Name: Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Analyse der Hepatitis-C-Virus-Replikation mittels RNA-Transkription, Zelltransfektion und virologischer Assays. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung viraler Replikationszyklen für therapeutische Entwicklungen.

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Wir danken F. Chisari für die Bereitstellung der Huh-7.5.1-Zelllinie. Wir danken Justine Ho für die Bearbeitung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch den Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award und das National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A. unterstützt.

Ein allgemeiner Überblick über das Protokoll ist in Fig. 1 dargestellt. 1. Cells <ol><li> Vorbereitung vollständige Wachstumsmedium, das 10-15% fötalem Rinderserum (FBS), 10 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 10 mM Hepes, Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin (100 mg / ml) und 2 mM L-Glutamin enthält. </li><li> Pflegen Huh-7.5.1-Zellen in 13 komplette Wachstumsmedium, das die oben genannten Ergänzungen für in-vitro-Analyse von Hepatitis-C-Virusreplikationszyklus. </li><li> Kultur Virusstämme in Huh-7.5.1-Zellen mit den angegebenen Wachstumsmedium ergänzt bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol> 2. Viren und Plasmid-Konstrukte <ol><li> Erzeugen, die komplementäre DNA (cDNA)-Form von HCV-RNA und klonen in einen Plasmidvektor für einfache genetische Manipulation. Hinweis: Die Entdeckung der japanischen fulminante Hepatitis 1, JFH-1 (HCV Genotyp 2a), Isolat HCV kritisch für Forschung gewesen undin erster Linie verwendet, um die HCV-Replikationszyklus 11-13 studieren. Inter-und intragenotypic chimären Viren basierend auf JFH-1 HCV sind häufig in Forschungs 14-18 verwendet. Konstruktion von synthetischen intragenotype 2a chimären Virus, FNX-HCV und einem monocistronischen chimären Reporterstamm wurde zuvor 19 und konstruktive Details sind nicht Gegenstand dieses Protokolls beschrieben. </li><li> Verwenden Sie die pFNX-HCV intragenotype 2a Virus als es enthält eine 5&#39;-NTR-, Struktur-Regionen und P7, und ein Teil der NS2 nicht-strukturellen Regionen (Nukleotide 1-2878) des J6CF Elternstamm (NCBI Zugangsnummer. AF177036), als sowie die nicht-strukturellen Komponenten des JFH-1-Virusstamm (NCBI Zugangsnummer. AB047639). Hinweis: FNX-HCV wurde basierend auf der Sequenz von Jc1 intragenotype 2a chimären HCV synthetisiert zuvor berichtet 15. </li><li> Generieren Sie eine monocistronischen chimären Reporter virales Konstrukt, das pFNX-Rluc, auf der Grundlage der pFNX-HCV-Stamm (oben in Schritt 2.2), indem Sie einen Renilla Luciferase-Gen zwischen der 5 &#39;NTR und Core-Gen (nt zwischen 388 und 389). Anschließend verbinden Sie das Luciferase-Gen-Gen-und Kern dieses Konstrukts mit einem Maul-und Klauenseuche-Virus 2A (F2A) Peptidsequenz, die als Spaltsignal funktionieren würde. </li><li> Ingenieur die RNA-Polymerase-Null (Pol-) virales Konstrukt entweder mit dem pFNX-HCV oder pFNX-Rluc viralen Hintergrund. Ersetzen die katalytischen Reste NS5B Polymerase GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), der eine dieser viralen Rückgrat mit AAG Aminosäureresten. </li></ol> 3. In-vitro-HCV-RNA-Transkription <ol><li> Verwenden Sie ein intragenotype 2a chimären Virus FNX-HCV und HCV-FNX Pol null (Pol-) HCV für die Bewertung der viralen Replikation (Abbildung 2A). </li><li> Linearisieren die viralen Plasmide mit XbaI Restriktionsenzym und dann mit Mungobohnennuclease um glatte Enden zu erzeugen behandeln. Reinigung der verdauten Plasmide durch Anionenaustauschchromatographie. Überprüfen Sie die Integrität of Das linearisierte Plasmid indem DNA-Gelelektrophorese (Fig. 2B) Agarose. </li><li> Übertragen Sie die linearisierte Plasmide mit Hilfe der viralen T7-RNA-Polymerase. </li><li> Reinige den neu synthetisierten DNase behandelte RNA unter Verwendung eines RNA-Reinigungs-Kits. </li><li> Überprüfen Sie, ob die RNA-Produktion durch Agarose-Gelelektrophorese (Abbildung 2C). </li><li> Quantifizierung der RNA durch Spektrophotometrie. </li><li> Lagern Sie den erzeugten RNA in -80 ° C in 10 ug Arbeits Aliquots. Hinweis: Um die Veränderung der RNA-Qualität innerhalb der einzelnen Versuchsplanung zu minimieren durch Transkription aller RNA für jede Virusprobe und Kontrolle zugleich. </li></ol> 4. HCV-RNA-Transfektion und Probenentnahme <ol><li> Ernten Sie die Huh-7.5.1-Zellen mit Trypsin. </li><li> Um Zellen, Zentrifuge spülen und resuspendieren Suspension zweimal mit kaltem niedrigen Serum-Medien. Resuspendieren der Zellen in Medien mit niedrigem Serumgehalt 1 x 10 7 Zellen pro ml beträgt. </li><li> Mischen Sie insgesamt 10 &amp; #956; g transkribierte Virus-RNA mit 400 ul der resuspendierten Zellen (4 × 10 6 Zellen) in einer 0,4-cm-Elektroporationsküvette transferiert. Transfektion von Zellen mittels Elektroporation bei 270 V, 100 Ω und 950 uF. </li><li> Resuspendieren der Elektroporation Zellen in 10 ml Vollwachstumsmedium mit 15% FBS. Hinweis: Erhöhte Überlebensfähigkeit von Zellen elektroporiert wird gesehen, wenn die Huh-7.5.1-Zellen wurden in 15% fötalem Rinderserum kultiviert. </li><li> Platte, die Zellen in beiden T-25-Kolben (~ 1,2 × 10 6 Zellen pro Kolben) und 48-Well-Platten (1 × 10 4 Zellen pro Vertiefung) für jede der folgenden Zeitpunkten: 4, 48 und 96 Stunden. </li><li> Ersetzen Sie die Medien bei 4-8 Stunden nach der Transfektion mit frischem ergänzten Wachstumsmedium mit 10% FBS, um abgestorbene Zellreste aus den kultivierten Flaschen und Platten entfernen. </li><li> Erntezellkulturüberständen an den 48, 96 h Zeitpunkte und Entfernen von Zelltrümmern von gesammelten Proben durch Zentrifugation der Zellen bei 1500 UpM für 10 min bei 4 º C. </li><li> Bewahren Sie die zellfreien Überstände bei -80 º C. Lyse der Zellen, die für Protein-und RNA-Analyse durch Western-Blot und Reverse Transkription-PCR quantitativ zu den angegebenen Zeitpunkten. </li></ol> 5. Reverse Transkription-quantitative PCR (RT-qPCR) für die Beurteilung der HCV-Genom-Kopien <ol><li> Führen eine Zwei-Schritt-RT-qPCR die genomische HCV-RNA Kopienzahl zu bestimmen. </li><li> Revers transkribieren 1 ug zelluläre Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase und eines Primers spezifisch für HCV-sense-Strang, der 5 &#39;NTR (JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3&#39;) bindet, oder ein Primer, die spezifisch für Haushaltsgens Peptidylprolyl Isomerase G (R ppig : 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 &#39;). Auch Reverse Transkription FNX-HCV-RNA (in Schritt 3 erzeugte) bekannter Genomkopien (10. Januar-10. September Standard) mit HCV-Sense-Strang Primer. </li><li> Führen Sie qPCR unter Verwendung von 50 ng der resultierenden cDNA transkribiert mit spezifischen HCV-Primer (JFH RTQF: 5&#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;) und DNA-Bindung grüne Farbstoff, der qPCR Super-Mix. Führen qPCR für Housekeeping-Gen sowie ppig (ppig Primer F: 5&#39;-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 &#39;; ppig R: 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3&#39;) Anmerkung: Für die Berechnung der genauen intrazellulären HCV-RNA-Ebene über die Stichproben verwenden zellulären Housekeeping-Gen, ppig , Expressionsniveau (Ct-Zyklus) für die Normalisierung. Verwenden Sie die Kopienzahl des FNX-HCV-Genom als Standard für die Bestimmung der Kopienzahl. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Bedingungen bei der Ausführung von qPCR auf HCV-RNA-Kopienzahl zu bestimmen: 95 ° C für 15 Sekunden und 60 &#160; º C für 30 Sekunden (40 Zyklen) mit Echtzeit-PCR-System. </li><li> Siehe Fig. 3A und 3B für die Genomreplikation Ergebnisse. </li></ol> 6. Western Blot-Analyse zum Nachweis von HCV-Protein-Expression (Fig. 3C) <ol><li> Verwenden Zelllysate from Virus-RNA bei 96 Stunden nach der Transfektion für Protein-Western-Blot-Analyse transfiziert. </li><li> Lösen das Zelllysat unter Verwendung von SDS-PAGE und Transfer auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran. </li><li> Blockieren der Membran mit einer Blockierungslösung, enthaltend 5% Magermilch, 0,2% Tween 20 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). </li><li> Inkubation der Membran mit primären monoklonalen Maus-Antikörper NS3 (1 von 1.000 Verdünnung) und beta-Aktin (1 in 5000 Verdünnung). </li><li> Hinzufügen Ziege-anti-Maus-IgG, das mit Meerrettich-Peroxidase (1 in 5.000 verdünnt) konjugiert und durch Chemolumineszenz nachzuweisen. </li></ol> 7. Immunfluoreszenz-Assay (IFA) <ol><li> Beheben die HCV-infizierten und transfizierten Zellen unter Verwendung von Methanol für 30 min bei -20 º C für Immunfluoreszenz-Assay. </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und Block mit IFA Blockierungspuffer. </li><li> Verwenden polyklonalen Kaninchen anti-NS5A in erster Linie Antikörper oder monoklonalen Maus-Anti-DSR (freundlicherweise von Dr. Dasgupta, UCLA Verfügung gestellt)NA J2 Antikörper bei einer Verdünnung von 1:200 (1 ug / ml) und Inkubation für 5 h bis über Nacht bei 4 º C. </li><li> Dreimal nach dem primären Antikörper Waschen der Zellen mit PBS. </li><li> Hinzufügen Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundär 488 polyklonalen Antikörper oder Ziege-anti-Maus-IgG-Sekundär 594 polyklonalen Antikörper in einer 1:1000 Verdünnung (1 ug / ml) und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen der Zellen mit PBS dreimal und Fleckenkerne mit Hoechst-Farbstoff und Ansicht mit Fluoreszenzmikroskop (Fig. 3D). </li></ol> 8. Mess Virus Titer <ol><li> Platte naiv Huh-7.5.1-Zellen bei etwa 3 x 10 3 Zellen / Well unter Verwendung eines 96-Well-Platte. Am nächsten Tag, führen das 10-fache serielle Verdünnungen der zellfreien Kulturüberstand von HCV-RNA-transfizierten Zellen mit Wachstumsmedium geerntet und in dreifacher Ausfertigung auf impfen Huh-7.5.1-Zellen. </li><li> Fix-Zellen bei 72 Stunden nach der Infektion mit Methanol (30 min bei -20 </sup&gt; º C) und immunostain für HCV NS5A-Protein, wie in Abschnitt 7 angegeben. </li><li> Verwenden Sie die höchste Verdünnung, die für die NS5A positive Foci zählen und berechnen die durchschnittliche Anzahl der Schwerpunkt Bildungseinheit (FFU) pro Milliliter. Siehe Abbildung 4 für die HCV-Titer. </li></ol> 9. Renilla Luciferase Reporter Assay für virale Genom-Replikation und Infektiosität <ol><li> Für die Beurteilung viralen Genomreplikation, Platte HCV-RNA-Elektroporation Huh-7.5.1-Zellen in dreifacher Ausfertigung in 48-Well-Platten (1 x 10 4 Zellen / well). </li><li> Lyse die Zellen mit 75 ul der passiven Lyse-Puffer an der 6 h, 48 h und 96 h nach der Transfektion. </li><li> Schaukeln Sie die Platten vorsichtig für 15 Minuten bei Raumtemperatur und bei -80 º C. </li><li> Zur Messung der Renilla-Luciferase-Enzymaktivität, die Protein-Lysat auftauen und Renilla-Luciferase-Assay-Reagenzien auf Raumtemperatur. </li><li> In 20 ul Proteinlysat pro Vertiefung einer 96-wel<html> l weiße Lumineszenz Platte und legen Sie die Platte in einem Luminometer. </li><li> Pipettieren von 100 ul Renilla Luciferase-Assay-Reagenz (Coelenterazin Substrat + Puffer) pro Vertiefung und nach einer 2 Sek. vor, lesen Verzögerung; integrieren, das emittierte Licht für 10 Sekunden. </li><li> Mittelwert und Standardabweichung für jede Probe aus den Luciferase-Werte der biologischen Triplikaten und unterziehen die Daten einer statistischen Analyse (Abbildung 5). </li><li> Zur Beurteilung Infektiosität inokulieren 500 ul zellfreier Überstand aus HCV-RNA-transfizierten Zellen für die angegebenen Zeitpunkten (48 h und 96 h) in dreifacher Ausfertigung in 48-Well-Platten auf naiven Huh-7.5.1-Zellen erhalten. </li><li> Ersetzen Sie die viralen Inokulum mit 500 ml frisches Medium pro Well nach 6 Stunden nach der Infektion. </li><li> Lyse der Zellen bei 48 Stunden nach der Infektion und nach Renilla-Luciferase-Assay, wie in Schritten von 8,2 bis 8,7 (Fig. 5) beschrieben. </li></ol>itel &quot;&gt; 10. Statistische Analyse <ol><li> Die Fehlerbalken in den Diagrammen zeigen die Standardabweichungen (SD). Die P-Werte wurden mit dem ungepaarten t-Test berechnet. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Darstellung beschreibt ein Verfahren zum Analysieren des Hepatitis-C-Virus-Replikationszyklus. HCV ist ein humanes Pathogen und die vorgeschriebene Biosafety-Protokoll müssen strikt eingehalten werden. Infektiöse HCV-Zellkultursysteme wurden zuvor 11-13,16,17 beschrieben. Es gibt nur wenige wichtige Punkte zu implementieren, wenn wir nach dem Protokoll dargestellt. Erstens, von hoher Bedeutung ist es, gute Qualität von intakten voller Länge viralen genomischen RNA für nachgeschaltete Studien. Die Eingan...

Hepatitis-C-Virus (HCV) verursacht Leberzirrhose und Leberkrebs. Es betrifft 170 Millionen Menschen weltweit mit 350.000 Menschen sterben jährlich 1-3. HCV ist ein positiver Strang-RNA-Virus mit einer Genomgröße von 9,6 kb. Das HCV-Genom als ein einzelnes Polyprotein von ca. 3000 Aminosäuren, das proteolytisch durch verschiedene zelluläre und virale Proteasen gespalten, in 10-Polypeptide translatiert wird. HCV-Virus ist der Prototyp der Gattung Hepacivirus und gehört zur Familie der Flaviviridae 4. Bei der Belichtung stellt chronischer HCV-Infektion in 80% der Individuen. Die Infektion ist meist asymptomatisch und rechtzeitige Diagnose kann die therapeutische Intervention zu Leber Verschlechterung verhindern können. Die derzeitige Behandlung nicht optimal sein und kein Impfstoff verfügbar ist 5,6. Die Ätiologie der Hepatitis C wurde erstmals 1989 7 beschrieben. Studieren HCV-Replikation ist wichtig für die Hepatitis-C-Impfstoff-und Behandlungsforschung, aber es warlang durch das Fehlen eines effizienten Viruskultursystem behindert. Ein molekularer Klon des HCV Infektions wurde gezeigt, bei Schimpansen auf intra-Impfung 8 sein. Anschließend wurden HCV subgenomische Replikon beschrieben, die das virale Genom-Replikation Stufe in einem Zellkultursystem erlaubt 9,10 sezieren. Entdeckung einer Genotyp HCV 2a isolieren JFH-1 (Japanese Fulminante Hepatitis-1), infizieren Zellkultur eröffnet neue Wege für die HCV-Replikation Forschungs 11-13. Genotyp 2a Stamm JFH-1-Basis inter-und intra-und genotypische chimären Viren vom Genotyp 1 HCV Infektions basierend Kultursysteme sind auch 14 bis 18 erhältlich. Wir haben erfolgreich JFH-1-Stamm-und HCV-intragenotype 2a chimären Virus verwendet, um die hochauflösenden funktionellen Profilierung Karte von Proteindomänen und cis-aktiven RNA-Elemente 19,20 zu erhalten. Demnach beschreiben wir eine effektive Kultursystem routinemäßig verwendet, die ermöglichtStudium der verschiedenen Stadien des HCV-Replikationszyklus und Wirt-Pathogen-Interaktion. Wir präsentieren virologische Untersuchungen auf virale Genom-Replikation und de novo Infektiosität von HCV intragenotype 2a und einem Renilla-Luciferase Reporter basierend HCV beurteilen.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Nicht essentielle Aminosäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduziertes Serummedium, ohne Phenol Red</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7.5.1</td><td>Das Scripps Research Institute</td><td></td><td>Die Zelllinie wurde freundlicherweise von Dr. Francis Chisari Dr. Arumugaswami im Rahmen einer ausgeführten MTA zwischen dem Scripps Research Institute und dem Cedars-Sinai Medical Center zur Verfügung gestellt</td></tr>. <tr><td>Plasmide (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc und pFNX-Rluc Pol null)&nbsp;</td><td>Cedars-Sinai Medical Center</td><td></td><td>Die HCV-Plasmide wurden von Dr. Arumugaswami unter Verwendung von überlappenden Oligonukleotiden synthetisiert.</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Mungobohnen-Nuklease</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td> Nanodrop 2000 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsküvette (4 mm)</td><td>Bioexpress</td><td>E-5010-4</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Total System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>monoklonaler Anti-dsRNA-Antikörper für Mäuse J2&nbsp;</td><td>Deutsch & Wissenschaftliche Beratung Kft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Membran Paket</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0263</td><td></td></tr><tr><td>Blotting Grade Blocker Fettfreie Trockenmilch</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404XTU</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531XTU</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hepatitis C Virus NS3 Antikörper [8 G-2]</td><td>Abcam</td><td>ab65407</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hepatitis C Virus NS3 Antikörper [H23]</td><td>Abcam</td><td>ab13830</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL Prime Western Blotting-Detektionsreagenzien&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2236</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time-PCR-System</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Luciferase Assay System-Kit</td><td>Promega</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>RNase-freies DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>GloMax-Multi-Nachweissystem (Luminometer)</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein protokoll für die analyse von hepatitis-c-virus-replikation

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis-C-Virus (HCV) betrifft 3% der Weltbevölkerung und verursacht schwere Lebererkrankungen wie chronische Hepatitis, Leberzirrhose und Leberzellkarzinom. HCV ist ein umhülltes RNA-Virus aus der Familie Flaviviridae. Strombehandlung nicht wirksam ist und bewirkt, dass nachteilige Nebenwirkungen. Es gibt keine HCV-Impfstoff zur Verfügung. So wird fortgesetzt Aufwand für die Entwicklung eines Impfstoffes und eine bessere Therapie erforderlich. Einem HCV-Zellkultursystems ist kritisch für das Studium verschiedener Stadien der HCV Wachstum einschließlich Viruseintritt, Genom-Replikation, Verpackung und Austritt. In der vorgestellten aktuellen Prozedur verwendeten wir eine Wildtyp-intragenotype 2a chimären Virus, FNX-HCV, und ein rekombinantes FNX-Rluc Virus, eine Renilla-Luciferase-Reportergens um die Virusreplikation zu studieren. Eine menschliche Hepatom-Zelllinie (Huh-7-Basis) wurde für die Transfektion von in vitro transkribierten genomischen HCV-RNAs. Zellfreie Kulturüberstände, Protein-Lysate und total RNA wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Ernte Transfektion HCV Wachstum zu beurteilen. HCV-Genom-Replikation Status wurde durch quantitative RT-PCR und Visualisierung der Gegenwart von HCV-RNA-Doppelstrang ausgewertet. Die HCV-Proteinexpression wurde durch Western-Blot und Immunfluoreszenz unter Verwendung von für HCV-NS3-und NS5A-Proteine ​​Antikörper verifiziert. HCV-RNA-transfizierten Zellen freigesetzt infektiöse Partikel in Kulturüberstand und der Virustiter wurde bestimmt. Luciferase-Assays wurden verwendet, um die Replikationsebene und Infektiosität von HCV-Reporter beurteilen. Zusammenfassend stellen wir verschiedene virologische Tests zur Charakterisierung von verschiedenen Stufen des HCV-Replikationszyklus.

Hepatitis C-Virus ist ein RNA-Virus ist. Somit zur genetischen Manipulation Zweck hat die genomische HCV-cDNA in einen bakteriellen Plasmid-Vektor kloniert. Ein T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz wurde unmittelbar vor dem 5&#39;-Ende des HCV-Genoms eingeführt. Eine allgemeine Übersicht der HCV-Analyse-Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. Um genomische HCV-RNA mit präziser 3-Ende erzeugen, wird das HCV-Genom-Plasmid, das mit XbaI Restriktionsenzym und die erzeugte Einzelstrangüberhang wurde m...

Hepatitis-C-Virus (HCV) ist ein wichtiger menschlicher Krankheitserreger, der Lebererkrankungen, einschließlich Leberzirrhose und Krebs, verursacht. Ein HCV-infektiöses Zellkultursystem ist essentiell, um den molekularen Mechanismus der HCV-Replikation zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung verschiedener Stadien des HCV-Replikationszyklus.

Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, verschiedene Stadien des Replikationszyklus des Hepatitis-C-Virus zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst genomische HCV-RNA-Transkripte aus linearisierten HCV-Plasmidkonstrukten erzeugt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mit HCV-RNA zu transfectieren. Anschließend werden die Zellen für verschiedene Zeitpunkte und Assays ausplattiert. Im letzten Schritt wird das Zellkulturüberstand zur Bestimmung der viralen Titer gesammelt und die transfizierten Zellen zur Gewinnung von Protein und RNA geerntet. Letztendlich werden Reverse-Transkriptase-PCR, Western Blot, Immunfluoreszenz-Assay und die HCV-Titerbestimmung durchgeführt, um ein robustes infektiöses HCV-Zellkultursystem nachzuweisen.Der Hauptvorteil dieses infektiösen Hepatitis-C-Virus-Zellkultursystems gegenüber dem HCV-Genomreplikonsystem liegt darin, dass die Schritte Virus-Eintritt, Virionen-Assembly und -Ausschleusung untersucht werden können. Dieses Protokoll kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Hepatitis-C-Virologie zu beantworten, wie beispielsweise die Virion-Morphogenese und die Interaktion zwischen Wirt und Pathogen. Die Bedeutu

a-protocol-for-analyzing-hepatitis-c-virus-replication

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben zwei Methoden für die...

Zwei Methoden der Heterokaryon Formation zu entdecken HCV Restriktionsfaktoren

Source: Allaire, A., et al. Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the procedure for preparing cells to assess the intracellular uptake and activity of an antiviral agent against the hepatitis C virus.

Preparing Cells to Analyze Intracellular Uptake and Activity of an Antiviral Agent

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates the procedure for quantifying Hepatitis C viral RNA using quantitative reverse transcription PCR to measure viral load in infected cell cultures.

Measuring Hepatitis C Viral Load Using Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

Quelle: Ren, S., et al. Ein Protokoll zur Analyse der Replikation des Hepatitis-C-Virus. J. Vis. Exp. (2014)Dieses Video demonstriert den Fluoreszenz-Fokus-Assay, der zur Quantifizierung infektiöser Hepatitis-C-Viren in Zellkultur verwendet wird. Es zeigt die serielle Verdünnung des viralen Überstandes, die Infektion von Hepatomzellen und den Nachweis von Virusreplikationsstellen mittels antikörperbasierter Fluoreszenzmikroskopie.

Quantifizierung des infektiösen Hepatitis-C-Virus mittels Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Video zeigt einen viralen Attachment-Assay zum Screening antiviraler Verbindungen. Unter Verwendung von genetisch veränderten Hepatitis-C-Viren und Luciferase werden inhibitorische Effekte auf die Virusanheftung bewertet, was sich in einer geringeren Lichtintensität in gleichzeitig behandelten Vertiefungen im Vergleich zu Vertiefungen, die nur mit dem Virus behandelt wurden, zeigt.

Ein Virus-Attachment-Assay für das Screening von antiviralen Verbindungen

Hier haben wir eine neu entwickelte Hepatitis B-Virus (HBV) Reportersystem beschreiben, die frühen Stadien des HBV-Lebenszyklus zu überwachen. Dieses in vitro System vereinfacht wird in das Screening von anti-HBV - Agenten unterstützen , eine Hochdurchsatz - Strategie.

Entwicklung eines Systems Hepatitis-B-Virus Reporter den frühen Stadien des Replikationszyklus zu überwachen

Lipidtröpfchen sind wichtige Organellen für die Replikation von mehreren Erregern, einschließlich der Hepatitis C-Virus (HCV). Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Lipidtröpfchen-Massenspektrometrie assoziierter Proteine ​​zu isolieren; es kann unter einer Vielzahl von Bedingungen, wie zum Beispiel Virusinfektion, Umweltstress, oder medikamentöse Behandlung verwendet werden.

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Wir beschreiben hier die in-vitro- Erzeugung von HBV-DNA über eine Hepatitis B-Virus-Infektion-System und die hochempfindliche Erkennung seiner (1 – 2 Kopien)-Integration mit Inverse nested PCR.

Erkennung von niedrigen Kopie Nummer integrierte virale DNA gebildet durch In-vitro- Hepatitis B-Infektion

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine schrittweise Anleitung zur 3-d "Leber-on-a-Chip" Infektion mit dem Hepatitis B-Virus Experimente zur Verfügung stellen.

"Leber-on-a-Chip" Kulturen der primäre Hepatozyten und Kupffer Zellen für Hepatitis B-Virus-Infektion

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Einführung einer kontrollierbaren genetischen Vielfalt in das Genom des Hepatitis-C-Virus durch die Kombination von mutierter RNA-Synthese in voller Länge mit fehleranfälliger PCR und umgekehrter Genetik. Die Methode stellt ein Modell für die Phänotypauswahl dar und kann für 10 kb lange RNA-Virusgenome verwendet werden.

Reverse Genetik zur Entwicklung von RNA-Virusvarianten mit positivem Sinn

Erfahren Sie die Analyse der Hepatitis-C-Virus-Replikation mittels RNA-Transkription, Zelltransfektion und virologischer Assays. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung viraler Replikationszyklen für therapeutische Entwicklungen.

Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

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