Spaltung viraler Proteine und der Genomreplikation beteiligt ist. Das Wildtyp-Virus exprimierte außerdem das NS5A-Protein, und das NS5A-Protein sowie doppelsträngige RNA lokalisierten sich gemeinsam im zellulären Zytoplasma transfizierter Wildtyp-Zellen, was auf eine aktive virale Replikation hindeutet. Titermessungen des Virus zeigten, dass das Wildtyp-Virus infektiös ist und über 10.000 fokusbildende Einheiten pro Milliliter infektiöser Partikel produziert. Sechs Stunden nach der Transfektion wiesen sowohl das Wildtyp- als auch das Pol-null-Virus ähnliche Luciferase-Aktivitäten auf, was darauf hindeutet, dass eine vergleichbare Menge transfizierter RNA translatiert worden war. Allerdings zeigte das Wildtyp-Virus 48 und 96 Stunden nach der Transfektion im Vergleich zum Pol-null-Virus erhöhte Replikationsniveaus des Genoms. Das Wildtyp-Virus produzierte zudem virales NS3-Protein. Das Pol-null-Virus wies eine Grundniveau-Luciferase-Aktivität auf, während das Wildtyp-Virus eine zwei- bis dreifach logarithmisch höhere Replikationsrate im Vergleich zum Pol-null-Reporter-Virus aufwies. Sobald die virologischen Assays für Hepatitis C beherrscht sind, können sie innerhalb von zwei Wochen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, über robuste Zellen und hochwertige HCV-Genom-RNA-Transkripte zu verfügen. Im Anschluss an dieses Verfahren können charakterisierte HCV-Stämme in Tiermodellsystemen getestet werden, um die Fitness in vivo sowie Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen.Die Entwicklung eines infektiösen HCV-Zellkultursystems ebnete den Weg dafür, dass Forscher die Schritte der Virion-Morphogenese und des viralen Austritts im HCV-Replikationszyklus untersuchen konnten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie verschiedene virologische Assays durchgeführt werden, um unterschiedliche Phasen des Replikationszyklus des Hepatitis-C-Virus zu charakterisieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem Hepatitis-C-Virus äußerst gefährlich sein kann, und denken Sie stets daran, Sicherheitsvorkehrungen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung zu treffen, während Sie dieses Verfahren durchführen.

a-protocol-for-analyzing-hepatitis-c-virus-replication

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben zwei Methoden für die...

Zwei Methoden der Heterokaryon Formation zu entdecken HCV Restriktionsfaktoren

Source: Allaire, A., et al. Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the procedure for preparing cells to assess the intracellular uptake and activity of an antiviral agent against the hepatitis C virus.

Preparing Cells to Analyze Intracellular Uptake and Activity of an Antiviral Agent

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates the procedure for quantifying Hepatitis C viral RNA using quantitative reverse transcription PCR to measure viral load in infected cell cultures.

Measuring Hepatitis C Viral Load Using Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

Dieses Video zeigt einen viralen Attachment-Assay zum Screening antiviraler Verbindungen. Unter Verwendung von genetisch veränderten Hepatitis-C-Viren und Luciferase werden inhibitorische Effekte auf die Virusanheftung bewertet, was sich in einer geringeren Lichtintensität in gleichzeitig behandelten Vertiefungen im Vergleich zu Vertiefungen, die nur mit dem Virus behandelt wurden, zeigt.

Ein Virus-Attachment-Assay für das Screening von antiviralen Verbindungen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Bewertung von antiviralen Wirkstoffen, die auf bestimmte Schritte des viralen Eintritts in Wirtszellen und der Fusion mit dem Endosom abzielen. Die Zellen werden bei niedriger Temperatur inkubiert und dann mit HCV infiziert. Die niedrige Temperatur ermöglicht die Bindung des Virus an Wirtszellen, hemmt aber die Internalisierung über die Endozytose. Die antivirale Testverbindung wird zugegeben, und die Zellen werden bei physiologischer Temperatur inkubiert.

Ein Assay zur Bewertung der Wirkung von Testverbindungen auf den Eintritt und die Fusion von Viren in Wirtszellen

Hier haben wir eine neu entwickelte Hepatitis B-Virus (HBV) Reportersystem beschreiben, die frühen Stadien des HBV-Lebenszyklus zu überwachen. Dieses in vitro System vereinfacht wird in das Screening von anti-HBV - Agenten unterstützen , eine Hochdurchsatz - Strategie.

Entwicklung eines Systems Hepatitis-B-Virus Reporter den frühen Stadien des Replikationszyklus zu überwachen

Lipidtröpfchen sind wichtige Organellen für die Replikation von mehreren Erregern, einschließlich der Hepatitis C-Virus (HCV). Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Lipidtröpfchen-Massenspektrometrie assoziierter Proteine ​​zu isolieren; es kann unter einer Vielzahl von Bedingungen, wie zum Beispiel Virusinfektion, Umweltstress, oder medikamentöse Behandlung verwendet werden.

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Wir beschreiben hier die in-vitro- Erzeugung von HBV-DNA über eine Hepatitis B-Virus-Infektion-System und die hochempfindliche Erkennung seiner (1 – 2 Kopien)-Integration mit Inverse nested PCR.

Erkennung von niedrigen Kopie Nummer integrierte virale DNA gebildet durch In-vitro- Hepatitis B-Infektion

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine schrittweise Anleitung zur 3-d "Leber-on-a-Chip" Infektion mit dem Hepatitis B-Virus Experimente zur Verfügung stellen.

"Leber-on-a-Chip" Kulturen der primäre Hepatozyten und Kupffer Zellen für Hepatitis B-Virus-Infektion

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Einführung einer kontrollierbaren genetischen Vielfalt in das Genom des Hepatitis-C-Virus durch die Kombination von mutierter RNA-Synthese in voller Länge mit fehleranfälliger PCR und umgekehrter Genetik. Die Methode stellt ein Modell für die Phänotypauswahl dar und kann für 10 kb lange RNA-Virusgenome verwendet werden.

Reverse Genetik zur Entwicklung von RNA-Virusvarianten mit positivem Sinn

Erfahren Sie die Analyse der Hepatitis-C-Virus-Replikation mittels RNA-Transkription, Zelltransfektion und virologischer Assays. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung viraler Replikationszyklen für therapeutische Entwicklungen.

Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Weitere Videos entdecken